本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)檢測領(lǐng)域，具體涉及一種檢測日光蜂對蘋果綿蚜寄生率及產(chǎn)卵量的方法。

背景技術(shù)：

蘋果綿蚜eriosomalanigerum(hausmann)是蘋果屬的重要害蟲，它的繁殖力強(qiáng)，因為身上有一層棉絮狀物質(zhì)，致使噴灑藥液時，對其造成的傷害極小，普通的化學(xué)藥劑根本殺害不了它。近年來，在我國危害日趨嚴(yán)重，并有進(jìn)一步擴(kuò)大蔓延的趨勢。蘋果綿蚜主要以成蟲和若蟲整年寄生在蘋果樹上為害，常在蘋果枝干及根部形成瘤狀蟲癭，直接影響蘋果樹的生長發(fā)育，花芽的分化，果實的品質(zhì)變劣；蟲癭逐漸擴(kuò)大后，破裂的傷口招致蘋果的腐爛病及其他病癥，使農(nóng)民受益減產(chǎn)。

蘋果綿蚜體表分泌大量的白色棉絮狀蠟質(zhì)，阻擋化學(xué)藥劑防治，并且化學(xué)防治污染環(huán)境、造成農(nóng)藥殘留，而采用生物方法防治蘋果綿蚜是害蟲防治的可持續(xù)治理策略，日光蜂aphelinusmali(haldeman)是蘋果綿蚜的最重要的內(nèi)寄生蜂，專一性強(qiáng)，也是我國蘋果綿蚜的優(yōu)勢種天敵，在蘋果綿蚜的所有天敵中，日光蜂對蘋果綿蚜的制約作用最大，發(fā)生高峰期寄生率高達(dá)80％以上。

日光蜂通過把卵產(chǎn)在蘋果綿蚜體內(nèi)，達(dá)到對蘋果綿蚜寄生作用，卵在蘋果綿蚜體內(nèi)發(fā)育為幼蟲，并吸取其營養(yǎng)物質(zhì)，在日光蜂化蛹前后，蘋果綿蚜變黑死亡，以前統(tǒng)計日光蜂寄生率是以蘋果綿蚜變黑死亡為標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計被日光蜂寄生的蘋果綿蚜數(shù)量的，由于日光蜂在田間寄生蘋果綿蚜后，在日光蜂發(fā)育過程中，有部分被日光蜂寄生的蘋果綿蚜?xí)捎谄渌鞌巢妒?、雨水沖刷而丟失，更重要的是在田間，并不是所有日光蜂的卵都能發(fā)育到幼蟲期或蛹期，部分被日光蜂寄生的蘋果綿蚜，日光蜂卵不能孵化或者在沒有發(fā)育到蛹期就死亡了，因此用統(tǒng)計蘋果綿蚜變黑死亡數(shù)量作為日光蜂寄生蘋果綿蚜的數(shù)量是不準(zhǔn)確的，這樣計算得到的寄生率也是不準(zhǔn)確的。日光蜂產(chǎn)卵量統(tǒng)計方法，以前一般采用解剖方法，在解剖鏡下通過解剖蘋果綿蚜，觀察蘋果綿蚜體內(nèi)是否有日光蜂的卵，但是日光蜂的卵長橢圓形，珍珠白顏色，與蘋果綿蚜體液相仿，且極其微小，即使在解剖鏡下也很難辨別，此方法統(tǒng)計日光蜂產(chǎn)卵量不夠準(zhǔn)確，而且費時費工。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測日光蜂對蘋果綿蚜寄生率及產(chǎn)卵量的方法。

申請人在研究中發(fā)現(xiàn)，可以通過pcr檢測的方法來檢測測日光蜂對蘋果綿蚜寄生率及產(chǎn)卵量，再通過分析我國遼寧支系和山東支系兩個日光蜂遺傳支系的遺傳信息，比較了日光蜂和蘋果綿蚜的基因差異，提供了一種檢測日光蜂和蘋果綿蚜的引物，該引物適合于我國遼寧支系和山東支系兩個日光蜂遺傳支系對蘋果綿蚜寄生率及產(chǎn)卵量的檢測，

