本發(fā)明屬于高分子材料領(lǐng)域，涉及一種具有靶向功能仿病毒結(jié)構(gòu)高分子囊泡及其制備方法，具體涉及一種由透明質(zhì)酸接枝的兩親性嵌段共聚物與其他兩親性嵌段共聚物混合自組裝成具有仿病毒表面突觸結(jié)構(gòu)的高分子囊泡及其制備方法與應(yīng)用。

技術(shù)背景

惡性腫瘤是一種是危害人類生命健康的嚴(yán)重疾病，其防治仍依然是當(dāng)今生命科學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)難點(diǎn)。常規(guī)的化學(xué)療法是一種全身性的療法，在相關(guān)治療手段中是首選，適用于大部分實(shí)體腫瘤或血液腫瘤。然而，已知的化療藥物仍普遍存在毒性強(qiáng)、對(duì)腫瘤靶向識(shí)別性差的問(wèn)題，在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也對(duì)人體正常組織細(xì)胞造成很大的傷害。長(zhǎng)期治療更會(huì)致使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，對(duì)人體的毒副作用很大等缺點(diǎn)。因此，如何選擇性地殺死腫瘤細(xì)胞而不造成機(jī)體正常組織細(xì)胞損傷成為治療的關(guān)鍵問(wèn)題。選擇性或針對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行靶向治療是解決此關(guān)鍵問(wèn)題的首選途徑。在自然界中，病毒是一種具有靶向性的基因載體，其主要由核酸分子和蛋白構(gòu)成的外衣殼組成。病毒衣殼能屏蔽環(huán)境中的潛在破壞因素，如核酸酶、酸堿度等，具有保護(hù)基因遺傳物質(zhì)的功能，同時(shí)直接參與病毒的感染過(guò)程，實(shí)現(xiàn)對(duì)宿主細(xì)胞表面的特異性吸附。受病毒結(jié)構(gòu)和功能的啟示，科學(xué)家們一直在不斷嘗試各種人工仿病毒結(jié)構(gòu)和功能的自組裝聚集體用于藥物控釋和靶向治療的藥物載體，其中以高分子囊泡最為典型。高分子囊泡是一類由雙親性嵌段共聚物有序組合而成的中空球體，其球體的外殼膜層由雙親性分子構(gòu)成，而內(nèi)部親水空腔可以用于包裹藥物。高分子囊泡膜結(jié)構(gòu)可分為三層：兩個(gè)內(nèi)外側(cè)的親水層和一個(gè)處于內(nèi)外親水層中間的疏水層，疏水層由于內(nèi)外表面的親水層保持穩(wěn)定。通常，高分子囊泡是由單一種類的兩親性嵌段共聚物自組裝而成，其囊泡表面呈“光滑”狀態(tài)。而本發(fā)明通過(guò)兩種及以上嵌段共聚物制備的仿病毒核衣殼及表面刺突結(jié)構(gòu)的高分子囊泡是一種非常具有潛力的藥物載體。高分子囊泡可通過(guò)“特洛伊木馬”策略包載基因、藥物，并避免其中體內(nèi)循環(huán)中被免疫系統(tǒng)辨識(shí)、吞噬。此外，通過(guò)嵌段共聚物設(shè)計(jì)與合成，如對(duì)進(jìn)行功能基團(tuán)接枝修飾，可使高分子囊泡表面帶有特定功能性配體從而具有對(duì)特定細(xì)胞的靶向性。

目前，同時(shí)具有針對(duì)腫瘤細(xì)胞靶向功能以及仿病毒結(jié)構(gòu)高分子囊泡還未見(jiàn)有公開(kāi)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于獲得結(jié)構(gòu)與功能上仿病毒結(jié)構(gòu)，同時(shí)賦予高分子囊泡靶向腫瘤細(xì)胞功能的需求，本發(fā)明的目的在于提供一種含有透明質(zhì)酸接枝嵌段共聚物構(gòu)建的具有腫瘤細(xì)胞靶向功能及仿病毒結(jié)構(gòu)的高分子囊泡的制備方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供由上述方法得到的具有靶向功能仿病毒結(jié)構(gòu)高分子囊泡。

