本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種pk-15細(xì)胞培養(yǎng)液及其制備方法、使用方法。

背景技術(shù)：

pk-15細(xì)胞是pk-15a細(xì)胞的克隆系，在體外呈貼壁型生長，可連續(xù)傳代培養(yǎng)，用于多種病毒的增殖及特性的研究，在豬圓環(huán)細(xì)胞源疫苗研究中被廣泛使用。

豬圓環(huán)病毒（pcv-2）能夠引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、皮炎腎病、仔豬傳染性先天性震顫等多種疾病，pcv-2不僅可以引起豬的原發(fā)性感染，還能對(duì)畜體的免疫機(jī)能造成損傷，極易引起多種細(xì)菌或病毒的繼發(fā)感染，從而使預(yù)防和控制該病的難度越來越大，目前控制pcv-2主要通過使用疫苗進(jìn)行免疫防控。

隨著現(xiàn)代生物制品行業(yè)的不斷發(fā)展，對(duì)疫苗制造的安全性和有效性要求不斷提升，目前通常是在pk-15細(xì)胞培養(yǎng)基中添加含有5-10%的新生牛血清培養(yǎng)細(xì)胞，繁殖pcv-2制造豬圓環(huán)疫苗，但由于血清組分的復(fù)雜性和不確定性，以及其中存在病毒等病原微生物污染的潛在風(fēng)險(xiǎn)，影響著病毒疫苗的生產(chǎn)工藝和疫苗質(zhì)量，且血清使用成本較高、存在批次差異等諸多缺點(diǎn)，使血清在細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中的應(yīng)用受到限制。

由使用血清所帶來的諸多缺點(diǎn)，成為動(dòng)物細(xì)胞無血清培養(yǎng)技術(shù)研究和應(yīng)用的發(fā)展動(dòng)力，無血清培養(yǎng)液具有諸多優(yōu)勢(shì)：避免血清對(duì)細(xì)胞的毒性作用和血清源性污染；添加成分相對(duì)確定，可用于研究細(xì)胞生長、增殖、分化、簡(jiǎn)化下游目的產(chǎn)物的分離純化、節(jié)約成本；避免血清批次間的差異性等，因此無血清培養(yǎng)液受到人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種pk-15細(xì)胞培養(yǎng)液及其制備方法、使用方法的技術(shù)方案。

所述的一種pk-15細(xì)胞培養(yǎng)液，其特征在于每1000ml去離子水中含有以下重量的組分：dmem粉末9-12g、黃芪多糖2-10mg、葛根素10-50ug、白術(shù)內(nèi)酯ⅰ1-10mg、l-asp5-50mg、l-lys2-38mg、胰島素樣生長因子-i1-10ug、丙酮酸鈉10-40mg、青霉素5-10萬單位和鏈霉素5-20mg。

所述的一種pk-15細(xì)胞培養(yǎng)液，其特征在于每1000ml去離子水中含有以下重量的組分：dmem粉末10-11g、黃芪多糖4-8mg、葛根素20-40ug、白術(shù)內(nèi)酯ⅰ2-8mg、l-asp20-40mg、l-lys8-25mg、胰島素樣生長因子-i2-8ug、丙酮酸鈉20-30mg、青霉素6-8萬單位和鏈霉素8-12mg。

所述的一種pk-15細(xì)胞培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于將所述重量的組分充分混合，加入到盛有一定量的去離子水中，邊加邊攪拌，直至完全溶解，然后補(bǔ)去離子水定量1000ml，并經(jīng)過0.22um細(xì)菌濾器進(jìn)行過濾除菌，之后進(jìn)行分裝備用。

所述的一種pk-15細(xì)胞培養(yǎng)液的使用方法，其特征在于pk-15細(xì)胞通過含10%fbs的培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，依次降低血清濃度，分別通過8%、5%、2%fbs的培養(yǎng)培養(yǎng)，均按1:3進(jìn)行傳代，每種培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)3代，然后通過pk-15細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

所述的一種pk-15細(xì)胞培養(yǎng)液的使用方法，其特征在于pk-15細(xì)胞采用微載體懸浮培養(yǎng)方式進(jìn)行培養(yǎng)，按初始接種密度為1-4×10⁵個(gè)/ml的pk-15細(xì)胞接種于1-5l的生物反應(yīng)器中，微載體用量為2-8g/ml，控制溶氧飽和度在50%左右，攪拌速度為20-50r/min，ph控制在7.0-7.4之間，在溫度37℃環(huán)境下培養(yǎng)48-72h。

