本發(fā)明屬于天然高分子材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種化學(xué)交聯(lián)的天然生物大分子基水凝膠及其制備方法。

背景技術(shù)：

中國(guó)是大豆的故鄉(xiāng)，也是大豆制品的發(fā)源地，大豆蛋白作為一種可再生資源，具有來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉，生物相容性好，降解性好等優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的天然材料。大豆分離蛋白是大豆蛋白分離純化的產(chǎn)物，其中蛋白質(zhì)含量不低于90%，是制備大豆蛋白材料的主要原料。在目前的文獻(xiàn)報(bào)道中，有不少關(guān)于大豆分離蛋白材料的應(yīng)用，如塑料、凝膠、膜、黏合劑以及生物醫(yī)用材料等。

水凝膠是親水性高分子形成的三維立體網(wǎng)絡(luò)，在水中溶脹但不溶于水。許多水凝膠可以在溫和的、生物相容的環(huán)境下形成，是一類(lèi)極具前景的生物醫(yī)用高分子材料。對(duì)大豆分離蛋白來(lái)說(shuō)，關(guān)于凝膠制備方法的研究由來(lái)已久，但遺憾的是，至今仍然沒(méi)有一種很好的制備大豆分離蛋白凝膠方法來(lái)改善其脆弱的力學(xué)，打破由此帶來(lái)的在應(yīng)用上的極大限制。在目前制備大豆分離蛋白凝膠的方法中，熱致凝膠、冷致凝膠、高壓反應(yīng)制備得到的凝膠，形成凝膠的作用力主要為疏水相互作用和氫鍵作用，因此穩(wěn)定性差，力學(xué)性能很弱。與之相比，化學(xué)交聯(lián)方法得到的水凝膠穩(wěn)定性強(qiáng)，力學(xué)性能也有所提升。目前已報(bào)道的大豆分離蛋白化學(xué)交聯(lián)制備水凝膠的文獻(xiàn)中，已經(jīng)使用的交聯(lián)劑有有機(jī)分子醛類(lèi)（如戊二醛等）、生物活性酶（如轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶等）、以及天然交聯(lián)劑京尼平等。這些方法制備得到的水凝膠力學(xué)性能有了一定提升，但仍舊不能滿(mǎn)足應(yīng)用需要。比如，固含量8wt%的大豆分離蛋白溶液，使用戊二醛交聯(lián)法，得到的凝膠儲(chǔ)能模量只有1.7kpa左右；而對(duì)于酶交聯(lián)和京尼平交聯(lián)得到的水凝膠，其儲(chǔ)能模量均在1.0kpa以下。此外，以上凝膠的制備方法還存在以下兩方面問(wèn)題：一方面，有機(jī)分子的殘留會(huì)使水凝膠具有一定的細(xì)胞毒性，限制了其在生物醫(yī)用領(lǐng)域的應(yīng)用；另一方面，大部分凝膠制備方法中，需要對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行乙?；⒏邷丶訜岬阮A(yù)處理，并且形成凝膠的時(shí)間在幾個(gè)小時(shí)以上，這使得大豆分離蛋白凝膠的制備過(guò)程變得更加繁瑣和復(fù)雜。因而，如何在不影響大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)和保證其天然高分子性質(zhì)的前提下，能夠通過(guò)簡(jiǎn)單、快捷的方法制備力學(xué)性能好，同時(shí)具有良好生物相容性的大豆分離蛋白水凝膠仍然是有待解決的問(wèn)題。

