本發(fā)明涉及魚(yú)類抗氧化物質(zhì)及其制備方法和用途，具體地說(shuō)，涉及一種具有抗氧化功能的魚(yú)皮蛋白肽及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)酶解得到多肽，使其蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，疏水區(qū)的活性官能基團(tuán)暴露，隨著肽鍵的裂解，小分子蛋白肽和氨基酸增加，從而可以提供質(zhì)子或電子源，保持較高的氧化還原電位，使其具有清除活性自由基的能力。氧化對(duì)需氧生物特別是脊椎動(dòng)物和人類是一個(gè)重要的代謝過(guò)程，但是它卻導(dǎo)致了自由基的形成，活性氧自由基(ros)被認(rèn)為能引起氧化應(yīng)激。在食品體系中，脂類或蛋白質(zhì)可能會(huì)受到ros的攻擊經(jīng)歷氧化過(guò)程，從而導(dǎo)致食品產(chǎn)生不愉快味道，顏色發(fā)暗，同時(shí)也可能產(chǎn)生潛在的毒性終產(chǎn)物?？寡趸嚯牡膽?yīng)用能防止食品成分由于捐獻(xiàn)電子給活性氧自由基以及中和活性氧自由基的負(fù)面作用而變質(zhì)?？寡趸脑卺t(yī)學(xué)、化妝品、生物、食品領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種具有抗氧化功能的魚(yú)皮蛋白肽及其制備方法。

本發(fā)明的另一目的是提供所述魚(yú)皮蛋白肽在醫(yī)藥、食品及保健品中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的具有抗氧化功能的魚(yú)皮蛋白肽，其氨基酸序列分別如seqidno:1和2所示。

含有上述魚(yú)皮蛋白肽的魚(yú)皮蛋白肽粉可按照如下方法制備，包括以下步驟：

(1)將冷凍魚(yú)皮在8-12℃條件下進(jìn)行解凍清洗，魚(yú)皮清洗后用打漿機(jī)將魚(yú)皮打成漿，加入魚(yú)皮重量1.5-2.5倍的水，于120-130℃保溫30-60分鐘；

(2)將魚(yú)皮蛋白漿的溫度下調(diào)至60-70℃，進(jìn)行超聲處理(超聲處理旨在改變魚(yú)皮蛋白的組織結(jié)構(gòu))；超聲處理在超聲波發(fā)生器內(nèi)進(jìn)行，超聲波的頻率為50-60kh，處理時(shí)間25-35分鐘；

(3)將經(jīng)過(guò)超聲后魚(yú)皮蛋白漿的溫度上調(diào)至115-125℃，于115-125℃煮制90-150分鐘，然后離心取上清液；

(4)按照魚(yú)皮重量0.15-0.30％的比例向(3)的上清液中加入復(fù)合蛋白酶進(jìn)行分步酶解：第一步向上清液中加入魚(yú)皮重量0.10-0.15％的復(fù)合蛋白酶i(由堿性蛋白酶和胰蛋白酶按質(zhì)量比1-2:1組成，其中堿性蛋白酶的酶活為70-100萬(wàn)u/g，胰蛋白酶的酶活為40-60萬(wàn)u/g)，于50-55℃酶解0.5-1.0h；第二步向上述酶解體系中加入魚(yú)皮重量0.05-0.15％的復(fù)合蛋白酶ii(由木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶按質(zhì)量比1-2:1組成，其中木瓜蛋白酶的酶活為30-60萬(wàn)u/g，風(fēng)味蛋白酶的酶活為50-90萬(wàn)u/g)，于50-60℃酶解0.5-1.0h；然后在95-98℃下保溫10-20分鐘，冷卻至室溫，用活性炭過(guò)濾，收集上清液；

(5)對(duì)步驟(4)所得上清液進(jìn)行超濾處理，先用孔徑為5000道爾頓的陶瓷膜超濾，將分子量小于5000的蛋白和多肽分離出來(lái)，再用孔徑為3000道爾頓的濾膜將分子量小于3000道爾頓的蛋白肽分離出來(lái)；

