本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種新型抗菌肽dlp4的制備方法。

背景技術(shù)：

黑水虻抗菌肽dlp4是sungmoonyoe研究組以黑水虻(亮斑扁角水虻，hermetiaillucens)為原料，通過金黃色葡萄球菌(s.aureuskccm40881)進(jìn)行免疫刺激從而產(chǎn)生的高效抗g⁺菌活性抗菌肽?？咕膁lp4是含有95個(gè)氨基酸殘基的多肽序列，其中1～24位是信號(hào)肽序列，25～40位為前導(dǎo)肽序列，41～81位為成熟肽(dlp4)序列。dlp4理論分子量分別為4275.0da，dlp4具有2個(gè)組氨酸(his)、4個(gè)賴氨酸(lys)以及4個(gè)精氨酸(arg)，在不同ph環(huán)境中，由于組氨酸解離狀態(tài)不同，在不同ph環(huán)境中，由于組氨酸解離狀態(tài)不同，凈電荷數(shù)在+4到+6之間變化(soon-ikpark等，parksi,kimjw,yoesm.purificationandcharacterizationofanovelantibacterialpeptidefromblacksoldierfly(hermetiaillucens)larvae.[j].developmental&comparativeimmunology,2015,52(1):98-106.)。

抗菌肽替代傳統(tǒng)抗生素應(yīng)用于由細(xì)菌感染所引起的各種疾病一直備受科學(xué)界關(guān)注，也是人類對抗各種病原菌的有效武器?？咕目咕V過寬，穩(wěn)定性不好，具有細(xì)胞毒性，抗菌活性不足，用藥多樣性，生產(chǎn)成本高(基因克隆表達(dá)產(chǎn)量太低和化學(xué)合成成本過高)等一直是抗菌肽應(yīng)用中面臨的挑戰(zhàn)。目前，尚未見到有關(guān)于dlp4在畢赤酵母中進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供新型抗菌肽dlp4的制備方法。

本發(fā)明的另一目的是提供一種可高效分泌表達(dá)抗菌肽dlp4的重組酵母菌。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的新型抗菌肽dlp4的制備方法，包括以下步驟：

1)基因表達(dá)框的設(shè)計(jì)：對抗菌肽dlp4的編碼基因進(jìn)行酵母偏愛密碼子優(yōu)化，在優(yōu)化后的基因序列的5’端添加xhoi酶切位點(diǎn)和kex2切割位點(diǎn)，在3’端添加taa和tag終止子序列以及xbai酶切位點(diǎn)，所得基因表達(dá)框的核苷酸序列如seqidno:3所示；

2)重組酵母表達(dá)載體的構(gòu)建：將seqidno:3所示的基因經(jīng)xhoi和xbai雙酶切后，與經(jīng)過同樣雙酶切的ppiczαa載體連接，得到的重組酵母表達(dá)載體ppicdlp4；

3)重組酵母菌的制備：載體ppicdlp4經(jīng)線性化后轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母x-33，篩選出高水平表達(dá)抗菌肽dlp4的重組酵母菌；

4)抗菌肽dlp4的制備：對步驟3)中獲得的重組酵母菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，通過補(bǔ)加葡萄糖和甲醇誘導(dǎo)，獲得發(fā)酵液，離心收集上清，上清經(jīng)純化后即得抗菌肽dlp4。

前述的方法，步驟4)具體為：

①種子液制備：

挑取單菌落接種于ypd培養(yǎng)基中，28～30℃，250rpm振蕩培養(yǎng)18～24h；然后按1％的接種量，轉(zhuǎn)接至ypd培養(yǎng)基中，28～30℃，250rpm振蕩培養(yǎng)16～18h，od600達(dá)到4～6；然后，按10％接種量接到上罐培養(yǎng)基(含4.8‰pmt1)中，即200ml菌液+200ml45％葡萄糖+9.6mlpmt1，裝液量為2l/5l，于29℃，800rpm，ph5.0，po2>35％的條件下培養(yǎng)16-18h；

②添加葡萄糖生長階段：

觀測發(fā)酵液的溶氧值開始緩慢下降后突然上升，開始補(bǔ)加含12‰pmt1的50％葡萄糖溶液，添加時(shí)間6-8h，流速為30ml/l/h；

③甲醇過渡誘導(dǎo)：

添加葡萄糖6h后，饑餓1h，待葡萄糖耗盡后，開始補(bǔ)加含12‰pmt1的無水甲醇，補(bǔ)加過程中，流速由第1小時(shí)1ml/l/h逐漸增加到第6小時(shí)6ml/l/h，直至發(fā)酵結(jié)束；