本發(fā)明克服大豆分離蛋白水凝膠力學(xué)性能弱的缺點(diǎn)，提供了一種具有可調(diào)力學(xué)性能，特別是具有優(yōu)良彈性的大豆分離蛋白基水凝膠及其制備方法。本發(fā)明是在常溫下將大豆分離蛋白和氧化葡聚糖水溶液進(jìn)行混合，然后靜置一段時(shí)間，即可制備成水凝膠。其反應(yīng)機(jī)理是氧化葡聚糖可以作為大分子交聯(lián)劑，通過(guò)其含有的醛基和大豆分離蛋白分子上的官能團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)，起到化學(xué)交聯(lián)的作用。通過(guò)調(diào)節(jié)體系ph，可以有效調(diào)控凝膠時(shí)間和凝膠強(qiáng)度。相比已見(jiàn)報(bào)道的大豆蛋白基水凝膠，本發(fā)明制備的大豆分離蛋白基水凝膠力學(xué)性能得到了極大提升，并表現(xiàn)出超強(qiáng)的彈性。壓縮測(cè)試結(jié)果顯示，該大豆蛋白基天然高分子水凝膠最大可承受90%的壓縮形變，其壓縮強(qiáng)度可達(dá)400kpa；多個(gè)配比的水凝膠在壓縮形變到達(dá)80%時(shí)水凝膠仍可呈現(xiàn)幾乎完全的回彈性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，該大豆蛋白基天然高分子水凝膠具有良好的生物相容性。此外，如果在制備過(guò)程中，在大豆分離蛋白水溶液中添加功能性無(wú)機(jī)納米粒子（如金納米團(tuán)簇、金納米顆粒等），以及抗癌或抗生藥物分子（如鹽酸阿霉素、阿莫西林等），可以使獲得的大豆蛋白基天然高分子水凝膠具有熒光成像、光熱轉(zhuǎn)換、藥物緩釋、抗癌、抑菌等性能，可用于食品加工、生物傳感、生物醫(yī)藥及納米功能材料等領(lǐng)域。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服大豆分離蛋白水凝膠力學(xué)性能弱的缺點(diǎn)，提供一種具有可調(diào)力學(xué)性能，特別是具有較高強(qiáng)度和優(yōu)良彈性的大豆分離蛋白基水凝膠及其制備方法。

本發(fā)明提供的高強(qiáng)度、高彈性的大豆蛋白基天然高分子水凝膠的制備方法，具體步驟為：

（1）制備大豆分離蛋白水溶液和氧化葡聚糖水溶液，使其最終濃度均為5-12wt%；

（2）在步驟（1）所制得的大豆分離蛋白溶液中加入氫氧化鈉水溶液，調(diào)節(jié)其ph在7.0-12.0范圍內(nèi)；

（3）在步驟（2）所得的大豆分離蛋白溶液中加入氧化葡聚糖水溶液，混勻靜置0.1-120min，即得到大豆蛋白基天然高分子水凝膠；

本發(fā)明中，所述的大豆分離蛋白水溶液可以由市售的大豆分離蛋白經(jīng)氫鍵破壞劑（如鹽酸胍）和二硫鍵破壞劑（如二硫蘇糖醇）處理后，再透析除去氫鍵破壞劑和二硫鍵破壞劑后獲得，也可由其他方法制備獲得。

本發(fā)明中，所采用的氧化葡聚糖可以由葡聚糖經(jīng)氧化劑（如高碘酸鈉）氧化反應(yīng)制得，也可由其他方法制備或直接購(gòu)買(mǎi)。

本發(fā)明中，用以調(diào)節(jié)大豆分離蛋白水溶液ph值的物質(zhì)為氫氧化鈉水溶液，其濃度為0.1-1.0mol/l；也可為其他可以調(diào)節(jié)溶液ph的溶液或物質(zhì)。

本發(fā)明中，所用大豆分離蛋白與氧化葡聚糖質(zhì)量比為95:5到50:50。

本發(fā)明中，步驟（1）中所述的大豆分離蛋白水溶液中還可包含功能性無(wú)機(jī)納米粒子（如金納米團(tuán)簇、金納米顆粒等），以及抗癌或抗生藥物分子（如鹽酸阿霉素、鹽酸四環(huán)素）等。

本發(fā)明所述的制備方法獲得的高強(qiáng)度、高彈性的大豆蛋白基天然高分子水凝膠，最大可承受90%的壓縮形變，其壓縮強(qiáng)度可達(dá)400kpa；在壓縮形變到達(dá)80%時(shí)水凝膠仍可呈現(xiàn)幾乎完全的回彈性。