本發(fā)明所提供的引物，其序列信息如下：

正義引物rgf-coi1-f：5’-agttgcagaagtaaaataagctcg-3’(seqidno:1)；

反義引物rgf-coi1-r：5’-acctgtaataataggagggtttggg-3’(seqidno:2)；

本發(fā)明的引物用來檢測蘋果綿蚜是否被日光蜂寄生以及日光蜂的產(chǎn)卵量；

本發(fā)明再一個方面提供一種日光蜂對蘋果綿蚜寄生率及產(chǎn)卵量檢測方法，步驟如下：

1)田間采集被日光蜂寄生的蘋果綿蚜，記錄采取的蘋果綿蚜的數(shù)量為a；

2)取新羽化的日光蜂，雌雄交配后，把1對雌雄蜂接種在裝有足夠數(shù)量蘋果綿蚜的大型玻璃容器中，置于25℃的培養(yǎng)箱中，每天更換新鮮的蘋果綿蚜，換下被寄生的蘋果綿蚜，直至雌蜂死亡；換下的被寄生蘋果綿蚜放在另外25℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)發(fā)育3天，然后把所有被寄生的蘋果綿蚜收集在一起，記錄總數(shù)量為b；

3)配制裂解液

準(zhǔn)備好200ml以上容量的試劑瓶，洗干凈后用于配制100ml0.05mol/l、ph8.4的tris-hcl，各物質(zhì)的比例如下：

1)tris：0.6055％

2)鹽酸：0.06493％

加水定容至100ml，滅菌后，再按比例加入以下4種試劑：

全部加好后置于4℃冰箱過夜，用于提取時再按比例加入proteinasek8mg(按濃度換算成80μg/ml)，配置完成。(蛋白酶k工作濃度為20mg/ml，配制提取液1ml加4ul)。

4)提取日光蜂dna及(1)和(2)中蘋果綿蚜dna；

5)對步驟4)獲得的日光蜂寄生的蘋果綿蚜dna(1)、(2)為模板，利用上述的一引物在56.1℃的退火溫度進(jìn)行pcr擴(kuò)增，制得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物；

6)對步驟5)獲得的pcr產(chǎn)物(1)、(2)進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳分析，在凝膠成像儀中攝影拍照，獲得電泳圖譜；根據(jù)pcr產(chǎn)物(1)出現(xiàn)750bp左右條帶數(shù)目c，pcr產(chǎn)物(2)出現(xiàn)750bp左右條帶數(shù)目d，計算得到日光蜂對蘋果綿蚜寄生率為c/a*100％；日光蜂產(chǎn)卵量為d。

7)測定蘋果園中日光蜂對蘋果綿蚜的寄生率時，直接從果園中采集帶有蘋果綿蚜的枝條，收集蘋果綿蚜，記錄數(shù)量，然后重復(fù)(3)-(6)步驟，即獲得日光蜂對蘋果綿蚜的寄生率。

優(yōu)選的，所述步驟(2)中每對雌雄蜂提供帶有100頭蘋果綿蚜的蘋果枝條，放在0.1立方米的大型玻璃容器中；

優(yōu)選的，所述步驟(5)中pcr擴(kuò)增的擴(kuò)增體系為13μl；其中，基因組dna溶液2μl，20μm引物0.26μl，5u/μltaq酶0.2μl，10×taqbuffer1.3μl，10mmdntp1.04μl，ddh207.94μl；

優(yōu)選的，所述步驟(5)中pcr擴(kuò)增的擴(kuò)增條件如下：

94℃預(yù)變性4分鐘；94℃變性30秒，56.1℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，進(jìn)行35個循環(huán)；72℃延伸7分鐘。

