本發(fā)明屬于分子生物學領域，特別涉及一種探針組和試劑盒，通過使用熒光原位雜交的手段，快速檢測樣品中的alk基因斷裂。

背景技術：

肺癌是中國乃至全球致死率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌(non-smallcelllungcancer，nsclc)是最常見的亞型，約占肺癌發(fā)病率的85％。近年來，隨著對nsclc分子生物學特征的深入研究，晚期nsclc已逐漸進入到靶向驅動基因指導的個體化治療時代。特別是針對alk基因斷裂陽性的nsclc分子亞型。間變性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphomakinase，alk)基因斷裂陽性是nsclc的一個特定分子亞型，約占nsclc的5％左右。alk是一種受體酪氨酸激酶，為胰島素受體(ir)超家族成員。alk主要表達于發(fā)育中的中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，在成人中的正常肺等組織中不表達，說明alk對神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能發(fā)揮了作用。雖然alk的正常生理功能尚未完全闡明，但是當其與其它基因發(fā)生融合重排表達，則具有高度的致癌性?？诉蛱婺岬人幬锟梢詫lk斷裂引發(fā)的nsclc進行特異性的靶向治療。

由于上述原因，alk基因斷裂被列入nsclc臨床必檢項目，目前臨床上檢測alk基因斷裂的常見方法有免疫組化(ihc)和熒光原位雜交(fish)，其中fish是檢測alk基因斷裂的金標準。但傳統(tǒng)fish使用的是基因組探針，探針總長度達100kb以上，由于探針長度極長，覆蓋范圍極大，使得部分序列不可避免地出現(xiàn)非特異性雜交，導致背景偏高；同時，過長的探針也經(jīng)常導致熒光信號點發(fā)散，不利于信號的確認和統(tǒng)計。由于傳統(tǒng)fish探針單位長度的熒光強度有限，用減少探針長度的方法來解決上述問題，會使得熒光信號強度降低，不利于檢測。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種探針組，通過熒光原位雜交的手段，建立一種快速、靈敏、特異性地檢測樣品中alk基因斷裂的方法。

本發(fā)明的快速檢測alk基因斷裂的方法與傳統(tǒng)fish方法相比，具有背景低，信號點集中，特異性強，速度快等優(yōu)點，能快速、高效地檢測alk基因斷裂。

本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明提供了一種快速檢測alk基因斷裂的探針組，所述探針組由接觸探針、擴增探針和熒光探針三種探針組成，所述接觸探針包括接觸探針1和接觸探針2，所述擴增探針包括擴增探針1和擴增探針2，所述熒光探針包括熒光探針1和熒光探針2，其中，接觸探針1、擴增探針1、熒光探針1、接觸探針2、擴增探針2和熒光探針2的堿基序列分別為：

接觸探針1：

5’-tagttggtaaggtaacggcttaccaaggca(gtatjcgcjctgftatjccg)-3’；

擴增探針1：

5’-cggfatajcagfgcgfatac(tcfacgjcfctajggafaafg)-3’；

熒光探針1：5’-cy3-jttjtccftagjgfcgtjga-3’；

接觸探針2：

5’-aggcgactttctggtctgtaactgacgctg(agtfajcgcfgtafcaajtj)-3’；

擴增探針2：

5’-fafttgjtacjgcgftjact(gcafjttaccgfajjtacft)-3’；

熒光探針2：5’-fitc-ajgtafftjcggtaafjtgc-3’。

優(yōu)選地，所述熒光探針1和所述熒光探針2的5’端用熒光基團標記。

優(yōu)選地，所述熒光基團為cy3、fitc或fam。

進一步地，所述接觸探針1、所述擴增探針1和所述熒光探針1用于檢測alk基因斷裂位點n端，所述熒光探針1將alk基因斷裂位點n端標記為紅色熒光，所述接觸探針2、所述擴增探針2和所述熒光探針2用于檢測alk基因斷裂位點c端，所述熒光探針2將alk基因斷裂位點n端標記為綠色熒光，所述接觸探針、所述擴增探針和所述熒光探針的堿基序列中的f表示甲基化的c，j表示甲基化的g，引入f/j兩種天然基因組dna中不存在的堿基，可以有效地減少非特異性雜交，提高檢測的特異性。