(6)分子量小于3000的蛋白肽液再經(jīng)過(guò)sephadexg-25凝膠分離，洗脫液為去離子水，洗脫峰在280nm下進(jìn)行檢測(cè)，收集第1個(gè)洗脫峰，再用rp-hplc反相高效液相色譜進(jìn)行1次分離，取第7-9分鐘收集的肽溶液；

(7)將步驟(6)得到的肽溶液通過(guò)濃縮、冷凍干燥，得到魚(yú)皮蛋白肽粉。

本發(fā)明中，rp-hplc的件為：0-5min，流動(dòng)相為純水；流動(dòng)相b：含0.1％tfa(三氟乙酸)的乙腈，5-10min流動(dòng)相b，從0％到35％，10-15min，流動(dòng)相b從65％到95％，15-30min，流動(dòng)相b從95％到0％，30min停止；所用色譜柱為：kromasilc18，5μm，4.6×250mm。

本發(fā)明所用rp-hplc色譜柱為：kromasilc18，5μm，4.6×250mm。

通過(guò)lc-ms/ms對(duì)魚(yú)皮蛋白肽粉的主要成分進(jìn)行測(cè)定，序列如seqidno:1和2所示的魚(yú)皮蛋白肽的含量占魚(yú)皮蛋白肽粉總重的50-53％。

本發(fā)明所述的魚(yú)皮來(lái)自鰱魚(yú)、羅非魚(yú)。

本發(fā)明還提供所述魚(yú)皮蛋白肽在藥品、保健食品、化妝品和食品添加劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明進(jìn)一步提供含有如seqidno:1和2所示魚(yú)皮蛋白肽的藥品、保健食品、化妝品和食品添加劑。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(一)本發(fā)明對(duì)魚(yú)皮進(jìn)行打漿處理，然后進(jìn)行120-130℃處理，再結(jié)合特定頻率超聲波技術(shù)處理魚(yú)皮蛋白漿，再進(jìn)行115-125℃高溫處理，直接將可溶性蛋白提取出來(lái)。

(二)本發(fā)明先將可溶性蛋白提取出來(lái)，再利用蛋白酶酶解，蛋白酶的總使用量只為魚(yú)皮重量的0.15-0.30％。

(三)開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品安全，本發(fā)明采用多種食品級(jí)復(fù)合蛋白酶(堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶)，在溫和條件下，經(jīng)過(guò)適度酶解獲得特定分子量大小的魚(yú)皮蛋白肽，無(wú)需調(diào)節(jié)ph值，產(chǎn)物為100％魚(yú)皮蛋白肽。

(四)所得魚(yú)皮蛋白肽中分子量小于1500da的肽的比例為85％以上。具有較好的抗氧化功能，其10μg/ml條件下dpph自由基清除能力達(dá)到90％以上。

(五)所得魚(yú)皮蛋白肽粉產(chǎn)品中序列如seqidno:1和2所示的魚(yú)皮蛋白肽的含量占魚(yú)皮蛋白肽粉總重的50％以上。

(六)本發(fā)明提供的魚(yú)皮蛋白肽，能廣泛作為食品添加劑。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。

實(shí)施例1具有抗氧化功能的魚(yú)皮蛋白肽的制備方法

(1)選用冷凍鰱魚(yú)皮100克，在12℃條件下進(jìn)行解凍清洗，用符合飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的清潔水清洗,魚(yú)皮清洗后用打漿機(jī)將魚(yú)皮打成漿，加入魚(yú)皮重量1.5倍的水在120℃的條件下保溫60分鐘。

(2)將魚(yú)皮的溫度調(diào)整到70℃，于超聲波發(fā)生器中經(jīng)超聲波(頻率為60kh)處理35分鐘，改變魚(yú)皮蛋白的組織結(jié)構(gòu)。