本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種具有靶向功能仿病毒結(jié)構(gòu)高分子囊泡的制備方法，具體包括以下步驟：

s1：將含有氨基的透明質(zhì)酸(ha)與含有羧基的疏水性聚合物進(jìn)行酰胺反應(yīng)，得到透明質(zhì)酸(ha)接枝的兩親性嵌段共聚物；所述含有羧基的疏水性聚合物在反應(yīng)之前需進(jìn)行羧基活化處理；

s2：將透明質(zhì)酸ha接枝的兩親性嵌段共聚物與其他兩親性嵌段共聚物通過(guò)溶劑交換法或水合法制備成具有靶向功能仿病毒結(jié)構(gòu)高分子囊泡。

步驟s1中所述含有氨基的透明質(zhì)酸是通過(guò)二元胺與透明質(zhì)酸反應(yīng)得到。所述二元胺的結(jié)構(gòu)為h2n-r-nh2，r為有機(jī)基團(tuán)；所述二元胺優(yōu)選為脂肪二元胺，更優(yōu)選為丁二胺。

步驟s1中所述含有氨基的透明質(zhì)酸的具體制備步驟為：

將透明質(zhì)酸溶于緩沖溶液中，加入二元胺，恒溫?cái)嚢?，加入還原劑反應(yīng)，反應(yīng)完成后透析，凍干，得到端氨基化透明質(zhì)酸即含有氨基的透明質(zhì)酸。

所述恒溫?cái)嚢璧臏囟葹?0～60℃，優(yōu)選為50℃；所述恒溫?cái)嚢璧臅r(shí)間為20～36h，優(yōu)選為24h；

所述二元胺優(yōu)選為1,4-丁二胺；所述還原劑為硼氰化鈉；

所述反應(yīng)的時(shí)間為2～4天，優(yōu)選為3天，所述還原劑分2～4次加入；

所述緩沖溶液優(yōu)選為醋酸鹽緩沖液。

所述透明質(zhì)酸ha和二元胺摩爾比為1:(1～5)，還原劑與透明質(zhì)酸質(zhì)量比為(1～3):5。

步驟s1中所述含有羧基的疏水性聚合物在反應(yīng)之前需進(jìn)行羧基活化處理，活化處理具體為：在有機(jī)溶劑中，采用活化劑將含有羧基的疏水性聚合物進(jìn)行羧基活化，得到羧基活化的產(chǎn)物；所述活化劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)與n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)。

所述羧基活化的時(shí)間為10～36h，優(yōu)選為24h。

所述含有羧基的疏水性聚合物、edc與nhs的摩爾比為(1～2.5):5:5；

所述含有羧基的疏水性聚合物進(jìn)行羧基活化后需進(jìn)行沉淀洗滌，干燥處理。

所述羧基活化完成后，反應(yīng)母液需進(jìn)行沉淀，所述沉淀劑為甲醇/乙醚(75/25v/v)混合溶劑。

步驟s1中所述含有氨基的透明質(zhì)酸與含有羧基的疏水性聚合物的摩爾比為1:1。

步驟s1中所述酰胺反應(yīng)需加入n,n-二異丙基胺或n,n-二異丙基乙胺，所述含有羧基的疏水性聚合物與n,n-二異丙基胺或n,n-二異丙基乙胺的摩爾比為1:(1.5～2)。

步驟s1中所述酰胺反應(yīng)以有機(jī)溶劑為反應(yīng)介質(zhì)，所述有機(jī)溶劑優(yōu)選為二甲基亞砜(dmso)。

步驟s1中所述酰胺反應(yīng)的溫度為40～60℃，優(yōu)選為50℃；酰胺反應(yīng)的時(shí)間為36～72h，優(yōu)選為48h。

步驟s1中所述酰胺反應(yīng)完成后，反應(yīng)液需透析，凍干處理，得到最終產(chǎn)物。

步驟s1中所述含有羧基的疏水性聚合物為端基為羧基的聚己內(nèi)酯(pcl)、端基為羧基的聚乳酸(pla)、端基為羧基的聚乙烯吡咯烷酮(pvp)中的一種；

步驟s2中所述其他兩親性嵌段共聚物為聚乙二醇-b-聚己內(nèi)酯(peg-b-pcl)、聚乙二醇-b-聚乳酸(peg-b-pla)、聚乙二醇-b-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(peg-b-plga)中的一種以上。

