本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種探針組和試劑盒，通過使用熒光原位雜交的手段，快速檢測樣品中的bcr/abl基因融合。

背景技術(shù)：

慢性粒細(xì)胞白血病(chronicmyelogenousleukemia，cml)是一種發(fā)生于造血干細(xì)胞的血液系統(tǒng)惡性克隆增生性疾病。慢性粒細(xì)胞白血病是嚴(yán)重危害中青年健康的惡性血液病之一，為白血病中較常見的類型。95％以上cml患者白細(xì)胞中出現(xiàn)特征性的費(fèi)城染色體及其分子標(biāo)記bcr/abl基因融合。經(jīng)確診為bcr/abl基因融合的患者，可以用靶向藥物酪氨酸激酶抑制劑(如格列衛(wèi)等)進(jìn)行精準(zhǔn)治療。

因此，bcr/abl基因融合被列入白血病臨床必檢項(xiàng)目，目前臨床上檢測bcr/abl基因融合的常見方法有pcr和熒光原位雜交(fish)：pcr的檢測靈敏度很高，但只能用于已知轉(zhuǎn)錄本的檢測，并且只能檢測很小范圍內(nèi)的基因序列，當(dāng)基因序列發(fā)生變異時(shí)，很容易出現(xiàn)假陰性的結(jié)果；熒光原位雜交(fish)是檢測bcr/abl基因融合的金標(biāo)準(zhǔn)。但傳統(tǒng)熒光原位雜交(fish)使用的是基因組探針，探針總長度達(dá)100kb以上，由于探針長度極長，覆蓋范圍極大，使得部分序列不可避免地出現(xiàn)非特異性雜交，導(dǎo)致背景偏高；同時(shí)，過長的探針也經(jīng)常導(dǎo)致熒光信號點(diǎn)發(fā)散，不利于信號的確認(rèn)和統(tǒng)計(jì)。由于傳統(tǒng)熒光原位雜交(fish)探針單位長度的熒光強(qiáng)度有限，使用減少探針長度的方法來解決上述問題，會(huì)使得熒光信號強(qiáng)度降低，不利于檢測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種探針組，通過熒光原位雜交的手段，建立一種快速、靈敏、特異性地檢測樣品中bcr/abl基因融合的方法。

本發(fā)明的快速檢測bcr/abl基因融合的方法與傳統(tǒng)fish方法相比，具有背景低，信號點(diǎn)集中，特異性強(qiáng)，速度快等優(yōu)點(diǎn)，能快速、高效地檢測bcr/abl基因融合。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明提供了一種快速檢測bcr/abl基因融合的探針組，所述探針組由接觸探針、擴(kuò)增探針和熒光探針三種探針組成，所述接觸探針包括接觸探針1和接觸探針2，所述擴(kuò)增探針包括擴(kuò)增探針1和擴(kuò)增探針2，所述熒光探針包括熒光探針1和熒光探針2，其中，接觸探針1、接觸探針2、擴(kuò)增探針1、擴(kuò)增探針2、熒光探針1和熒光探針2的堿基序列分別為：

接觸探針1：

5’-tggagggggataactactggaaacggtagc(gtatjcgcjctgftatjccg)-3’；

接觸探針2：

5’-atgtctgggaaactgcctgatggaggggga(agtfajcgcfgtafcaajtj)-3’；

擴(kuò)增探針1：

5’-cggfatajcagfgcgfatac(tcfacgjcfctajggafaafg)-3’；

擴(kuò)增探針2：

5’-fafttgjtacjgcgftjact(gcafjttaccgfajjtacft)-3’；

熒光探針1：5’-cy3-jttjtccftagjgfcgtjga-3’；

熒光探針2：5’-fitc-ajgtafftjcggtaafjtgc-3’。

優(yōu)選地，所述熒光探針1和所述熒光探針2的5’端用熒光基團(tuán)標(biāo)記。

優(yōu)選地，所述熒光基團(tuán)為cy3或fitc。

進(jìn)一步地，所述接觸探針1、所述擴(kuò)增探針1和所述熒光探針1用于檢測bcr基因，所述熒光探針1將bcr基因標(biāo)記為紅色熒光，所述接觸探針2、所述擴(kuò)增探針2和所述熒光探針2用于檢測abl基因，所述熒光探針2將abl基因標(biāo)記為綠色熒光，所述接觸探針、所述擴(kuò)增探針和所述熒光探針的堿基序列中的f表示甲基化的c，j表示甲基化的g，引入f/j兩種天然基因組dna中不存在的堿基，可以有效地減少非特異性雜交，提高檢測的特異性。