(3)然后將魚(yú)皮的溫度調(diào)整到115℃，在115℃條件下煮制150分鐘，通過(guò)離心取上清液。

(4)按照魚(yú)皮重量0.15％的比例向(3)的上清液中加入復(fù)合蛋白酶進(jìn)行分步酶解，第一步向上清液中加入魚(yú)皮重量0.10％的復(fù)合蛋白酶(堿性蛋白酶和胰蛋白酶組成，它們之間的質(zhì)量比為1：1，其中堿性蛋白酶的酶活為70萬(wàn)u/g，胰蛋白酶的酶活為40萬(wàn)u/g)，在55℃的條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)1.0h；然后進(jìn)行第二步酶解，向上述酶解體系中加入魚(yú)皮重量0.05％復(fù)合蛋白酶(木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成，它們之間的質(zhì)量比為1：1，其中木瓜蛋白酶的酶活為30萬(wàn)u/g，風(fēng)味蛋白酶的酶活為50萬(wàn)u/g)，在55℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)1.0h；在95-98℃下保溫10分鐘，冷卻至室溫，利用活性炭過(guò)濾，收集上清液。

(5)將步驟(4)所得的上清液通過(guò)二步超濾方法進(jìn)行處理，利用孔徑為5000道爾頓的陶瓷膜超濾，先將分子量小于5000的蛋白和多肽分離出來(lái)，再用孔徑為3000道爾頓的濾膜將分子量小于3000道爾頓的蛋白肽分離出來(lái)。

(6)取分子量為小于3000的蛋白肽液，再經(jīng)過(guò)sephadexg-25凝膠分離，洗脫液為去離子水，洗脫峰在280nm下進(jìn)行檢測(cè)，收集第1個(gè)洗脫峰，再用rp-hplc反相高效液相色譜進(jìn)行1次分離，取第7-9分鐘收集的肽溶液。

(7)將步驟(6)得到的肽溶液通過(guò)濃縮、冷凍干燥，得到魚(yú)皮蛋白肽粉。通過(guò)lc-ms/ms對(duì)魚(yú)皮蛋白肽的主要成分進(jìn)行測(cè)定，其氨基酸序列分別如seqidno:1和2所示，兩種魚(yú)皮蛋白肽約占魚(yú)皮蛋白肽粉總重的50.5％。其中90％以上魚(yú)皮蛋白肽的分子量小于1500da。

實(shí)施例2具有抗氧化功能的魚(yú)皮蛋白肽的制備方法

(1)選用冷凍羅非魚(yú)皮500克，在10℃條件下進(jìn)行解凍清洗，取魚(yú)皮，用符合飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的清潔水清洗,魚(yú)皮清洗后用打漿機(jī)將魚(yú)皮打成漿，加入魚(yú)皮重量2.0倍的水在125℃的條件下保溫60分鐘。

(2)將魚(yú)皮的溫度調(diào)整到65℃，于超聲波發(fā)生器中經(jīng)超聲波(頻率為55kh)處理35分鐘，改變魚(yú)皮蛋白的組織結(jié)構(gòu)。

(3)然后將魚(yú)皮的溫度調(diào)整到120℃，在120℃條件下煮制120分鐘，通過(guò)離心取上清液。

(4)按照魚(yú)皮重量0.30％的比例向(3)的上清液中加入復(fù)合蛋白酶進(jìn)行分步酶解，第一步向上清液中加入魚(yú)皮重量0.15％的復(fù)合蛋白酶(堿性蛋白酶和胰蛋白酶組成，它們之間的質(zhì)量比為2：1，其中堿性蛋白酶的酶活為80萬(wàn)u/g，胰蛋白酶的酶活為50萬(wàn)u/g)，在55℃的條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)0.5h；然后進(jìn)行第二步酶解，向上述酶解體系中加入魚(yú)皮重量0.15％復(fù)合蛋白酶(木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成，它們之間的質(zhì)量比為1：1，其中木瓜蛋白酶的酶活為50萬(wàn)u/g，風(fēng)味蛋白酶的酶活為70萬(wàn)u/g)，在55℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)1.0h；在95℃下保溫10分鐘，冷卻至室溫，利用活性炭過(guò)濾，收集上清液。