步驟s2中所述透明質(zhì)酸ha接枝的兩親性嵌段共聚物與其他兩親性嵌段共聚物的質(zhì)量比為1:(5～20)。

步驟s2中所述溶劑交換法為：將透明質(zhì)酸ha接枝的兩親性嵌段共聚物與其他兩親性嵌段共聚物溶于有機(jī)溶劑中，加入水或磷酸鹽緩沖液(pbs)，持續(xù)攪拌使有機(jī)溶劑完全揮發(fā)，得到高分子囊泡溶液；

步驟s2中所述水合法為：將透明質(zhì)酸ha接枝的兩親性嵌段共聚物與其他兩親性嵌段共聚物溶于有機(jī)溶劑中，完全溶解后，成膜；將膜與水或pbs緩沖液進(jìn)行攪拌，得到高分子囊泡溶液；攪拌的時(shí)間為2～5天；所述成膜為真空干燥成膜；

所述溶劑法中有機(jī)溶劑為四氫呋喃(thf)、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、n,n-二甲基乙酰胺(dmac)、二氯甲烷(dcm)、氯仿(chcl3)中的一種以上。

所述水合法中有機(jī)溶劑為四氫呋喃(thf)、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、n,n-二甲基乙酰胺(dmac)、二氯甲烷(dcm)、氯仿(chcl3)中的一種以上。

步驟s2中所述溶劑法或水合法制備具有靶向功能仿病毒結(jié)構(gòu)高分子囊泡時(shí)，所得高分子囊泡溶液需進(jìn)行純化分離。

所述純化分離的方法為透析法或液相色譜柱法中的一種以上。

所述液相色譜柱法進(jìn)行分離時(shí)，將高分子囊泡溶液從色譜柱上方加入，之后加入pbs緩沖液使高分子囊泡溶液按照尺寸大小在不同的淋出體積/保留時(shí)間從色譜柱下方分離出，按照所需尺寸收集。

步驟s2中所述具有靶向功能仿病毒結(jié)構(gòu)高分子囊泡的尺寸為50nm～400nm。

步驟s2中所述具有靶向功能仿病毒結(jié)構(gòu)高分子囊泡以溶液形式存在，其濃度為5mg/ml～30mg/ml，優(yōu)選為10mg/ml～20mg/ml。

所述具有靶向功能仿病毒結(jié)構(gòu)高分子囊泡通過(guò)上述方法得到。

所述具有靶向功能仿病毒結(jié)構(gòu)高分子囊泡用于藥物載體和/或制備治療腫瘤藥物。

本發(fā)明的透明質(zhì)酸(ha)是一種d-葡萄糖醛酸和n-乙酰-d-葡萄胺兩種單糖重復(fù)排列的直線性多糖。ha基團(tuán)能與腫瘤細(xì)胞中受體cd44配對(duì)，這種受體與ha相互作用，可調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的細(xì)胞行為?；趆a能與腫瘤細(xì)胞表面cd44特異性受體結(jié)合的特性，給予藥物載體輸送藥物的靶向性，引導(dǎo)藥物載體被腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞，從而提高藥物利用率，增強(qiáng)藥物療效。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)以及有益效果：

本發(fā)明采用具有透明質(zhì)酸基團(tuán)的嵌段共聚物與其他嵌段共聚物共混，通過(guò)水合法或溶劑法自組裝制備高分子囊泡；通過(guò)透明質(zhì)酸基團(tuán)的嵌段共聚物與其他嵌段共聚物的選用以及兩嵌段共聚共混比例的調(diào)控使得高分子囊泡具有仿病毒結(jié)構(gòu)，而嵌段共聚物中由于透明質(zhì)酸基團(tuán)的存在，使得高分子囊泡具有腫瘤細(xì)胞靶向性。總之，本發(fā)明的方法重復(fù)性好，所獲得高分子囊泡具有仿病毒結(jié)構(gòu)，同時(shí)其靶向性好，具有較好的應(yīng)用前景。本發(fā)明的方法易于獲得不同形貌和功能性的高分子囊泡，并應(yīng)用于藥物釋放等多種領(lǐng)域。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1制備的ha接枝的兩親性嵌段共聚物的¹h-nmr核磁氫譜圖