本發(fā)明能夠檢測日光蜂對蘋果綿蚜寄生的引物能夠擴(kuò)增日光蜂、被寄生的蘋果綿蚜基因組dna中的日光蜂的目的基因。從本發(fā)明的電泳圖譜就可以很清楚地計算出日光蜂產(chǎn)卵量，比解剖的方法精準(zhǔn)簡單；可以準(zhǔn)確地計算出日光蜂對蘋果綿蚜的寄生率，明確日光蜂對蘋果綿蚜的控害效果，克服由于日光蜂卵發(fā)育過程中死亡或部分已被寄生的蘋果綿蚜再被捕食或丟失造成的寄生率偏低現(xiàn)象；另外由于在田間日光蜂活動空間大，在果園自然環(huán)境中，日光蜂在一頭蘋果綿蚜體內(nèi)一般只產(chǎn)一粒卵，因此本發(fā)明為每對日光蜂提供0.1立方米的活動空間，而且提供100頭蘋果綿蚜供其寄生，這樣既保證了日光蜂足夠大的活動空間，而且也滿足了足夠多數(shù)量的寄主，每對日光蜂日光蜂在一頭蘋果綿蚜體內(nèi)一般只產(chǎn)一粒卵，所以利用pcr擴(kuò)增技術(shù)檢測日光蜂技術(shù)可以測定日光蜂產(chǎn)卵量。

附圖說明

圖1：pcr擴(kuò)增技術(shù)檢測日光蜂、蘋果綿蚜及被日光蜂寄生的蘋果綿蚜圖；

圖2：pcr擴(kuò)增技術(shù)檢測田間蘋果綿蚜被日光蜂寄生的寄生率圖；

圖3：pcr擴(kuò)增引物的篩選檢測結(jié)果圖。

具體實施方式

申請人在研究中發(fā)現(xiàn)，在實驗室內(nèi)給日光蜂創(chuàng)造足夠大的活動空間，而且提供足夠多數(shù)量的寄生寄主-蘋果綿蚜情況下，日光蜂也會像在自然環(huán)境中一樣，在一頭蘋果綿蚜體內(nèi)只產(chǎn)一粒卵，所以利用pcr擴(kuò)增技術(shù)檢測日光蜂技術(shù)可以測定日光蜂產(chǎn)卵量。

本發(fā)明中所使用的分子檢測方法均可按照本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)操作，例如《分子克隆實驗指南》第三版(北京：科學(xué)出版社，2002)中的相應(yīng)記載。

在本發(fā)明說明書中，實施例1中所述日光蜂于2016年采集于河北省秦皇島市昌黎和山東省青島市城陽區(qū)蘋果園；實施例2中所述日光蜂于2016年采集于山東省青島市城陽區(qū)蘋果園；實施例3中所述蘋果綿蚜、被日光蜂寄生的蘋果綿蚜于2016年采集于山東省青島市城陽區(qū)蘋果園；實施例4中所述蘋果綿蚜為實驗室內(nèi)用蘋果苗木飼養(yǎng)得到；日光蜂成蟲為從田間采集的被日光蜂寄生的蘋果綿蚜黑蛹于室內(nèi)羽化得到；

實施例所述引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，tris-hcl、taq酶、蛋白酶k均購自青島生物工程公司，其它試劑均為普通市售產(chǎn)品。

實施例1：引物的設(shè)計

申請人前期研究發(fā)現(xiàn)，基于線粒體coi后半段700bp左右基因，我國日光蜂分為hap1、hap2、hap3三種單倍體型，可以分為遼寧支系和山東支系兩個日光蜂遺傳支系，這兩個遺傳支系在生物學(xué)特性以及控害能力方面存在差異，并且研究發(fā)現(xiàn)yl(伊犁)、zt(昭通)、hz(菏澤)、ta(泰安)、lc(聊城)和qd(青島)是山東支系的純種群，dl(大連)、hld(葫蘆島)、qhd(秦皇島)和sjz(石家莊)是遼寧支系的純種群，yt(煙臺)、wf(濰坊)、bd(保定)、jz(晉中)、cc(長治)和yc(運城)是兩個支系的混合種群。因此在研究日光蜂對蘋果綿蚜寄生率及產(chǎn)卵量檢測方法時，應(yīng)全面考慮我國日光蜂的這兩個遺傳支系，找到適合于這兩個遺傳支系日光蜂對蘋果綿蚜寄生率及產(chǎn)卵量檢測方法。