④100％甲醇誘導(dǎo)階段：

甲醇過渡誘導(dǎo)6h后，開始100％甲醇連續(xù)誘導(dǎo)，流速為6ml/l/h；甲醇誘導(dǎo)開始后，每12h取樣，測定重組酵母菌分泌表達(dá)抗菌肽dlp4的水平。

前述的方法，步驟4)中采用陽離子交換層析對上清進(jìn)行純化。具體操作如下：

發(fā)酵液于4℃，12000rpm離心10min后取上清，將長度16mm、內(nèi)徑10mm的hiprepspff陽離子交換柱(gehealthcare)用a液平衡5-10個(gè)柱體積后上樣；進(jìn)樣完畢后，先用a液進(jìn)行洗脫，待穿透峰洗脫完后，用b液進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰。

洗脫步驟為：100％a液，洗脫5個(gè)柱體積，為穿透峰；40％a，60％b液，洗脫5個(gè)柱體積，為洗脫峰；利用uv215nm監(jiān)測洗脫情況，tricine-sds-page和檢測目標(biāo)產(chǎn)物純化情況。其中，所述a液為20mm，ph7.0的磷酸鹽洗脫緩沖液，所述b液為含有1mnacl的20mm，ph7.0的磷酸鹽洗脫緩沖液。

收集到的洗脫峰，經(jīng)1kda截留分子量透析袋4℃透析，每2h換水一次，換水6次；收集透析后的透析液，于-54℃，0.016mpa條件下進(jìn)行真空冷凍干燥，通過tricine-sdspage凝膠電泳檢測純化后的抗菌肽dlp4。

本發(fā)明還提供一種分泌表達(dá)抗菌肽dlp4的重組酵母菌，其構(gòu)建方法包括以下步驟：

1)對抗菌肽dlp4的編碼基因進(jìn)行酵母偏愛密碼子優(yōu)化，在優(yōu)化后的基因序列的5’端添加xhoi酶切位點(diǎn)和kex2切割位點(diǎn)，在3’端添加taa和tag終止子序列以及xbai酶切位點(diǎn)，所得基因表達(dá)框的核苷酸序列如seqidno:3所示；

2)將seqidno:3所示的基因經(jīng)xhoi和xbai雙酶切后，與經(jīng)過同樣雙酶切的ppiczαa載體連接，得到的重組酵母表達(dá)載體ppicdlp4；

3)載體ppicdlp4經(jīng)線性化后轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母x-33，即得分泌表達(dá)抗菌肽dlp4的重組酵母菌。

本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了利用構(gòu)建的重組酵母菌所分泌表達(dá)的抗菌肽dlp4，其對革蘭氏陽性細(xì)菌具有強(qiáng)烈殺傷作用。檢測了抗菌肽dlp4對不同來源金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)的抑制作用，發(fā)現(xiàn)對于青霉素敏感或抗性菌株，最小殺菌濃度(mic)在0.015-0.236μm之間，明顯優(yōu)于氨芐西林(ampicillin)(2.69-6.73μm)。另外，dlp4對豬鏈球菌(streptococcussuis)的mic值介于0.015和0.118μm之間，同樣優(yōu)于氨芐西林5倍左右。

本發(fā)明通過對編碼抗菌肽dlp4的基因進(jìn)行酵母偏愛密碼子優(yōu)化，構(gòu)建至ppiczαa載體上，首次實(shí)現(xiàn)其在畢赤酵母x-33中分泌表達(dá)。通過對酵母重組菌株進(jìn)行高密度誘導(dǎo)發(fā)酵，120h發(fā)酵后抗菌肽dlp2產(chǎn)量高達(dá)1600mg/l左右，可獲得純度高于90％的抗菌肽dlp4產(chǎn)品。采用本發(fā)明方法制備的抗菌肽dlp4可應(yīng)用于抗菌藥物、食品添加劑、化妝品、飼料添加劑等領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值和市場前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中dlp4的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物及質(zhì)粒載體ppiczαa提取電泳圖；其中，m1：dna分子量marker；m2：trans5kmarker；4：dlp4；5：ppiczαa。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中線性化重組載體電泳圖；其中，m:trans5kmarker；4：ppicdlp4線性化產(chǎn)物；5：陰性對照。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例4中dlp4發(fā)酵上清tricine-sds-page電泳圖；m：超低分子量蛋白marker；24-120h為5l發(fā)酵罐發(fā)酵上清。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例5中純化后dlp4的tricine-sds-page電泳圖；m：超低分子量蛋白marker；2：純化后的dlp4。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例6中測到的dlp4在24-120h發(fā)酵上清對staphylococcusaureusatcc25923以及atcc43300的抑菌圈。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例5中dlp4純化后的maldi-tofms分析結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