圖2為實(shí)施例1制備的高分子囊泡的透射電子顯微鏡圖(tem)，放大倍數(shù)為2萬(wàn)倍。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步解釋說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1

(1)將1.0g透明質(zhì)酸(mw＝5000，0.2mmol)溶于30ml的醋酸鹽緩沖液(ph＝5.6，醋酸/醋酸鈉)中，完全溶解后，加入1.0ml的1,4-丁二胺(0.4mmol)，50℃恒溫條件下，磁力攪拌24小時(shí)；之后在保持溫度攪拌條件不變的情況下，每天加入0.2g的硼氰化鈉，共三次，采用透析袋在去離子水中透析1天，將袋中物-20℃條件下冷凍干燥得到端氨基化透明質(zhì)酸；

(2)稱取1.0g的pcl-cooh(端羧基的pcl，mw＝10,000，0.1mmol)，溶于10ml的甲醇中，加入0.2mmol的edc與0.2mmol的nhs，室溫下攪拌24h，使用10ml甲醇/乙醚(75/25v/v)沉淀產(chǎn)物，70℃真空干燥3h，得到nhs/羧基活潑中間酯即羧基活化的產(chǎn)物；

(3)稱取總質(zhì)量為0.5g的端氨基化透明質(zhì)酸和nhs/羧基活潑中間酯(摩爾比為1:1)溶于20mldmso中，加入20μl的n,n-二異丙基胺(0.05mmol)，在50℃的條件下攪拌反應(yīng)48小時(shí)，采用透析袋在去離子水中透析1天，將袋中物在-20℃條件下冷凍干燥，得到ha接枝的兩親性嵌段共聚物，其¹h-nmr氫譜見(jiàn)圖1；

(4)稱取合成的ha接枝的兩親性嵌段共聚物和peg45-b-pla140混合物，總質(zhì)量為25mg，質(zhì)量比為1:10，完全溶解在2.5ml二氯甲烷中，加入5ml去離子水，充分?jǐn)嚢枋褂袡C(jī)溶劑揮發(fā)完全，后移入透析袋中，透析3天，得到平均直徑200nm的10mg/ml高分子囊泡溶液。所述高分子囊泡的透射電鏡圖如圖2所示，其中可見(jiàn)囊泡的直徑約200nm。

實(shí)施例2

(1)將2.0g透明質(zhì)酸(mw＝5,000，0.4mmol)溶于30ml醋酸鹽緩沖液(ph＝5.6，醋酸/醋酸鈉)中，完全溶解后，加入1.0ml的1,4-丁二胺(0.4mmol)，50℃恒溫條件下，磁力攪拌24小時(shí)；之后在保持溫度攪拌條件不變的情況下，每天加入0.2g的硼氰化鈉，共三次，采用透析袋在去離子水中透析1天，將袋中物-20℃條件下冷凍干燥，得到端氨基化透明質(zhì)酸；

(2)稱取1.0g的pcl-cooh(端羧基的pcl，mw＝10,000，0.1mmol)，溶于10ml的甲醇中，加入0.2mmol的edc與0.2mmol的nhs，室溫下攪拌24h，使用10ml甲醇/乙醚(75/25v/v)沉淀產(chǎn)物，70℃真空干燥3h，得到nhs/羧基活潑中間酯；

(3)稱取總質(zhì)量為0.5g的端氨基化透明質(zhì)酸和nhs/羧基活潑中間酯(摩爾比為1:1)溶于20mldmso中，加入20μl的n,n-二異丙基胺(0.05mmol)，在溫度50℃的條件下攪拌反應(yīng)48小時(shí)，透析1天處理后，-20℃條件下冷凍干燥得到ha接枝的兩親性嵌段共聚物；