其中線粒體coi的測序步驟如下：

(1)2016年在河北省秦皇島市昌黎和山東省青島市城陽區(qū)蘋果園分別采集日光蜂成蟲、各100頭；

(2)按照常規(guī)的酚-氯仿法提取遼寧和山東支系日光蜂基因組dna，用紫外分光光度計和凝膠電泳雙重檢測其濃度和純度。

(3)根據(jù)已測定的日光蜂coi后段序列和已知的膜翅目昆蟲coi序列設(shè)計擴(kuò)增日光蜂coi的特異性引物；

(4)pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下：

(5)pcr程序為：

94℃預(yù)變性4分鐘；94℃變性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸2分鐘，進(jìn)行35個循環(huán)；72℃延伸7分鐘。

(6)將pcr產(chǎn)物克隆到pmd-18t(takara,jap)載體中，在abi3730全自動測序儀中測序。

(7)獲得我國遼寧支系和山東支系兩個日光蜂遺傳支系coi基因全長序列如下:

山東支系日光蜂coi基因全長序列:

ttatttaatataaattttaggaatttcattaaaagaatgataactaggaggaaaatttataactcattcaattgaattatttatattttttatataaattaatacacgattagaaattaatctatctcataaaataaaaaaaaataataaagttctaactaatgaaattatagaaccaatagatgacactaaatttcaacataaatatctatctggataatctgaatatcgacgaggtatacctcttaatcctaaaaaatgttgaggaaaaaaagttaaatttacaccaataaatattaaaaaaaattgaatttttaatcatttttgatttatagttaaaccaaatattataggaaatcaataaataaatcttccaaaaattgcaaatacagcccctattgataaaacataatgaaaatgagcaactacataataagtatcatgtaaaataatatcaattgaagaatttgataaaataattccagtcaatcccccaacagtaaataaaaaaataaaacctaataatcataaattagtaacattaaatttaatttttattccatttattgaagcaagtcatctaaaaatcttaattcctgtaggaattgcaataattatagttgcagaagtaaaataagctcgagtatctacatccattcctactgtaaatatatgatgtgctcacacaataaaacctaacaacccaatagaaattattgcataaattattcctatagatccaaatacttctttttttatactttcattacaaattatatgagaaattaaaccaaatcctggtaaaattaaaatataaacttctggatgaccaaaaaatcaaaataaatgttgatataaaataggatcaccaccaccagaaggatcaaaaaatgaagtatttaaatttcgatcaaataataacatagtaatagcaccagctaaaacaggtaaagataataataataaaatagcagttaataatattgctcaagaaaataaagaaatattttcaattttataaatttttatgtttaaaattgtacaaataaaattaattgaacctataattgaagaaagaccagcaatatgtaaagaaaaaatagataaatctactgaaggaccactatgtgataaatttaaagataatggaggataaacagttcaacctgtcccagtaccaattccaataaatatactagatattaataatattaaacttggaggtaaaagtcaaaatcttatattatttattcgaggaaaagctatatctactgaacctaatattaaaggaattaagtaattcccaaaccctcctattattacaggtataacaaaaaaaaaaattatagtaaaagcatgactagtaacaatagaattataaatttgatcattaccaattaatgaaccaggattccctaattctaaacgaataattaatcttattgataatcctaaaattcctgctcatattccaaaaataaaatataaaattccaatatatttatgatttgtagaaaataatcataatttcataatttttatgtagtttaaaat。