(5)將步驟(4)所得的上清液通過(guò)二步超濾方法進(jìn)行處理，利用孔徑為5000道爾頓的陶瓷膜超濾，先將分子量小于5000的蛋白和多肽分離出來(lái)，再用孔徑為3000道爾頓的濾膜將分子量小于3000道爾頓的蛋白肽分離出來(lái)。

(6)取分子量為小于3000的蛋白肽液，再經(jīng)過(guò)sephadexg-25凝膠分離，洗脫液為去離子水，洗脫峰在280nm下進(jìn)行檢測(cè)，收集第1個(gè)洗脫峰，再用rp-hplc反相高效液相色譜進(jìn)行1次分離，取第7-9分鐘收集的肽溶液。

(7)將步驟(6)得到的肽溶液通過(guò)濃縮、冷凍干燥，得到魚(yú)皮蛋白肽粉。通過(guò)lc-ms/ms對(duì)魚(yú)皮蛋白肽的主要成分進(jìn)行測(cè)定，其氨基酸序列分別如seqidno:1和2所示，兩種魚(yú)皮蛋白肽約占魚(yú)皮蛋白肽粉總重的50.2％。其中90％以上魚(yú)皮蛋白肽的分子量小于1500da。

實(shí)施例3具有具有抗氧化功能的魚(yú)皮蛋白肽的制備方法

(1)選用冷凍鰱魚(yú)皮1000克，在8℃條件下進(jìn)行解凍清洗，取魚(yú)皮，用符合飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的清潔水清洗,魚(yú)皮清洗后用打漿機(jī)將魚(yú)皮打成漿，加入魚(yú)皮重量2.5倍的水在130℃的條件下保溫30分鐘。

(2)將魚(yú)皮的溫度調(diào)整到60℃，于超聲波發(fā)生器中經(jīng)超聲波(頻率為50kh)處理35分鐘，改變魚(yú)皮蛋白的組織結(jié)構(gòu)。

(3)然后將魚(yú)皮的溫度調(diào)整到125℃，在125℃條件下煮制120分鐘，通過(guò)離心取上清液。

(4)按照魚(yú)皮重量0.20％的比例向(3)的上清液中加入復(fù)合蛋白酶進(jìn)行分步酶解，第一步向上清液中加入魚(yú)皮重量0.10％的復(fù)合蛋白酶(堿性蛋白酶和胰蛋白酶組成，它們之間的質(zhì)量比為2：1，其中堿性蛋白酶的酶活為100萬(wàn)u/g，胰蛋白酶的酶活為60萬(wàn)u/g)，在55℃的條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)1.0h；然后進(jìn)行第二步酶解，向上述酶解體系中加入魚(yú)皮重量0.10％復(fù)合蛋白酶(木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成，它們之間的質(zhì)量比為2：1，其中木瓜蛋白酶的酶活為60萬(wàn)u/g，風(fēng)味蛋白酶的酶活為90萬(wàn)u/g)，在55℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)1.0h；在95℃下保溫10分鐘，冷卻至室溫，利用活性炭過(guò)濾，收集上清液。

(5)將步驟(4)所得的上清液通過(guò)二步超濾方法進(jìn)行處理，利用孔徑為5000道爾頓的陶瓷膜超濾，先將分子量小于5000的蛋白和多肽分離出來(lái)，再用孔徑為3000道爾頓的濾膜將分子量小于3000道爾頓的蛋白肽分離出來(lái)。

(6)取分子量為小于3000的蛋白肽液，再經(jīng)過(guò)sephadexg-25凝膠分離，洗脫液為去離子水，洗脫峰在280nm下進(jìn)行檢測(cè)，收集第1個(gè)洗脫峰，再用rp-hplc反相高效液相色譜進(jìn)行1次分離，取第7-9分鐘收集的肽溶液。

(7)將步驟(6)得到的肽溶液通過(guò)濃縮、冷凍干燥，得到魚(yú)皮蛋白肽粉。通過(guò)lc-ms/ms對(duì)魚(yú)皮蛋白肽的主要成分進(jìn)行測(cè)定，其氨基酸序列分別如seqidno:1和2所示，兩種魚(yú)皮蛋白肽約占魚(yú)皮蛋白肽粉總重的51.3％。其中90％以上魚(yú)皮蛋白肽的分子量小于1500da。