本發(fā)明還提供了一種用于快速檢測bcr/abl基因融合的試劑盒，所述試劑盒包括雜交液和上述由接觸探針、擴(kuò)增探針和熒光探針三種探針組成的探針組。

進(jìn)一步地，所述雜交液包括：1～10％(w/v)硫酸葡聚糖，100～1000mmnacl，10～40％(v/v)去離子甲酰胺，5mmna2edta，0.01～1％(v/v)tritonx-100，5～200mmtris-hcl(ph7.5)，0.1～1％的吐溫80，0.1～1％的三甲銨乙內(nèi)酯。

本發(fā)明最后提供了一種上述試劑盒快速檢測bcr/abl基因融合的方法，包括如下步驟：

(1)吸取10μl樣本滴在載玻片上，在56℃下烘干，使樣本固定在載玻片上；

(2)在室溫下將載玻片浸入二甲苯中脫蠟2次，每次10min，隨后在100％乙醇中浸泡5min，接著依次浸入100％乙醇、85％乙醇和70％乙醇中各2min復(fù)水，在90℃下浸入純化水中煮20-30min，每5min將載玻片取出觀察一次，防止樣本脫落，取出載玻片，在室溫下將其依次浸入70％乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2min脫水，自然晾干；

(3)分別吸取0.5μl的接觸探針1、接觸探針2、擴(kuò)增探針1、擴(kuò)增探針2、熒光探針1和熒光探針2，加入到17μl雜交緩沖液中，混勻，離心，得到探針混合物；

(4)將20μl探針混合物滴于載玻片的雜交區(qū)域，蓋片，膠水封邊，置于雜交儀中雜交30min；

(5)去除載玻片上的封片膠和蓋玻片，在67±1℃下干燥2h，然后將其浸入含0.3％(v/v)np-40的0.4×ssc溶液中漂洗2min，其間晃動(dòng)1～2次，自然晾干；

(6)在載玻片的雜交區(qū)域中滴加10μldapi復(fù)染劑，加蓋片，膠水封邊，靜置10min，用熒光顯微鏡鏡檢。

本發(fā)明的技術(shù)要點(diǎn)或原理：熒光原位雜交(flourescenceinsituhybridization，fish)是一種應(yīng)用標(biāo)記有熒光物質(zhì)的探針，通過雜交的方法來檢測細(xì)胞或組織內(nèi)特異性dna或rna的方法。傳統(tǒng)的熒光原位雜交由于單條探針的熒光強(qiáng)度有限，只能通過用多條探針共同作用的方法來提高熒光信號強(qiáng)度，這些探針單條長度約200～500bp，覆蓋總計(jì)高達(dá)100kb以上的基因組區(qū)域。由于探針數(shù)量多，覆蓋范圍廣，不可避免的有部分探針會(huì)產(chǎn)生非特異性雜交，從而導(dǎo)致背景上升。同時(shí)，由于探針的覆蓋范圍過大，很多時(shí)候熒光信號不能精確地聚成一個(gè)點(diǎn)，而是會(huì)發(fā)散開來，影響檢測和結(jié)果判讀，此外，傳統(tǒng)fish檢測需經(jīng)歷長達(dá)16小時(shí)的雜交，檢測時(shí)間長，檢測效率低。

本發(fā)明通過引入接觸探針、擴(kuò)增探針和熒光探針三種探針，并通過這三種探針與靶基因(her-2)的相互作用，將熒光信號放大400倍，且雜交時(shí)間僅需要30min；本發(fā)明通過在三種探針中引入f(甲基化的c)和j(甲基化的g)兩種天然dna中不存在的堿基，來提高三種探針相互作用的精度，有效地避免非特異性雜交。

本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)，確定熒光原位雜交的最佳溫度為42-58℃，甲酰胺最佳濃度為10-40％，分子信標(biāo)的最佳濃度為10ng/l。

本發(fā)明熒光探針5’端的熒光基團(tuán)，包括但不限于fitc或cy3，可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行添加。

與傳統(tǒng)熒光原位雜交方法相比，本發(fā)明提供的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明的探針組特異性地識別bcr或abl基因上30bp的序列，只有傳統(tǒng)方法的千分之一，由于探針覆蓋區(qū)域小，產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增的概率大大降低，從而背景更干凈；

2、本發(fā)明的探針組特異性地識別bcr或abl基因上30bp的序列，只有傳統(tǒng)fish方法的千分之一，由于探針覆蓋區(qū)域小，產(chǎn)生的熒光信號更加集中，同時(shí)，由于熒光信號被放大了400倍，熒光信號比傳統(tǒng)方法更易識別和檢測；