遼寧支系日光蜂coi基因全長序列:

ttatttaatataaattttaggaatttcattaaaagaatgataactaggaggaaaatttataattcattcaattgaattatttatattttttatataaattaatacgcgattagaaattaatctatcccataaaataaaaaaaaataataaagttctaatcaatgaaattatagaaccaatagatgaaattaaattccaacataaatatctatctggataatctgaatatcgacgaggcataccccttaatcctaaaaaatgttgaggaaaaaaagttaaattaacaccaataaatattaaaaaaaattgaatttttaatcatttttgatttattgataaaccaaacattataggaaatcaataaataaatctcccaaaaattgcaaacacagctcctatcgataaaacataatgaaaatgagcaactacataataagtatcatgtaaaataatatcaattgaagaatttgataaaataataccagttaaacctccaacagtaaataaaaaaataaaacctaataaccataaattagtaacattaaatttaatttttattccatttattgatgcaagtcatctaaaaattttaattcctgttggaattgcaataattatagttgcagaagtaaaataagctcgagtatccacatccatccctactgtaaatatatgatgagcccaaacaataaatcctaacaacccaatagaaattattgcataaattatacctattgatccaaatacttctttttttatactttcattacaaattatatgagaaattaaaccaaaccctggtaaaattaaaatataaacttcaggatgaccaaaaaatcaaaataaatgttgatataaaattggatcaccaccaccagaaggatcaaaaaaagaagtatttaaattacgatcaaataatagtatggtaatagcaccagctaaaacaggtaaagacaataataataaaatagcagttaataatattgcccaagaaaataaagaaatactttcaattttataaatttttatatttaaaattgtacaaataaaattaattgaacctataattgaagataaaccagcaatatgtaaagaaaaaatagataaatctactgaaggaccactatgtgataaatttaaagataatggaggataaacagttcaacctgtcccagtaccaattccaataaatatactagatattaataatattaaacttggaggtaaaagtcaaaatcttatattatttattcgaggaaaagctatatctactgaacctaatattaaaggaattaagtaattcccaaaccctcctattattacaggtataacaaaaaaaaaaattatagtaaaagcatgactagtaacaataaaattataaatttgatcattaccaattaatgaaccaaaattccctaattctaaacaaaaaattaatcttattgataaccctaaaattcctgctcatattccaaaaataaaatataaaattccaatatatttatgatttgtagaaaataatcataatttcataatttttatgtagtttaaaat。

根據(jù)以上獲得的我國遼寧支系和山東支系兩個日光蜂遺傳支系coi基因全長序列，采用primer5軟件設(shè)計引物，共設(shè)計8對引物，通過篩選，最終確定發(fā)現(xiàn)如下的引物擴(kuò)增效果最好、靈敏度最高。

正義引物rgf-coi1-f：5’-agttgcagaagtaaaataagctcg-3’(seqidno:1)；

反義引物rgf-coi1-r：5’-acctgtaataataggagggtttggg-3’(seqidno:2)。

圖3中自左而右的第2、3、8條帶是正義引物rgf-coi1-f和反義引物rgf-coi1-r擴(kuò)增的，而其它引物并未擴(kuò)增出條帶。

實施例2pcr擴(kuò)增技術(shù)檢測日光蜂、蘋果綿蚜及被日光蜂寄生的蘋果綿蚜

(1)在城陽區(qū)蘋果園中采集日光蜂成蟲、蘋果綿蚜及被日光蜂寄生的蘋果綿蚜各5頭；

(2)裂解液的配制

準(zhǔn)備好200ml以上容量的試劑瓶，洗干凈后用于實驗

首先需要配備0.05mol/ltris-hcl(ph8.4)

1)0.1mol/ltris：1.211gtris用于100ml蒸餾水

2)0.1mol/lhcl：0.862ml(常用工業(yè)鹽酸濃度為12m)溶于100ml蒸餾水

3)50ml0.1mol/ltris堿溶液與17.2ml0.1mol/lhcl混合，加水定容至100ml，即成0.05mol/ltris-hcl(ph8.4)(配好后滅菌)