本發(fā)明中抗菌肽dlp4的氨基酸序列及其編碼基因的序列分別如seqidno:1和2所示。

以下實(shí)施例中使用的酶和試劑：限制性內(nèi)切酶、pfudna聚合酶、t4dna連接酶等分別購自biolabs、invitrogen和promega公司。四種dntp購自promega公司。dna和蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)為biolabs產(chǎn)品。其它常規(guī)試劑采用進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

以下實(shí)施例中涉及的培養(yǎng)基和緩沖液配方：

lb培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/l，酵母浸提取物5g/l，nacl10g/l；固體lb培養(yǎng)基則加入2％的瓊脂糖。

低鹽lb培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/l，酵母浸提取物5g/l，nacl5g/l；固體低鹽lb培養(yǎng)基則加入2％的瓊脂粉。

mh培養(yǎng)基：酪蛋白水解物17.5g/l，牛肉浸粉5g/l，淀粉1.5g/l。

mha培養(yǎng)基：固體mh培養(yǎng)基則加入2％的瓊脂粉。

ypd培養(yǎng)基：蛋白胨20g/l，酵母浸提取物10g/l，葡萄糖20g/l；固體ypd培養(yǎng)基則加入2％瓊脂粉。

ypds培養(yǎng)基：蛋白胨20g/l，酵母浸提取物10g/l，山梨醇182.2g/l，葡萄糖20g/l，瓊脂粉20g/l。

有關(guān)lb培養(yǎng)基、低鹽lb、mh、ypd、ypds等培養(yǎng)基的使用參照invitrogen畢赤酵母操作手冊。

20mm磷酸鹽緩沖液(a液)：3.1146gna2hpo4，1.7628gnah2po4，加去離子水至950ml，置于磁力攪拌器至完全溶解后調(diào)ph6.7，定容至1000ml。

1mnacl20mm磷酸鹽緩沖液(b液)：3.1146gna2hpo4，1.7628gnah2po4，58.44gnacl，加去離子水至950ml，置于磁力攪拌器至完全溶解后調(diào)ph6.7，定容至1000ml。

以下實(shí)施例中涉及的基因擴(kuò)增及轉(zhuǎn)化子鑒定方法為pcr法及dna測序法。

以下實(shí)施例中涉及的蛋白檢測方法為tricine-sds-page，參照(h.tricine–sds-page.natprotoc,2006,1(1):16-22)。

以下實(shí)施例中涉及的蛋白質(zhì)濃度測定方法為考馬斯亮藍(lán)法。

以下實(shí)施例中涉及的蛋白分子量的確定方法為maldi-tofms法。

以下實(shí)施例中涉及的蛋白純化的方法為基于離子層析法。

以下實(shí)施例中涉及的發(fā)酵方法為高密度發(fā)酵法。

以下實(shí)施例中涉及的菌種和質(zhì)粒見表1：

表1供試菌種和質(zhì)粒

實(shí)施例1dlp4表達(dá)序列的設(shè)計(jì)與基因合成

對抗菌肽dlp4的編碼基因進(jìn)行酵母偏愛密碼子優(yōu)化，在優(yōu)化后的基因序列的5’端添加xhoi酶切位點(diǎn)和kex2切割位點(diǎn)，在3’端添加taa和tag終止子序列以及xbai酶切位點(diǎn)，所得基因表達(dá)框的核苷酸序列如seqidno:3所示。以上序列由上海生工生物工程股份有限公司完成。

實(shí)施例2畢赤酵母aox啟動(dòng)子誘導(dǎo)型表達(dá)載體ppicdlp4的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶xhoi和xbai分別對合成的基因片段和載體ppiczaa進(jìn)行雙酶切，回收ppiczaa載體片段和突變體基因片段，連接，得到載體ppicdlp4。

載體ppicdlp4詳細(xì)構(gòu)建過程：利用限制性內(nèi)切酶xhoi和xbai分別對合成的基因片段和ppiczaa進(jìn)行雙酶切，酶切體系和條件如下：