本發(fā)明制備的功能性大豆蛋白基天然高分子水凝膠，具有良好的生物相容性，并具有熒光成像、光熱轉(zhuǎn)換、藥物緩釋、抗癌、抑菌等性能，可用于食品加工、生物傳感、生物醫(yī)藥及納米功能材料等領(lǐng)域。

采用本發(fā)明方法制備大豆蛋白基天然高分子水凝膠，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

（1）本發(fā)明所述的水凝膠原料為來(lái)源廣泛、成本低廉的大豆分離蛋白，制得的水凝膠具有良好的生物相容性和生物降解性。

（2）本發(fā)明采用的葡聚糖是一種天然多糖，由葡聚糖改性得到的氧化葡聚糖仍保留了天然葡聚糖良好的生物相容性。

（3）本發(fā)明所述的凝膠制備方法，僅通過(guò)混合靜置即可形成均一穩(wěn)定的凝膠，制備方法簡(jiǎn)單便捷，重復(fù)性好。

（4）本發(fā)明所述的凝膠制備方法，可以通過(guò)調(diào)節(jié)氧化葡聚糖的含量和體系ph值來(lái)有效調(diào)控凝膠的形成時(shí)間和力學(xué)性能。

（5）相比以往的大豆蛋白基凝膠材料，本發(fā)明制備的大豆分離蛋白基水凝膠的力學(xué)性能得到了顯著的提升，并表現(xiàn)出超強(qiáng)的彈性。

（6）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，本發(fā)明制得的大豆蛋白基天然高分子水凝膠具有良好的生物相容性。

（7）本發(fā)明所述大豆蛋白基天然高分子水凝膠可以作為載體，制備多功能的高強(qiáng)度、高彈性的水凝膠材料。

附圖說(shuō)明

圖1為大豆分離蛋白/氧化葡聚糖水凝膠的壓縮測(cè)試力學(xué)性能曲線。

圖2為大豆分離蛋白/氧化葡聚糖水凝膠的循環(huán)壓縮曲線。

圖3為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中大豆分離蛋白/氧化葡聚糖水凝膠表面細(xì)胞生長(zhǎng)情況的熒光顯微鏡圖像。

圖4為365nm紫外光照射下金納米團(tuán)簇@大豆分離蛋白/氧化葡聚糖水凝膠的熒光圖像。

圖5為鹽酸四環(huán)素@大豆分離蛋白/氧化葡聚糖水凝膠對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈圖像。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，以進(jìn)一步闡述本發(fā)明。有必要在此指出的是，實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容做出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。

實(shí)施例1

取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10wt%的大豆分離蛋白水溶液，加入濃度0.5mol/l的氫氧化鈉水溶液，調(diào)節(jié)大豆分離蛋白水溶液的ph至9.0；然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10wt%的氧化葡聚糖水溶液，使大豆分離蛋白與氧化葡聚糖的質(zhì)量比為70:30。將上述溶液混合均勻后倒入模具，在室溫（25℃）下靜置1.5min，即可得到大豆分離蛋白/氧化葡聚糖水凝膠。該凝膠在壓縮應(yīng)變?yōu)?7%時(shí)斷裂，其斷裂強(qiáng)度為401kpa，如圖1所示；循環(huán)壓縮測(cè)試中，樣品可以在壓縮應(yīng)變80%后實(shí)現(xiàn)完好的回彈，幾乎沒(méi)有滯后圈，如圖2所示。用pbs漂洗至中性后進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，3天的培養(yǎng)期內(nèi)細(xì)胞的存活率保持在95%以上，未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。

實(shí)施例2

取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9wt%的大豆分離蛋白水溶液，加入濃度1.0mol/l的氫氧化鈉水溶液，調(diào)節(jié)大豆分離蛋白水溶液的ph至12.0；然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)9wt%的氧化葡聚糖水溶液，使大豆分離蛋白與氧化葡聚糖的質(zhì)量比為60:40。混合倒入模具，在室溫（25℃）下靜置0.1min，即可得到大豆分離蛋白/氧化葡聚糖水凝膠。該凝膠在壓縮應(yīng)變?yōu)?8%時(shí)斷裂，其斷裂強(qiáng)度為376kpa；循環(huán)壓縮測(cè)試中，樣品可以在壓縮應(yīng)變80%后實(shí)現(xiàn)完好的回彈，幾乎沒(méi)有滯后圈。用pbs漂洗至中性后進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，3天的培養(yǎng)期內(nèi)細(xì)胞的存活率保持在95%以上，未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，細(xì)胞可以在凝膠的表面良好生長(zhǎng)，如圖3所示。