在0.05mol/ltris-hcl(ph8.4)中加入以下試劑

全部加好后置于4℃冰箱過夜，用于提取時再按比例加入proteinasek8mg(按濃度換算成80μg/ml)，配置完成。(蛋白酶k工作濃度為20mg/ml,配制提取液1ml加4ul)。

(3)基因組dna的提取

分別將單頭日光蜂成蟲、蘋果綿蚜及被日光蜂寄生的蘋果綿蚜放入0.2ml離心管中，加入10μl裂解液，用10μl的封口槍頭把日光蜂研磨勻漿后，然后再加入40μl裂解液。置于水浴鍋65℃水浴15min，然后在95℃水浴10min后，分別制得日光蜂成蟲、蘋果綿蚜及被日光蜂寄生的蘋果綿蚜基因組dna溶液，儲存在-20℃以下；

(4)以步驟(3)制得的日光蜂基因組dna為模板，利用如下的引物對被日光蜂寄生的蘋果綿蚜的dna進(jìn)行梯度pcr，目的為了獲得最適合的退火溫度；

引物序列如下：

正義引物rgf-coi1-f：5’-agttgcagaagtaaaataagctcg-3’；

反義引物rgf-coi1-r：5’-acctgtaataataggagggtttggg-3’；

(5)對步驟(4)獲得的pcr產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳分析，獲得電泳圖譜，目的條帶的大小為750bp左右，找出最亮的條帶所對應(yīng)的溫度為56.1℃，此溫度為退火溫度。

(6)日光蜂coi基因的pcr檢測

分別以日光蜂成蟲、蘋果綿蚜及被日光蜂寄生的蘋果綿蚜基因組dna溶液為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，制得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物；

pcr擴(kuò)增體系為13μl

基因組dna溶液2μl，20μm引物0.26μl，5u/μltaq酶0.2μl，10×taqbuffer(緩沖液)1.3μl，10mmdntp1.04μl，ddh207.94μl；

引物序列如下：

正義引物rgf-coi1-f：5’-agttgcagaagtaaaataagctcg-3’；

反義引物rgf-coi1-r：5’-acctgtaataataggagggtttggg-3’；

pcr擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性4分鐘；94℃變性30秒，退火溫度設(shè)置為56.1℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，進(jìn)行35個循環(huán)；72℃延伸7分鐘。

(7)用2％瓊脂糖凝膠電泳對制得的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，在凝膠成像儀中攝影拍照，獲得電泳圖譜，如圖1所示。

圖1中1-5是日光蜂成蟲，6-10是未被日光蜂寄生的蘋果綿蚜，11-15是被日光蜂寄生的蘋果綿蚜，m為2000bpdnamarker，自上而下dna條帶依次是2000、1500、1000、750、500、250、100bp；圖中表明日光蜂成蟲及被日光蜂寄生的蘋果綿蚜均檢測到一條750bp左右的dna條帶，而未被日光蜂寄生的蘋果綿蚜沒有檢測到該條帶，說明該pcr擴(kuò)增技術(shù)能夠區(qū)分被日光蜂寄生的蘋果綿蚜，從而檢測日光蜂對蘋果綿蚜的寄生率以及日光蜂的產(chǎn)卵量。

實施例3檢測田間蘋果綿蚜被日光蜂寄生的寄生率

(1)2016年5月20日田間采集一根帶有蘋果綿蚜的蘋果枝條(部分已被日光蜂寄生)，帶回室內(nèi)用鑷子輕輕取下所有蘋果綿蚜，共計13頭；

(2)將采集的蘋果綿蚜單頭放入0.2ml離心管中，加入10μl裂解液，用10μl的封口槍頭把日光蜂研磨勻漿后，然后再加入40μl裂解液。置于水浴鍋65℃水浴15min，然后在95℃水浴10min后，儲存在-20℃以下；