以上酶切體系加樣完畢后于37℃反應(yīng)3小時(shí)，2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳條件：120v，30min。電泳完畢在紫外燈下利用手術(shù)刀分別切割載體片段與基因片段對應(yīng)電泳條帶并利用天根生物技術(shù)有限公司膠回收試劑盒進(jìn)行dna片段回收，按試劑盒提供說明書的相關(guān)細(xì)節(jié)進(jìn)行操作。

利用瓊脂糖凝膠電泳檢測回收片段并使用定量軟件(genetools)進(jìn)行初步定量，按照片段/載體(3:1)的摩爾比例使用t4dna連接酶進(jìn)行連接，體系和條件如下：

以上連接體系加樣完畢后于金屬浴22℃反應(yīng)2小時(shí)，轉(zhuǎn)化e.colidh5α。轉(zhuǎn)化操作細(xì)節(jié)如下：

1)連接產(chǎn)物加入100μle.colidh5α感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30min；

2)42℃熱激90s，立即冰浴2～3min；

3)加入900μl37℃預(yù)熱的lb低鹽培養(yǎng)基，37℃，80-100rpm恢復(fù)培養(yǎng)1h；

4)4000rpm離心5min，吸去700μl上清；

5)重懸菌體后取100-200μl涂布含有25μg/mlzeocin的lb低鹽固體培養(yǎng)基；

6)37℃倒置培養(yǎng)12-16h。

挑取陽性轉(zhuǎn)化子，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行菌液pcr驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子正確性，pcr體系及條件如下：

pcr體系：

pcr條件：

2％瓊脂糖凝膠電泳檢測陽性轉(zhuǎn)化子菌液pcr產(chǎn)物，電泳條件：120v，30min。15％甘油管保存含有重組表達(dá)載體的e.coli并提取質(zhì)粒，為線性化電轉(zhuǎn)p.pastoris準(zhǔn)備，相關(guān)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)按照質(zhì)粒提取試劑盒(天根生物科技有限公司)說明書操作。(圖1)

實(shí)施例3含ppicdlp4重組酵母菌的構(gòu)建

1、重組載體ppicdlp4的線性化

利用pmei對組成型重組表達(dá)載體ppicdlp4進(jìn)行酶切，酶切體系和反應(yīng)條件如下：

上述酶切體系加樣完畢后，于37℃反應(yīng)3小時(shí)，2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳條件：120v，30min。電泳完畢檢測重組表達(dá)載體正確線性化后利用dna回收試劑盒回收線性化的重組表達(dá)載體(圖2)。

2、線性化載體的畢赤酵母電轉(zhuǎn)化與鑒定

1)挑取ypd平板上的x-33單菌落，接種至10mlypd液體培養(yǎng)基，30℃，250rpm，過夜培養(yǎng)；

2)取50μl過夜培養(yǎng)液接種至100mlypd液體培養(yǎng)基，30℃，250rpm，培養(yǎng)至od600吸光值為1.2；

3)50ml培養(yǎng)物，4℃，4000rpm，5min離心后加入50ml無菌水重懸；

4)4℃，4000rpm，5min離心后加入25ml無菌水重懸；

5)4℃，4000rpm，5min離心后加入2ml1m山梨醇重懸；

6)4℃，4000rpm，5min離心后加入100μl1m山梨醇重懸后即為x-33感受態(tài)細(xì)胞(以上6步操作必須在冰上操作，動(dòng)作輕柔)；

7)預(yù)混80μlx-33感受態(tài)細(xì)胞和5-10μg線性化載體，轉(zhuǎn)移至冰上預(yù)冷的0.2cm電轉(zhuǎn)杯中，冰上放置5min后電轉(zhuǎn)儀操作(1200v，25μf，400ω)；