實(shí)施例3

將大豆分離蛋白粉末加入一定量的金納米團(tuán)簇水溶液，震蕩溶解，使大豆分離蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8wt%。然后加入8wt%的氧化葡聚糖水溶液，使大豆分離蛋白與氧化葡聚糖的質(zhì)量比為95:5?；旌虾笤谑覝叵拢?5℃）靜置35min，即可得到負(fù)載有金納米團(tuán)簇的復(fù)合水凝膠。該凝膠在365nm的紫外光照射下呈現(xiàn)均勻的粉色熒光，如圖4所示，表明金納米團(tuán)簇可以在大豆分離蛋白/氧化葡聚糖水凝膠中分散均勻，且大豆分離蛋白和氧化葡聚糖的引入并不會(huì)影響其熒光特性。因此，大豆分離蛋白基水凝膠可以作為基質(zhì)，穩(wěn)定負(fù)載金納米團(tuán)簇，可將該大豆分離蛋白基水凝膠用于熒光成像領(lǐng)域。

實(shí)施例4

將大豆分離蛋白粉末加入一定量的金納米顆粒水溶液，震蕩溶解，使大豆分離蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7wt%。然后加入7wt%的氧化葡聚糖水溶液，使大豆分離蛋白與氧化葡聚糖的質(zhì)量比為90:10。混合后在室溫下（25℃）靜置50min，即得到負(fù)載有金納米顆粒的復(fù)合水凝膠。將該凝膠用808nm的近紅外光照射，在5min內(nèi)從室溫升高到38.8℃，達(dá)到63.8℃，超過(guò)了一般癌細(xì)胞的耐受溫度（43℃），表明該凝膠具有良好的光熱轉(zhuǎn)換性能，可用于光熱治療領(lǐng)域。

實(shí)施例5

將大豆分離蛋白粉末加入一定量的鹽酸阿霉素水溶液，震蕩溶解，使大豆分離蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6wt%。然后加入6wt%的氧化葡聚糖水溶液，使大豆分離蛋白與氧化葡聚糖的質(zhì)量比為80:20?；旌虾笤谑覝叵拢?5℃）靜置95min，即可得到負(fù)載有抗癌藥物鹽酸阿霉素的復(fù)合水凝膠。在37℃下，pbs(ph=7.4)緩沖液中考察凝膠的藥物緩釋行為。第一天，凝膠中鹽酸阿霉素的釋放比例為11%；七天后，鹽酸阿霉素的釋放比例為28%，并呈現(xiàn)持續(xù)釋放的趨勢(shì)。該結(jié)果表明大豆分離蛋白/氧化葡聚糖水凝膠對(duì)于鹽酸阿霉素具有良好的緩釋作用，有望作為藥物緩釋載體，用于癌癥治療領(lǐng)域。

實(shí)施例6

將大豆分離蛋白粉末加入一定量的鹽酸四環(huán)素水溶液，震蕩溶解，使大豆分離蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5wt%。然后加入5wt%的氧化葡聚糖水溶液，使大豆分離蛋白與氧化葡聚糖的質(zhì)量比為50:50?；旌虾笤谑覝叵拢?5℃）靜置120min，即可得到負(fù)載有抗生素鹽酸四環(huán)素的復(fù)合水凝膠。取100μｌ載藥復(fù)合凝膠，置于鋪有金黃色葡萄球菌菌液的培養(yǎng)基上，再放入37℃生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，可觀察到明顯的抑菌圈（如圖5）。該結(jié)果表明凝膠釋放出的鹽酸四環(huán)素能夠有效抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)，有望用于抗菌材料及傷口敷料領(lǐng)域。