3、本發(fā)明的探針組，相互作用dna區(qū)段均在30bp以下，只需要30分鐘就能完成雜交，比傳統(tǒng)fish方法(16小時(shí))的雜交時(shí)間大為縮短。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它附圖。

圖1為使用探針檢測bcr/abl基因融合的熒光圖，其中a為使用傳統(tǒng)fish探針檢測bcr/abl基因融合的陰性結(jié)果，b為使用本發(fā)明的探針組檢測bcr/abl基因融合的陰性結(jié)果，c為使用傳統(tǒng)fish探針檢測bcr/abl基因融合的陽性結(jié)果，d為使用本發(fā)明的探針組檢測bcr/abl基因融合的陽性結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1：接觸探針、擴(kuò)增探針和熒光探針三種探針的設(shè)計(jì)和合成

(1)通過序列比對和高級結(jié)構(gòu)分析，選取bcr基因和abl基因上各30bp的序列分別作為檢測靶位點(diǎn)1和檢測靶位點(diǎn)2，其堿基序列分別為：

靶位點(diǎn)1：5’-gctaccgtttccagtagttatccccctcca-3’

靶位點(diǎn)2：5’-tccccctccatcaggcagtttcccagacat-3’

(2)根據(jù)靶位點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)互補(bǔ)的探針序列，并在其3’端添加20組20堿基的重復(fù)序列，構(gòu)成接觸探針1和接觸探針2，其堿基序列分別為：

接觸探針1：

5’-tggagggggataactactggaaacggtagc(gtatjcgcjctgftatjccg)20-3’

接觸探針2：

5’-atgtctgggaaactgcctgatggaggggga(agtfajcgcfgtafcaajtj)20-3’

重復(fù)序列經(jīng)dna序列比對，和人類基因組上任何區(qū)段不匹配，不會(huì)產(chǎn)生非特異性雜交，并且通過引入非天然的堿基f和j，進(jìn)一步降低非特異性信號產(chǎn)生的可能性；

(3)根據(jù)各自接觸探針的重復(fù)序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的擴(kuò)增探針1和擴(kuò)增探針2，其堿基序列分別為：

擴(kuò)增探針1：

5’-cggfatajcagfgcgfatac(tcfacgjcfctajggafaafg)20-3’

擴(kuò)增探針2：

5’-fafttgjtacjgcgftjact(gcafjttaccgfajjtacft)20-3’

擴(kuò)增探針的3’端也帶有20組20堿基的重復(fù)序列，經(jīng)經(jīng)dna序列比對，和人類基因組上任何區(qū)段不匹配，不會(huì)產(chǎn)生非特異性雜交，并且通過引入非天然的堿基f和j，進(jìn)一步降低非特異性信號產(chǎn)生的可能性；

(4)根據(jù)各自擴(kuò)增探針的重復(fù)序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的熒光探針1和熒光探針2，其堿基序列分別為：

熒光探針1：5’-cy3-jttjtccftagjgfcgtjga-3’

熒光探針2：5’-fitc-ajgtafftjcggtaafjtgc-3’

在本實(shí)施例中，所述熒光探針1和所述熒光探針2的5’端用熒光基團(tuán)標(biāo)記。所述熒光基團(tuán)包括但不限于fitc、fam或cy3等，可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行添加。

(5)人工設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的分子信標(biāo)

在本實(shí)施例中，通過對分子信標(biāo)做熱變性曲線實(shí)驗(yàn)，確定熒光原位雜交的最佳溫度為42-58℃，甲酰胺最佳濃度為10-40％，分子信標(biāo)最佳濃度為10ng/l。

實(shí)施例2：傳統(tǒng)fish探針和本發(fā)明的探針組檢測bcr/abl基因融合

a、傳統(tǒng)fish探針檢測

使用傳統(tǒng)fish探針檢測bcr/abl基因融合的方法，包括以下步驟：

(1)吸取10μl樣本滴在載玻片上，在56℃下烘干，使樣本固定在載玻片上；

(2)在室溫下將載玻片浸入二甲苯中脫蠟2次，每次10min，隨后在100％乙醇中浸泡5min，接著依次浸入100％乙醇、85％乙醇和70％乙醇中各2min復(fù)水，在90℃下浸入純化水中煮20-30min，每5min將載玻片取出觀察一次，防止樣本脫落，取出載玻片，在室溫下將其依次浸入70％乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2min脫水，自然晾干；