本發(fā)明還提供了一種用于快速檢測alk基因斷裂的試劑盒，所述試劑盒包括雜交液和上述由接觸探針、擴增探針和熒光探針三種探針組成的探針組。

進一步地，所述雜交液包括：1～10％(w/v)硫酸葡聚糖，100～1000mmnacl，10～40％(v/v)去離子甲酰胺，5mmna2edta，0.01～1％(v/v)tritonx-100，5～200mmtris-hcl(ph7.5)，0.1～1％的吐溫80，0.1～1％的三甲銨乙內酯。

本發(fā)明最后提供了一種上述試劑盒快速檢測alk基因斷裂的方法，包括如下步驟：

(1)吸取10μl樣本滴在載玻片上，在56℃下烘干，使樣本固定在載玻片上；

(2)在室溫下將載玻片浸入二甲苯中脫蠟2次，每次10min，隨后在100％乙醇中浸泡5min，接著依次浸入100％乙醇、85％乙醇和70％乙醇中各2min復水，在90℃下浸入純化水中煮20-30min，每5min將載玻片取出觀察一次，防止樣本脫落，取出載玻片，在室溫下將其依次浸入70％乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2min脫水，自然晾干；

(3)分別吸取0.5μl的接觸探針1、接觸探針2、擴增探針1、擴增探針2、熒光探針1和熒光探針2，加入到17μl雜交緩沖液中，混勻，離心，得到探針混合物；

(4)將20μl探針混合物滴于載玻片的雜交區(qū)域，蓋片，膠水封邊，置于雜交儀中雜交30min；

(5)去除載玻片上的封片膠和蓋玻片，在67±1℃下干燥2h，然后將其浸入含0.3％(v/v)np-40的0.4×ssc溶液中漂洗2min，其間晃動1～2次，在暗處自然晾干；

(6)將10μldapi復染劑滴于載玻片的雜交區(qū)域，加蓋蓋玻片，靜置10min，用熒光顯微鏡鏡檢。

本發(fā)明的技術要點或原理：熒光原位雜交(flourescenceinsituhybridization，fish)是一種應用標記有熒光物質的探針，通過雜交的方法來檢測細胞或組織內特異性dna或rna的方法；傳統(tǒng)的熒光原位雜交由于單條探針的熒光強度有限，只能通過用多條探針共同作用的方法來提高熒光信號強度，這些探針單條長度約200～500bp，覆蓋總計高達100kb以上的基因組區(qū)域。由于探針數(shù)量多，覆蓋范圍廣，不可避免的有部分探針會產生非特異性雜交，從而導致背景上升。同時，由于探針的覆蓋范圍過大，很多時候熒光信號不能精確地聚成一個點，而是會發(fā)散開來，影響檢測和結果判讀，此外，傳統(tǒng)fish檢測需經(jīng)歷長達16小時的雜交，檢測時間長，檢測效率低。

本發(fā)明通過引入接觸探針、擴增探針和熒光探針三種探針，并通過這三種探針與靶基因(alk)的相互作用，將熒光信號放大400倍，且雜交時間僅需要30分鐘；本發(fā)明通過在三種探針中引入f(甲基化的c)和j(甲基化的g)兩種天然dna中不存在的堿基，來提高三種探針相互作用的精度，有效地避免非特異性雜交。

本發(fā)明通過大量實驗，確定熒光原位雜交的最佳溫度為42-58℃，甲酰胺最佳濃度為10-40％，分子信標的最佳濃度為10ng/l。

本發(fā)明熒光探針5’端的熒光基團，包括但不限于cy3、fitc或fam等，可以根據(jù)現(xiàn)有技術進行添加。

與傳統(tǒng)熒光原位雜交方法相比，本發(fā)明提供的方法具有以下優(yōu)點：

1、本發(fā)明的探針組特異性地識別alk基因斷裂位點n、c兩端30bp的序列，只有傳統(tǒng)方法的千分之一，由于探針覆蓋區(qū)域小，產生非特異性擴增的概率大大降低，從而背景更干凈；