8)立即加入1ml1m山梨醇，混勻；

9)30℃溫育1-2h；

10)取100μl溫育后的x-33細(xì)胞涂布含有100μg/mlzeocin的ypds平板，30℃倒置培養(yǎng)2-4天。

挑取ypds平板上的單菌落接種至100μg/mlzeocin的ypd液體培養(yǎng)基中，30℃，250rpm，過夜培養(yǎng)。取1ml過夜培養(yǎng)物4℃，12000rpm，5min離心后pbs重懸，沸水浴10min，快速放置于-70℃30min，立即再次沸水浴10min，4℃，12000rpm，5min離心后取上清作為模板進(jìn)行pcr驗(yàn)證陽性轉(zhuǎn)化子，pcr體系與條件如下：

pcr體系：

pcr體系：

pcr條件：

2％瓊脂糖凝膠電泳檢測陽性轉(zhuǎn)化子菌液pcr產(chǎn)物，電泳條件：120v，30min。將大小正確的陽性轉(zhuǎn)化子一一對應(yīng)轉(zhuǎn)移至含有100μg/mlzeocin的ypd平板上以備進(jìn)一步表達(dá)。

實(shí)施例4抗菌肽dlp4的分泌表達(dá)

1、轉(zhuǎn)化子的表達(dá)

挑取陽性轉(zhuǎn)化子，接種至ypd液體培養(yǎng)基，30℃，250rpm振蕩培養(yǎng)18-20h；0.5-1％接種量轉(zhuǎn)接至100mlypd液體培養(yǎng)基，30℃，250rpm振蕩培養(yǎng)1天后接種至5l發(fā)酵罐，設(shè)置溫度30℃，250rpm振蕩培養(yǎng)5天至發(fā)酵結(jié)束。具體操作步驟如下：

(1)種子液準(zhǔn)備：

甘油管活化，劃平板，挑取單菌落，ypd培養(yǎng)基，28-30℃，250rpm，18～24h。

按1％的接種量轉(zhuǎn)接至ypd培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16～18h，od600約為4～6。

按10％接種量接到上罐培養(yǎng)基中(含4.8‰pmt1)(即200ml菌液+200ml45％葡萄糖+9.6mlpmt1)，裝液量為2l/5l。

(2)菌體生長階段：

在800rpm，ph5.0，po2>35％，29℃條件下培養(yǎng)約16-18h。

(3)添加葡萄糖生長階段：

觀測溶氧值開始緩慢下降后突然上升，開始補(bǔ)加50％葡萄糖(12‰pmt1,2.4ml)添加時(shí)間6-8h。流速為30ml/l/h。

(4)甲醇過渡誘導(dǎo)：

添加葡萄糖6h后，饑餓1h，待葡萄糖耗盡后，開始補(bǔ)加甲醇(含12‰pmt1,6ml)，補(bǔ)加過程中，流速由第1小時(shí)1ml/l/h逐漸增加到第6小時(shí)6ml/l/h，直至發(fā)酵結(jié)束。

(5)100％甲醇誘導(dǎo)階段

甲醇過渡誘導(dǎo)6h后，開始100％甲醇連續(xù)誘導(dǎo)(6ml/l/h)。甲醇誘導(dǎo)開始后，每12h取樣。

2、重組酵母發(fā)酵液抗菌活性檢測

抑菌圈實(shí)驗(yàn)分析：挑取s.aureusatcc25923單菌落接種于10mlmh培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)至od600nm≈0.4，1％接種量轉(zhuǎn)移至50mlmh固體培養(yǎng)基中，混勻，迅速倒入19cm×19cm的方形培養(yǎng)皿中，待凝固后，在培養(yǎng)基表面小心放置牛津杯，加入50μl發(fā)酵液上清。

3、重組酵母分泌蛋白水平tricine-sds-page檢測

對所獲得的高活性重組酵母菌株進(jìn)一步采用tricine-sds-page分析重組突變體表達(dá)水平，電泳方法參照2006。(圖3)

實(shí)施例5抗菌肽dlp4的純化

1、陽離子交換層析純化

bradford法測定蛋白濃度，4℃，12000rpm離心10min后取上清。將hiprepspff陽離子交換柱(長度16mm，內(nèi)徑10mm，gehealthcare)利用a液平衡5-10個(gè)柱體積后上樣。進(jìn)樣完畢后，先用含有20mm，ph7.0的磷酸鹽洗脫緩沖液(a液)進(jìn)行洗脫，待穿透峰洗脫完后，用含有1mnacl的20mm，ph7.0的磷酸鹽洗脫緩沖液(b液)進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰。洗脫步驟為：100％a液，洗脫5個(gè)柱體積，為穿透峰；40％a，60％b液，洗脫5個(gè)柱體積，為洗脫峰。利用uv215nm監(jiān)測洗脫情況，tricine-sds-page和檢測目標(biāo)產(chǎn)物純化情況。