(3)吸取3μl探針加入到7μl雜交緩沖液中，輕彈離心管底部混勻后短暫離心，得到探針混合物；

(4)將10μl探針混合物滴于載玻片的雜交區(qū)域，立即加蓋玻片，封片膠封住蓋玻片邊緣，避免蓋玻片與玻片之間產(chǎn)生氣泡；

(5)將載玻片置于雜交儀中，在變性溫度為83℃，變性時(shí)間為5min，雜交溫度為42℃的條件下雜交16h；

(6)去除載玻片上的封片膠和蓋玻片，在67±1℃下干燥2h，然后將其浸入含0.3％(v/v)np-40的0.4×ssc溶液中漂洗2min，其間晃動(dòng)載玻片1～2次；

(7)在室溫下將載玻片浸入含0.1％(v/v)np-40的2×ssc溶液中漂洗30s，其間晃動(dòng)載玻片1～2次；

(8)在室溫下將載玻片依次浸入70％乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2min脫水，然后在暗處自然晾干；

(9)在載玻片的雜交區(qū)域中滴加10μldapi復(fù)染劑，加蓋蓋玻片，避免蓋玻片與載玻片之間產(chǎn)生氣泡。靜置10分鐘，置于熒光顯微鏡下檢測。

b、本發(fā)明的探針檢測

使用本發(fā)明的探針組檢測bcr/abl基因融合的方法，包括以下步驟：

(1)吸取10μl樣本滴在載玻片上，在56℃下烘干，使樣本固定在載玻片上；

(2)在室溫下將載玻片浸入二甲苯中脫蠟2次，每次10min，隨后在100％乙醇中浸泡5min，接著依次浸入100％乙醇、85％乙醇和70％乙醇中各2min復(fù)水，在90℃下浸入純化水中煮20-30min，每5min將載玻片取出觀察一次，防止樣本脫落，取出載玻片，在室溫下將其依次浸入70％乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2min脫水，自然晾干；

(3)分別吸取0.5μl的接觸探針1、接觸探針2、擴(kuò)增探針1、擴(kuò)增探針2、熒光探針1和熒光探針2，加入到17μl雜交緩沖液中，混勻，離心，得到探針混合物；

(4)將20μl探針混合物滴于載玻片的雜交區(qū)域，立即加蓋玻片，封片膠封住蓋玻片邊緣，避免蓋玻片與玻片之間產(chǎn)生氣泡；

(5)將載玻片置于雜交儀中，在變性溫度為83℃，變性時(shí)間為5min，雜交溫度為42℃的條件下雜交30min；

(6)去除載玻片上的封片膠和蓋玻片，在67±1℃下干燥2h，然后將其浸入含0.3％(v/v)np-40的0.4×ssc溶液中漂洗2min，其間晃動(dòng)1～2次，并在暗處自然晾干；

(7)在載玻片的雜交區(qū)域中滴加10μldapi復(fù)染劑，加蓋蓋玻片，避免蓋玻片與載玻片之間產(chǎn)生氣泡，靜置10分鐘，用熒光顯微鏡鏡檢。若該樣本為正常細(xì)胞，則可看到兩紅兩綠的熒光信號，若該樣本為發(fā)生bcr/abl基因融合的細(xì)胞，則會(huì)有紅色熒光信號和綠色熒光信號重疊在一起形成黃色熒光信號。

(8)計(jì)算每個(gè)基因紅、綠色熒光強(qiáng)度比值(ratio值)：隨機(jī)選取熒光顯微鏡內(nèi)觀察的30個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)30個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核中的紅信號總數(shù)和綠信號總數(shù)，按照下列公式計(jì)算：

ratio值＝30個(gè)細(xì)胞核中紅信號總數(shù)/30個(gè)細(xì)胞核中綠信號總數(shù)。

(9)根據(jù)計(jì)算的ratio值判斷檢測結(jié)果：

若ratio值<2，則該樣本為陰性結(jié)果，說明該樣本無bcr/abl基因融合；若ratio值>2或有成簇紅色信號，則該樣本為陽性結(jié)果，說明該樣本存在bcr/abl基因融合。

c、兩種方法的結(jié)果分析

經(jīng)檢驗(yàn)，本發(fā)明提供的fish方法與傳統(tǒng)fish相比，對樣本陰陽性判斷的一致性超過99.9％，而傳統(tǒng)fish方法需要雜交16小時(shí)，本發(fā)明的fish方法只需雜交30分鐘。且本發(fā)明的fish方法背景更干凈，熒光信號更清晰，如圖1所示。

最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。