2、本發(fā)明的探針組長度只有傳統(tǒng)fish方法的千分之一，由于探針覆蓋區(qū)域小，產生的熒光信號更加集中，同時，由于熒光信號被放大了400倍，熒光信號比傳統(tǒng)方法更易識別和檢測；

3、本發(fā)明的探針組的相互作用dna區(qū)段均在30bp以下，只需要30分鐘就能完成雜交，比傳統(tǒng)fish方法(16小時)的雜交時間大為縮短。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它附圖。

圖1為使用探針檢測alk基因斷裂的熒光圖，其中a為使用傳統(tǒng)fish探針檢測alk基因斷裂的陰性結果，b為使用本發(fā)明的探針組檢測alk基因斷裂的陰性結果，c為使用傳統(tǒng)fish探針檢測alk基因斷裂的陽性結果，d為使用本發(fā)明的探針組檢測alk基因斷裂的陽性結果。

具體實施方式

下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產品。

實施例1：接觸探針、擴增探針和熒光探針三種探針的設計和合成

(1)通過序列比對和高級結構分析，選取alk基因斷裂位點兩端各30bp的序列分別作為檢測靶位點1和檢測靶位點2，其堿基序列分別為：

靶位點1：5’-tgccttggtaagccgttaccttaccaacta-3’

靶位點2：5’-cagcgtcagttacagaccagaaagtcgcct-3’

(2)根據(jù)靶位點序列，設計互補的探針序列，并在其3’端添加20組20堿基的重復序列，構成接觸探針1和接觸探針2，其堿基序列分別為：

接觸探針1：

5’-tagttggtaaggtaacggcttaccaaggca(gtatjcgcjctgftatjccg)20-3’

接觸探針2：

5’-aggcgactttctggtctgtaactgacgctg(agtfajcgcfgtafcaajtj)20-3’

重復序列經(jīng)dna序列比對，和人類基因組上任何區(qū)段不匹配，不會產生非特異性雜交，并且通過引入非天然的堿基f和j，進一步降低非特異性信號產生的可能性；

(3)根據(jù)各自接觸探針的重復序列，設計相應的擴增探針1和擴增探針2，其堿基序列分別為：

擴增探針1：

5’-cggfatajcagfgcgfatac(tcfacgjcfctajggafaafg)20-3’

擴增探針2：

5’-fafttgjtacjgcgftjact(gcafjttaccgfajjtacft)20-3’

擴增探針的3’端也帶有20組20堿基的重復序列，經(jīng)經(jīng)dna序列比對，和人類基因組上任何區(qū)段不匹配，不會產生非特異性雜交，并且通過引入非天然的堿基f和j，進一步降低非特異性信號產生的可能性；

(4)設計相應的熒光探針1和熒光探針2，其堿基序列分別為：

熒光探針1：5’-cy3-jttjtccftagjgfcgtjga-3’

熒光探針2：5’-fitc-ajgtafftjcggtaafjtgc-3’

在本實施例中，所述熒光探針1和所述熒光探針2的5’端用熒光基團標記。所述熒光基團包括但不限于fitc、fam或cy3等，可以根據(jù)現(xiàn)有技術進行添加。

(5)人工設計合成相應的分子信標

在本實施例中，通過對分子信標做熱變性曲線實驗，確定熒光原位雜交的最佳溫度為42-58℃，甲酰胺最佳濃度為10-40％，分子信標最佳濃度為10ng/l。

實施例2：傳統(tǒng)fish探針和本發(fā)明的探針組檢測alk基因斷裂

a、傳統(tǒng)fish探針檢測

使用傳統(tǒng)fish探針檢測alk基因斷裂的方法，包括以下步驟：

(1)吸取10μl樣本滴在載玻片上，在56℃下烘干，使樣本固定在載玻片上；

(2)在室溫下將載玻片浸入二甲苯中脫蠟2次，每次10min，隨后在100％乙醇中浸泡5min，接著依次浸入100％乙醇、85％乙醇和70％乙醇中各2min復水，在90℃下浸入純化水中煮20-30min，每5min將載玻片取出觀察一次，防止樣本脫落，取出載玻片，在室溫下將其依次浸入70％乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2min脫水，自然晾干；