本發(fā)明中涉及的各個(gè)組分均為現(xiàn)有產(chǎn)品，均可在市場(chǎng)上購得。

本發(fā)明具有以下有益效果：

1、本發(fā)明所制備的pk-15細(xì)胞培養(yǎng)液，為無添加血清培養(yǎng)液，既可以大幅度降低生產(chǎn)成本，又保證疫苗的質(zhì)量和安全性。

2、本發(fā)明所制備的pk-15細(xì)胞培養(yǎng)液，可以大大提高細(xì)胞的生長速度。

3、本發(fā)明所制備的pk-15細(xì)胞培養(yǎng)液，可以提高pcv-2對(duì)pk-15細(xì)胞的感染敏感性，提高其病毒含量，從而還提高pcv疫苗的免疫原性。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。

實(shí)施例1：培養(yǎng)液的制備

dmem粉末：9g(購買于：sigma)

黃芪多糖：2mg(購買于：武漢福鑫化工有限公司)

葛根素：10ug(購買于：上海麥克林生化科技有限公司)

白術(shù)內(nèi)酯?。?mg(購買于：上海源葉生物科技有限公司)

l-asp：5mg(購買于：sigma)

l-lys：2mg(購買于：sigma)

胰島素樣生長因子-i(igf-ⅰ)：1ug(購買于：sigma)

丙酮酸鈉：10mg(購買于：廣東翁江化學(xué)試劑有限公司)

青霉素：5萬單位(購買于：sigma)

鏈霉素：5mg(購買于：sigma)

將以上各種成分充分混合，加入到盛有一定量的去離子水中，邊加邊攪拌，直至完全溶解，然后補(bǔ)去離子水定量1000ml，并經(jīng)過0.22um細(xì)菌濾器進(jìn)行過濾除菌，之后進(jìn)行分裝備用。

實(shí)施例2：培養(yǎng)液的制備

dmem粉末：10g(購買于：sigma)

黃芪多糖：4mg(購買于：武漢福鑫化工有限公司)

葛根素：20ug(購買于：上海麥克林生化科技有限公司)

白術(shù)內(nèi)酯ⅰ：2mg(購買于：上海源葉生物科技有限公司)

l-asp：20mg(購買于：sigma)

l-lys：8mg(購買于：sigma)

胰島素樣生長因子-i(igf-ⅰ)：2ug(購買于：sigma)

丙酮酸鈉：20mg(購買于：廣東翁江化學(xué)試劑有限公司)

青霉素：6萬單位(購買于：sigma)

鏈霉素：8mg(購買于：sigma)

將將以上各種成分充分混合，加入到盛有一定量的去離子水中，邊加邊攪拌，直至完全溶解，然后補(bǔ)去離子水定量1000ml，并經(jīng)過0.22um細(xì)菌濾器進(jìn)行過濾除菌，之后進(jìn)行分裝備用。

實(shí)施例3：培養(yǎng)液的制備

dmem粉末：12g(購買于：sigma)

黃芪多糖：10mg(購買于：武漢福鑫化工有限公司)

葛根素：50ug(購買于：上海麥克林生化科技有限公司)

白術(shù)內(nèi)酯ⅰ：10mg(購買于：上海源葉生物科技有限公司)

l-asp：50mg(購買于：sigma)

l-lys：38mg(購買于：sigma)

胰島素樣生長因子-i(igf-ⅰ)：10ug(購買于：sigma)

丙酮酸鈉：40mg(購買于：廣東翁江化學(xué)試劑有限公司)

青霉素：10萬單位(購買于：sigma)

鏈霉素：20mg(購買于：sigma)

將以上各種成分充分混合，加入到盛有一定量的去離子水中，邊加邊攪拌，直至完全溶解，然后補(bǔ)去離子水定容量1000ml，并經(jīng)過0.22um細(xì)菌濾器進(jìn)行過濾除菌，之后進(jìn)行分裝備用。