2、1kda透析袋除鹽

收集到的洗脫峰，經(jīng)1kda截留分子量透析袋4℃透析，每2h換水一次，換水6次。收集透析后的透析液，低溫真空冷凍干燥機(jī)(-54℃，0.016mpa)凍干，通過tricine-sdspage凝膠電泳檢測。(圖4)

圖6為抗菌肽dlp4純化后的maldi-tofms分析結(jié)果。

通過對酵母重組菌株進(jìn)行高密度誘導(dǎo)發(fā)酵，120h發(fā)酵后抗菌肽dlp2產(chǎn)量高達(dá)1600mg/l左右，可獲得純度高于90％的抗菌肽dlp4產(chǎn)品。

實(shí)施例6抗菌肽dlp4抗金黃色葡萄球菌活性檢測

抗菌肽dlp4對病原菌的最小抑菌濃度(mic)參照tian等(tian等，expressionofantimicrobialpeptidelhmultimersinescherichiacolic43(de3).appliedmicrobiologyandbiotechnology,2009,83(1):143-149)建立的微量肉湯稀釋法，根據(jù)具體情況略有改動(dòng)，操作細(xì)節(jié)如下：

1)挑取供試菌株單克隆至mh培養(yǎng)基，37℃，250rpm，振蕩過夜培養(yǎng)；

2)將抗菌藥物按2倍梯度系列稀釋至1.5ml無菌離心管中，濃度分別是終濃度的10倍；

3)以1％的接種量分別將供試菌株轉(zhuǎn)接至mh液體培養(yǎng)基中37℃，250rpm振蕩培養(yǎng)至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁；

4)稀釋供試菌培養(yǎng)液1000倍(最終菌體濃度為10⁵cfu/ml左右)，轉(zhuǎn)移至無菌細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔含稀釋后菌液90μl；

5)加入稀釋后的藥物10μl，每個(gè)濃度3個(gè)平行樣，并預(yù)留無藥物陰性對照孔。加無菌培養(yǎng)板板蓋，封口膜封閉后37℃靜止培養(yǎng)至陰性對照空出現(xiàn)肉眼可見的明顯渾濁菌液。將細(xì)胞培養(yǎng)板取出，觀測結(jié)果，mic值是能夠明顯抑制受試菌株生長的最小濃度。如出現(xiàn)跳孔或平行樣間結(jié)果不一致情況，則重新測試。

取dlp4進(jìn)行抗菌活性測定，結(jié)果如表2所示。

表2抗菌肽dlp4的抗菌活性

由表2可知，dlp4對金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)抑制作用：對金黃色葡萄球菌atcc25923的mic為0.0625μg/ml；對atcc6538的mic為2μg/ml；對atcc43300的mic為1μg/ml。可見，dlp4對鏈球菌有較強(qiáng)抑制作用，對豬鏈球菌cvcc606的mic為0.25μg/ml。

實(shí)施例7抗菌肽dlp4的抑菌圈實(shí)驗(yàn)

通過抑菌圈實(shí)驗(yàn)來檢測dlp4抗菌譜(zhang,et.,2011)。挑取金黃色葡萄球菌atcc25923以及atcc43300受試菌單菌落接種于液體mh培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至od600nm為0.4，分別向20ml相應(yīng)的固體培養(yǎng)基(42℃)加入200μl上述菌液，快速混勻，倒入培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基完全凝固后，在其表面放置牛津杯，加入12μl由實(shí)施例4中發(fā)酵得到的24-120h發(fā)酵上清，37℃靜置培養(yǎng)16-18h，放入凝膠成像系統(tǒng)中拍照。(圖5)

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之做一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所

<120>新型抗菌肽dlp4的制備方法

<130>khp171112319.6

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>40

<212>prt

<213>抗菌肽dlp2

<400>1

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151015

alaalahiscysilealaargglylysargglyglytrpcysasplys

202530

argalavalcysasncysarglys

3540

<210>2

<211>120

<212>dna

<213>抗菌肽dlp4

<400>2

gcaacctgtgacctgttgagcccttttaaagttggtcatgccgcatgcgctgctcattgt60

atcgcaaggggcaaacgaggaggatggtgtgacaaaagagctgtttgcaactgccggaaa120

<210>3

<211>149

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tctctcgagaaaagagctacttgtgatttgttgtctccatttaaggttggtcatgctgct60

tgtgctgctcattgtattgctagaggtaagagaggtggttggtgtgataagagagctgtt120

tgtaactgtagaaagtaatgatctagagc149