(4)稱取合成的ha接枝的兩親性嵌段共聚物和peg45-b-pcl140總質(zhì)量為25mg，質(zhì)量比為1:15，完全溶解在2.5ml的thf中，向高分子溶液中加入5ml去離子水，充分?jǐn)嚢韬笠迫胪肝龃?，透?天，得到10mg/ml平均直徑150nm的高分子囊泡溶液。

實(shí)施例3

(1)將1.0g透明質(zhì)酸(mw＝5000，0.2mmol)溶于30ml醋酸鹽緩沖液(ph＝5.6，醋酸/醋酸鈉)中，完全溶解后，加入1.0ml的1,4-丁二胺(0.4mmol)，50℃恒溫條件下，磁力攪拌24小時(shí)；之后在保持溫度攪拌條件不變的情況下，每天加入0.2g的硼氰化鈉，共三次，采用透析袋在去離子水中透析1天，將袋中物在-20℃條件下冷凍干燥，得到端氨基化透明質(zhì)酸；

(2)稱取2.0g的pvp-cooh(端羧基的pvp，mw＝10,000，0.2mmol)，溶于10ml的甲醇中，加入0.4mmol的edc與0.4mmol的nhs，室溫下攪拌24h，使用10ml甲醇/乙醚(75/25v/v)沉淀產(chǎn)物，70℃真空干燥3h，得到nhs/羧基活潑中間酯；

(3)稱取總質(zhì)量為0.5g的端氨基化透明質(zhì)酸和nhs/羧基活潑中間酯(摩爾比為1:1)溶于20mldmso中，加入20μl的n,n-二異丙基胺(0.05mmol)，在溫度50℃的條件下攪拌反應(yīng)48小時(shí)，透析1天處理后，-20℃條件下冷凍干燥得到ha接枝的兩親性嵌段共聚物；

(4)稱取合成的ha接枝的兩親性嵌段共聚物和peg45-b-pla140總質(zhì)量為25mg，質(zhì)量比為1:15，完全溶解在2.5ml的thf中完全溶解，后經(jīng)真空中除盡有機(jī)溶劑成膜，之后添加去離子水，進(jìn)行磁力攪拌5天，通過(guò)液相色譜柱法純化分離，得到5mg/ml平均直徑250nm的高分子囊泡溶液。

實(shí)施例4

(1)將2.0g透明質(zhì)酸(mw＝5000，0.4mmol)溶于30ml醋酸鹽緩沖液(ph＝5.6，醋酸/醋酸鈉)中，完全溶解后，加入1.0ml的1,4-丁二胺(0.4mmol)，50℃恒溫條件下，磁力攪拌24小時(shí)；之后在保持溫度攪拌條件不變的情況下，每天加入0.1g的硼氰化鈉，共三次，采用透析袋在去離子水中透析1天，將袋中物-20℃條件下冷凍干燥，得到端氨基化透明質(zhì)酸；

(2)稱取2.0g的pla-cooh(端羧基的pla，mw＝10,000，0.2mmol)，溶于10ml的甲醇中，加入0.4mmol的edc與0.4mmol的nhs，室溫下攪拌24h，使用10ml甲醇/乙醚(75/25v/v)沉淀產(chǎn)物，70℃真空干燥3h，得到nhs/羧基活潑中間酯；

(3)稱取總質(zhì)量為0.5g的端氨基化透明質(zhì)酸和nhs/羧基活潑中間酯(摩爾比為1:1)溶于20mldmso中，加入20μl的n,n-二異丙基胺(0.05mmol)，在溫度50℃的條件下攪拌反應(yīng)48小時(shí)，透析1天處理后，-20℃條件下冷凍干燥得到ha接枝的兩親性嵌段共聚物；