試驗(yàn)例本發(fā)明培養(yǎng)液的應(yīng)用

1材料

1.1pk-15細(xì)胞培養(yǎng)液

按本發(fā)明實(shí)施例1-3制得

1.2dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)液、胎牛血清購于gibco公司，

硫乙醇酸鹽培養(yǎng)液(tg)、胰酪蛋白胨培養(yǎng)液（tsb）購于北京中海生物科技有限公司

1.3pk-15細(xì)胞購于atcc，由浙江美保龍生物技術(shù)有限公司保存

1.4豬圓環(huán)病毒（pcv-2），購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所

1.5試驗(yàn)動(dòng)物28日齡健康斷奶仔豬60頭，檢測(cè)豬圓環(huán)病毒抗體、抗原雙陰性。

2方法

2.1培養(yǎng)液檢驗(yàn)

2.1.1無菌檢驗(yàn)

將實(shí)施例1-3制備的pk-15細(xì)胞培養(yǎng)液，各取3個(gè)不同批次進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，每個(gè)批次分別取1ml接種于2支50mltg大管中，1支置于35-37℃培養(yǎng)，1支置于23-25℃培養(yǎng)，3d后各吸取培養(yǎng)物分別接種于10個(gè)tg小管，再分別置于35-37℃和23-25℃培養(yǎng)，另外每個(gè)批次分別取0.2ml接種于tsb小管內(nèi)，置于23-25℃培養(yǎng)，同時(shí)做陰性對(duì)照，均培養(yǎng)7日，觀察結(jié)果。

2.1.2內(nèi)毒素測(cè)定

將實(shí)施例1-3制備的pk-15細(xì)胞培養(yǎng)液，各取3個(gè)不同批次進(jìn)行內(nèi)毒素檢驗(yàn)，每個(gè)批次分別取1.7ml用鱟試劑盒分別進(jìn)行檢測(cè)，用酶標(biāo)儀選擇波長405nm測(cè)其od值，同時(shí)做陰性對(duì)照。

2.2細(xì)胞馴化、培養(yǎng)及生長速度的測(cè)定

pk-15細(xì)胞首先通過含10%fbs的培養(yǎng)液培養(yǎng)，依次降低血清濃度，分別通過8%、5%、2%fbs的培養(yǎng)液培養(yǎng)，均按1:3進(jìn)行傳代，每種培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)3代，最后應(yīng)用本發(fā)明制備的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

在5個(gè)1l生物反應(yīng)器中分別加入80-120ml由實(shí)施例1-3制備的pk-15細(xì)胞培養(yǎng)液及含8%、10%fbs的完全培養(yǎng)液，按相同的初始接種密度：1-4×10⁵個(gè)/ml的pk-15細(xì)胞接種于1l的生物反應(yīng)器中，微載體用量為6g/ml，控制溶氧飽和度在50%左右，攪拌速度為30r/min，ph控制在7.0，在37℃環(huán)境下培養(yǎng)48-72h后，均勻吸取各懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)樣品，用cedexas-20細(xì)胞密度和活力自動(dòng)分析儀計(jì)數(shù)細(xì)胞密度和活力。

2.3病毒培養(yǎng)

用dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)液將pcv-2稀釋成2000tcid50/ml，分別接種到由2.2培養(yǎng)的5種pk-15細(xì)胞微載體培養(yǎng)物中，以30r/min的攪拌速度進(jìn)行攪拌，置于37℃下，培養(yǎng)72-90h后進(jìn)行收毒。

2.4tcid50測(cè)定

分別將由實(shí)施例1-3制備的pk-15細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞、含8%、10%fbs的dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞，均稀釋成1×10⁵～10⁶個(gè)/ml，按0.2ml/孔轉(zhuǎn)入96孔培養(yǎng)板中，置于37℃，5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，棄掉培養(yǎng)液上清，將2.3收獲的pcv-2分別用dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)液作連續(xù)10倍稀釋，按0.1ml/孔接種，置于37℃，5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d，棄取維持液，用pbs溶液洗3次，按100ul/孔加入800ml/l的冷丙酮溶液固定細(xì)胞30分鐘，棄去丙酮后，pbs溶液洗滌后按50ul/孔加1:300稀釋的pcv-2抗體，37℃作用1h；棄液，再進(jìn)行pbs溶液洗滌；按50ul/孔加1:100稀釋的pcv-2抗體，37℃作用1h；棄液，再進(jìn)行pbs溶液洗滌，置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，按reed-muench法計(jì)算tcid50。