實(shí)驗(yàn)例本發(fā)明魚(yú)皮蛋白肽抗氧化活性的測(cè)定試驗(yàn)

試驗(yàn)樣品：實(shí)施例1-3中制備的魚(yú)皮蛋白抗氧化活性肽。

實(shí)驗(yàn)方法如下：

(1)清除dpph自由基能力：取10μg/ml的抗氧化活性肽1.5ml，加入99.5％乙醇1.5ml和0.02％dpph乙醇溶液0.675ml混合，振蕩混勻，室溫下避光水浴30min，然后在517nm下檢測(cè)體系吸光值。吸光值越低，體系的清除dpph自由基能力越強(qiáng)?？瞻讓?duì)照即是將樣品溶液1.5ml換成去離子水1.5ml。

dpph自由基清除能力％＝((空白吸光值-樣品吸光值)/空白吸光值)×100

(2)還原力測(cè)定：取10μg/ml的抗氧化活性肽1ml，加入0.2m磷酸緩沖液(ph6.6)2.5ml和1％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的鐵氰化鉀溶液2.5ml，混勻，然后在50℃水浴加熱20min。取出迅速冷卻，加入10％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))三氯乙酸(tca)溶液2.5ml，混合均勻，然后在3000g下離心10min。取上清液2.5ml，加入去離子水2.5ml和1％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))三氯化鐵溶液0.5ml，充分混勻，在室溫下反應(yīng)10min，用700nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。還原力即可用700nm波長(zhǎng)處吸光值表示。

(3)氧化自由基吸收能力(orac)：不同濃度的抗氧化活性肽溶液10μl與75mm磷酸鹽緩沖液90μl(ph7.4)及200nm的熒光試劑50μl充分混合，然后在37℃溫育15min，再加入80mm的aaph溶液50μl。用酶標(biāo)儀每分鐘讀取熒光值共進(jìn)行100min。熒光的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別是485nm和538nm。用磷酸緩沖溶液代替樣品作為空白。以trolox作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，使用的濃度為0，2，4，8，12，16μm，繪制熒光淬滅曲線，并計(jì)算熒光淬滅曲線下的積分面積(auc)。auc的計(jì)算公式如下：

式中：f0是0min時(shí)熒光值，fi是第imin時(shí)的熒光值。

orac值用樣品曲線的斜率與trolox曲線的斜率之比，orac值得單位表示為μmtrolox/mg肽。

(4)abts·+自由基清除能力：取1mg/ml的樣品溶液0.04ml與4ml稀釋后的abts溶液混合震蕩30s后，常溫避光放置6min，再在734nm下檢測(cè)其吸光值，空白用蒸餾水代替樣品。清除abts·+自由基能力計(jì)算公式如下：

abts·+自由基清除率％＝(1－a樣品/a空白)×100

(5)亞鐵離子螯合力的測(cè)定：樣品配成濃度為1mg/ml的樣品溶液，取樣品溶液1ml，加入3.7ml乙醇和0.1ml2mm的fecl2溶液混合，再加入0.2ml5mm的菲咯嗪溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)。在室溫下靜置10min后，在562nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度?？瞻子谜麴s水代替樣品。

亞鐵離子螯合能力％＝[(空白吸光值－樣品吸光值)/空白吸光值]×100

結(jié)果顯示，本發(fā)明魚(yú)肉抗氧化活性肽具有較好的抗氧化能力，在10μg/ml的條件下，清除dpph自由基能力達(dá)到91％以上，還原力達(dá)到0.90以上，abts·+自由基清除能力達(dá)85％以上，亞鐵離子螯合力達(dá)90％以上，orac值為18.5以上，是一種理想的抗氧化肽(表1)。

表1本發(fā)明魚(yú)皮抗氧化活性肽的抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之做一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110>具有抗氧化功能的魚(yú)皮蛋白肽及其制備方法與應(yīng)用

<120>天津市寬達(dá)水產(chǎn)食品有限公司

<130>khp171112775.2

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