(4)稱取合成的ha接枝的兩親性嵌段共聚物和peg45-b-pla140總質(zhì)量為25mg，質(zhì)量比為1:15，完全溶解在2.5ml的thf中完全溶解，后經(jīng)真空中除盡有機(jī)溶劑成膜，之后添加去離子水，進(jìn)行磁力攪拌2天，通過(guò)液相色譜柱法純化分離，得到5mg/ml平均直徑200nm的高分子囊泡溶液。

實(shí)施例5

(1)將1.0g透明質(zhì)酸(mw＝5000，0.2mmol)溶于30ml醋酸鹽緩沖液(ph＝5.6，醋酸/醋酸鈉)中，完全溶解后，加入1.0ml的1,4-丁二胺(0.4mmol)，50℃恒溫條件下，磁力攪拌24小時(shí)；之后在保持溫度攪拌條件不變的情況下，每天加入0.1g的硼氰化鈉，共三次，采用透析袋在去離子水中透析1天，將袋中物-20℃條件下冷凍干燥，得到端氨基化透明質(zhì)酸；

(2)稱取2.0g的pcl-cooh(端羧基的pcl，mw＝10,000，0.2mmol)，溶于10ml的甲醇中，加入0.2mmol的edc與0.2mmol的nhs，室溫下攪拌24h，使用10ml甲醇/乙醚(75/25v/v)沉淀產(chǎn)物，70℃真空干燥3h，得到得到nhs/羧基活潑中間酯；

(3)稱取總質(zhì)量0.5g稱取總質(zhì)量為0.5g的端氨基化透明質(zhì)酸和nhs/羧基活潑中間酯(摩爾比為1:2)溶于20mldmso中，加入20μl的n,n二異丙基胺(0.05mmol)，在溫度50℃的條件下攪拌反應(yīng)48小時(shí)，透析1天處理后，-20℃條件下經(jīng)冷凍干燥得到ha接枝的兩親性嵌段共聚物；

(4)稱取ha接枝的兩親性嵌段共聚物和peg45-b-plga100總質(zhì)量為30mg，質(zhì)量比為1:20，完全溶解在3ml的氯仿(chcl3)中，真空干燥箱中干燥除去有機(jī)溶劑，加入去離子水，磁力攪拌5天，透析3天，得到平均直徑300nm的30mg/ml高分子囊泡溶液。

實(shí)施例6

(1)將2.0g透明質(zhì)酸(mw＝5,000，0.4mmol)溶于30ml配制而成的醋酸鹽緩沖液(ph＝5.6，醋酸/醋酸鈉)中，完全溶解后，加入1.0ml的1,4-丁二胺(0.4mmol)，50℃恒溫條件下，磁力攪拌24小時(shí)；之后在保持溫度攪拌條件不變的情況下，每天加入0.1g的硼氰化鈉，共三次，采用透析袋在去離子水中透析1天，將袋中物-20℃條件下冷凍干燥，得到端氨基化透明質(zhì)酸；

(2)稱取1.5g的pvp-cooh(端羧基的pvp，mw＝10,000，0.15mmol)，溶于10ml的甲醇中，加入0.8mmol的edc與0.8mmol的nhs，室溫下攪拌24h，使用10ml甲醇/乙醚(75/25v/v)沉淀產(chǎn)物，70℃真空干燥3h，得到nhs/羧基活潑中間酯；

(3)稱取總質(zhì)量為0.5g的端氨基化透明質(zhì)酸和nhs/羧基活潑中間酯(摩爾比為1:1)溶于20mldmso中，加入20μl的n,n-二異丙基胺(0.04mmol)，在溫度50℃的條件下攪拌反應(yīng)48小時(shí)，透析1天處理后，-20℃條件下冷凍干燥得到ha接枝的兩親性嵌段共聚物；

(4)稱取合成的ha接枝的兩親性嵌段共聚物和peg45-b-pcl120質(zhì)量為30mg，質(zhì)量比為1:5，完全溶解在5ml的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中完全溶解，后經(jīng)真空中除盡有機(jī)溶劑成膜，之后添加去磷酸鹽緩沖液(pbs)，進(jìn)行磁力攪拌3天，通過(guò)液相色譜柱法純化分離，得到5mg/ml平均直徑50nm的高分子囊泡溶液。