2.5免疫原性測(cè)定

將2.3收獲的五種病毒液經(jīng)檢驗(yàn)合格，經(jīng)乳化滅活制成疫苗測(cè)定疫苗的免疫原性。將60頭28日齡斷奶仔豬共分為6組，每組10頭，第ⅰ組采用經(jīng)本發(fā)明實(shí)施例1制備的培養(yǎng)液，用于培養(yǎng)pk-15細(xì)胞繁殖pcv-2，經(jīng)乳化滅活后制成的疫苗，按照1ml/頭，進(jìn)行肌肉免疫接種；第ⅱ組采用經(jīng)本發(fā)明實(shí)施例2制備的培養(yǎng)液，用于培養(yǎng)pk-15細(xì)胞繁殖pcv-2，經(jīng)乳化滅活后制成的疫苗，按照1ml/頭，進(jìn)行肌肉免疫接種；第ⅲ組采用經(jīng)本發(fā)明實(shí)施例3制備的培養(yǎng)液，用于培養(yǎng)pk-15細(xì)胞繁殖pcv-2，經(jīng)乳化滅活后制成的疫苗，按照1ml/頭，進(jìn)行肌肉免疫接種；第ⅳ組采用含10%fbs培養(yǎng)液，用于培養(yǎng)pk-15細(xì)胞繁殖pcv-2，經(jīng)乳化滅活后制成的疫苗，按照1ml/頭，進(jìn)行肌肉免疫接種；第ⅴ組采用含8%fbs培養(yǎng)液，用于培養(yǎng)pk-15細(xì)胞繁殖pcv-2，經(jīng)乳化滅活后制成的疫苗，按照1ml/頭，進(jìn)行肌肉免疫接種。第ⅳ組，疫苗對(duì)照組，不進(jìn)行免疫。每組在免疫前及免疫后14d、35d、60d、90d、120d、150d、180d分別采血，分離血清，測(cè)定pcv-2的抗體滴度。

3結(jié)果

3.1檢驗(yàn)結(jié)果

表1無菌檢驗(yàn)結(jié)果

表2內(nèi)毒素檢驗(yàn)結(jié)果（405nm）

由表1、表2可以看出，由實(shí)施例1、2、3制備的不同批次的培養(yǎng)液均既無菌生長又不含內(nèi)毒素，該方法制備的培養(yǎng)液安全可靠。

3.2細(xì)胞密度及活力測(cè)定結(jié)果

表3細(xì)胞密度測(cè)定結(jié)果

由表3可以看出，由實(shí)施例1、2、3制備的培養(yǎng)液培養(yǎng)的pk-15細(xì)胞密度明顯大于含fbs培養(yǎng)液培養(yǎng)的pk-15細(xì)胞。

表4細(xì)胞活率測(cè)定結(jié)果

由表4可以看出，在相同的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，由實(shí)施例1、2、3制備的培養(yǎng)液培養(yǎng)的pk-15細(xì)胞存活率明顯大于由含fbs培養(yǎng)液培養(yǎng)的pk-15細(xì)胞。

3.3tcid50測(cè)定結(jié)果

表5tcid50測(cè)定結(jié)果

由表5可以看出，由實(shí)施例1、2、3制備的培養(yǎng)液添加劑培養(yǎng)的pk-15細(xì)胞比由含fbs培養(yǎng)液培養(yǎng)的pk-15細(xì)胞更有利于pcv-2的繁殖，敏感性更強(qiáng)。

3.4免疫原性測(cè)定結(jié)果

表6pcv-2的抗體水平測(cè)定結(jié)果

由表6可以看出，ⅰ、ⅱ、ⅲ組的抗體水平明顯高于ⅳ、ⅴ組，由實(shí)施例1、2、3制備的培養(yǎng)液培養(yǎng)的pcv-2的免疫原性高于含fbs培養(yǎng)液培養(yǎng)的pcv-2。

4結(jié)論

綜上所述，本發(fā)明所使用的pk-15細(xì)胞培養(yǎng)液，在可以大大提高細(xì)胞的生長速度的前提下，一方面能增強(qiáng)pcv-2對(duì)pk-15細(xì)胞的敏感性，提高病毒含量，另一方面，還可以增強(qiáng)pcv-2疫苗的免疫原性。