(3)以步驟(2)制得的基因組dna為模板，對基因組dna中的目的基因進(jìn)行pcr擴(kuò)增，制得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物；

pcr擴(kuò)增體系為13μl：

基因組dna溶液2μl，20μm引物0.26μl，5u/μltaq酶0.2μl，10×taqbuffer(緩沖液)1.3μl，10mmdntp1.04μl，ddh207.94μl；

引物序列如下：

正義引物rgf-coi1-f：5’-agttgcagaagtaaaataagctcg-3’；

反義引物rgf-coi1-r：5’-acctgtaataataggagggtttggg-3’；

pcr擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性4分鐘；94℃變性30秒，56.1℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，進(jìn)行35個循環(huán)；72℃延伸7分鐘。

(4)將如上獲得的pcr產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，eb染色后在紫外凝膠成像儀上成像，如圖2所示，觀察其是否有目的條帶，被日光蜂寄生的蘋果綿蚜有750bp左右dna條帶出現(xiàn)，未被寄生的蘋果綿蚜沒有50bp左右dna條帶出現(xiàn)。

圖2中1-14是被日光蜂寄生的蘋果綿蚜，m為2000bpdnamarker，自上而下dna條帶依次是2000、1500、1000、750、500、250、100bp；圖2表明，13個蘋果綿蚜中共有3個dna樣品檢測到600-700bp的dna條帶，說明3頭蘋果綿蚜被日光蜂寄生了，日光蜂的寄生率為3/13*100％＝23.08％

實施例4日光蜂產(chǎn)卵量檢測

(1)取新羽化的日光蜂，雌雄交配后，把雌蜂接種在裝有100頭蘋果綿蚜的0.1立方米的玻璃容器中，置于25℃的培養(yǎng)箱中，每天更換新鮮的蘋果綿蚜，換下被寄生的蘋果綿蚜，直至雌蜂死亡，新?lián)Q下的被寄生蘋果綿蚜放在另外25℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)發(fā)育3天，然后把所有被寄生的蘋果綿蚜收集在一起，總數(shù)量為500頭，備用；；

(2)將采集的蘋果綿蚜單頭放入0.2ml離心管中，加入10μl裂解液，用10μl的封口槍頭把日光蜂研磨勻漿后，然后再加入40μl裂解液。置于水浴鍋65℃水浴15min，然后在95℃水浴10min后，儲存在-20℃以下；

(3)以步驟(2)制得的基因組dna為模板，對基因組dna中的目的基因進(jìn)行pcr擴(kuò)增，制得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物；

pcr擴(kuò)增體系為13μl：

基因組dna溶液2μl，20μm引物0.26μl，5u/μltaq酶0.2μl，10×taqbuffer(緩沖液)1.3μl，10mmdntp1.04μl，ddh207.94μl；

引物序列如下：

正義引物rgf-coi1-f：5’-agttgcagaagtaaaataagctcg-3’；

反義引物rgf-coi1-r：5’-acctgtaataataggagggtttggg-3’；

pcr擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性4分鐘；94℃變性30秒，56.1℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，進(jìn)行35個循環(huán)；72℃延伸7分鐘。

(4)將如上獲得的pcr產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，eb染色后在紫外凝膠成像儀上成像，觀察其是否有目的條帶，有日光蜂卵的蘋果綿蚜?xí)z測到750bp左右的dna條帶，沒有日光蜂卵的的蘋果綿蚜檢測不到750bp左右的dna條帶(電泳圖譜未列出)。

500個蘋果綿蚜中共有65個dna樣品檢測到600-700bp的dna條帶，說明65個蘋果綿蚜內(nèi)有日光蜂的卵，該日光蜂的產(chǎn)卵量為65粒。

sequencelisting

<110>青島農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種檢測日光蜂對蘋果綿蚜寄生率及產(chǎn)卵量的方法

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