(3)吸取3μl探針加入到7μl雜交緩沖液中，輕彈離心管底部混勻后短暫離心，得到探針混合物；

(4)將10μl探針混合物滴于載玻片的雜交區(qū)域，立即加蓋玻片，封片膠封住蓋玻片邊緣，避免蓋玻片與玻片之間產生氣泡；

(5)將載玻片置于雜交儀中，在變性溫度為83℃，變性時間為5min，雜交溫度為42℃的條件下雜交16h；

(6)去除載玻片上的封片膠和蓋玻片，在67±1℃下干燥2h，然后將其浸入含0.3％(v/v)np-40的0.4×ssc溶液中漂洗2min，其間晃動載玻片1～2次；

(7)在室溫下將載玻片浸入含0.1％(v/v)np-40的2×ssc溶液中漂洗30s，其間晃動載玻片1～2次；

(8)在室溫下將載玻片依次浸入70％乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2min脫水，然后在暗處自然晾干；

(9)在載玻片的雜交區(qū)域中滴加10μldapi復染劑，加蓋蓋玻片，避免蓋玻片與載玻片之間產生氣泡。靜置10分鐘，用熒光顯微鏡鏡檢。

b、本發(fā)明的探針檢測

使用本發(fā)明的探針組檢測alk基因斷裂的方法，包括以下步驟：

(1)吸取10μl樣本滴在載玻片上，在56℃下烘干，使樣本固定在載玻片上；

(2)在室溫下將載玻片浸入二甲苯中脫蠟2次，每次10min，隨后在100％乙醇中浸泡5min，接著依次浸入100％乙醇、85％乙醇和70％乙醇中各2min復水，在90℃下浸入純化水中煮20-30min，每5min將載玻片取出觀察一次，防止樣本脫落，取出載玻片，在室溫下將其依次浸入70％乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2min脫水，自然晾干；

(3)分別吸取0.5μl的接觸探針1、接觸探針2、擴增探針1、擴增探針2、熒光探針1和熒光探針2，加入到17μl雜交緩沖液中，混勻，離心，得到探針混合物；

(4)將20μl探針混合物滴于載玻片的雜交區(qū)域，立即加蓋玻片，封片膠封住蓋玻片邊緣，避免蓋玻片與玻片之間產生氣泡；

(5)將載玻片置于雜交儀中，在變性溫度為83℃，變性時間為5min，雜交溫度為42℃的條件下雜交30min；

(6)去除載玻片上的封片膠和蓋玻片，在67±1℃下干燥2h，然后將其浸入含0.3％(v/v)np-40的0.4×ssc溶液中漂洗2min，其間晃動1～2次，并在暗處自然晾干；

(7)在載玻片的雜交區(qū)域中滴加10μldapi復染劑，加蓋蓋玻片，避免蓋玻片與載玻片之間產生氣泡，靜置10分鐘，用熒光顯微鏡鏡檢。若該樣本為正常細胞，則可看到兩個黃色信號，或緊挨在一起的紅色、綠色熒光信號，若該樣本為發(fā)生alk基因斷裂的細胞，則會有分散開來的紅色、綠色熒光信號。

(8)計算每個基因紅、綠色熒光強度比值(ratio值)：隨機選取熒光顯微鏡內觀察的30個細胞，統(tǒng)計30個細胞的細胞核中的紅信號總數(shù)和綠信號總數(shù)，按照下列公式計算：

ratio值＝30個細胞核中紅信號總數(shù)/30個細胞核中綠信號總數(shù)。

(9)根據(jù)計算的ratio值判斷檢測結果：

若ratio值<2，則該樣本為陰性結果，說明該樣本無alk基因斷裂；若ratio值>2，則該樣本為陽性結果，說明該樣本存在alk基因斷裂。

c、兩種方法的結果分析

經(jīng)檢驗，本發(fā)明提供的fish方法與傳統(tǒng)fish方法相比，對樣本陰陽性判斷的一致性超過99.9％，但傳統(tǒng)fish方法需要雜交16小時，本發(fā)明的fish方法只需雜交30分鐘。且本發(fā)明的fish方法背景更干凈，熒光信號更清晰，如圖1所示。

最后所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的實質和范圍。