本發(fā)明屬于生物制藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種硫酸軟骨素鈉的制備方法。
背景技術(shù)：
：硫酸軟骨素鈉是從動(dòng)物組織中提取的一種酸性粘多糖類物質(zhì)，多存在于動(dòng)物的軟骨、喉骨、鼻骨、牛馬中膈和氣管中，其分子結(jié)構(gòu)為β-d-葡萄糖醛酸和n-乙酰氨基半乳糖通過β1→3糖苷鍵形成的重復(fù)二糖單位所組成的多糖鏈。硫酸軟骨素鈉主要用于治療風(fēng)濕和類風(fēng)濕疾病的藥物，還具有抗凝、抗癌、抗血栓、降血脂等作用，可用于治療頭痛、偏頭痛、冠心病、心絞痛等癥狀。目前硫酸軟骨素鈉采用的是堿鹽消化沉淀法，即軟骨經(jīng)堿化后，酶解、過濾后用酒精直接沉淀，按此方法生產(chǎn)硫酸軟骨素鈉含量和純度均較低。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，本發(fā)明提供了一種硫酸軟骨素鈉的制備方法，可有效解決現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)硫酸軟骨素鈉含量和純度均較低的問題。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：一種硫酸軟骨素鈉的制備方法，包括以下步驟：(1)提?。簩⒇i軟骨和水按重量比為1:3-5混合，加熱煮沸20-40min，然后加入2-3％豬軟骨重量的氯化鈉，再用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph值至8-11；(2)超聲波酶解：向步驟(1)所得物中加入復(fù)合酶，混合，在以超聲為介質(zhì)的條件下進(jìn)行酶解，超聲時(shí)間為20-30min，超聲功率為250-300w，單次超聲時(shí)間為2-4s，超聲時(shí)間與間歇時(shí)間比為2-5:1，然后離心，過濾，得濾液；其中，所添加的復(fù)合酶占步驟(1)所得物重量的2-5％；(3)微波提取：向步驟(2)所得濾液中繼續(xù)加入復(fù)合酶，混合，然后置于微波提取器中提取，微波功率為250-300w，提取時(shí)間為5-10min；其中，所添加的復(fù)合酶占步驟(2)所得物重量的1-3％；(4)酶解：向步驟(3)所得物中加入蛋白酶，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph值至8-10，置于50-60℃條件下攪拌40-60min，再用鹽酸調(diào)節(jié)ph值至6-6.5，靜置，過濾，得濾液；其中，所添加的蛋白酶占步驟(3)所得物重量的2-4％；(5)沉淀：將步驟(4)所得濾液溫度維持在50-60℃，加入95％乙醇，靜置至沉淀量不再增加，過濾，得沉淀物；其中，步驟(4)所得濾液與95％乙醇的體積比為2-3:1；(6)脫色：將步驟(5)所得沉淀物加入氯化鈉溶液溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph值至8-10，再將溶液升溫至35-40℃，加雙氧水靜置氧化脫色2-3h，過濾，得濾液；其中，所加氯化鈉溶液的質(zhì)量濃度為2-5％，沉淀物占氯化鈉溶液重量的10-15％，雙氧水占氯化鈉溶液的0.5-0.8％；(7)沉淀：將步驟(6)所得濾液用鹽酸調(diào)節(jié)ph值至5.8-6.0，然后加乙醇使沉淀度數(shù)達(dá)60-70度，沉淀5-8h，再向沉淀物中加乙醇，使沉淀度數(shù)達(dá)80-90度，沉淀5-8h，收集沉淀物；(8)脫水：向步驟(7)所得沉淀物中加75％乙醇浸泡2次，真空干燥，得硫酸軟骨素鈉成品。進(jìn)一步地，步驟(2)中所添加的復(fù)合酶占步驟(1)所得物重量的3％。進(jìn)一步地，復(fù)合酶為蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按質(zhì)量比為6-8:0.8-1.2:0.2-0.4混合的混合物。進(jìn)一步地，復(fù)合酶為蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按質(zhì)量比為8:1.0:0.2混合的混合物。進(jìn)一步地，蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均為3.5萬u/g。進(jìn)一步地，步驟(2)中超聲時(shí)間為30min，超聲功率為280w，單次超聲時(shí)間為3s，超聲時(shí)間與間歇時(shí)間比為4:1。進(jìn)一步地，步驟(3)中微波功率為280w，提取時(shí)間為8min。進(jìn)一步地，步驟(3)中所添加的復(fù)合酶占步驟(2)所得物重量的1.8％。進(jìn)一步地，步驟(4)中所添加的蛋白酶占步驟(3)所得物重量的2.5％。進(jìn)一步地，步驟(7)中加乙醇使沉淀度數(shù)達(dá)65度，沉淀8h，再向沉淀物中加乙醇，使沉淀度數(shù)達(dá)80度，沉淀6h。本發(fā)明提供的一種硫酸軟骨素鈉的制備方法，具有以下有益效果：利用超聲波提取硫酸軟骨素鈉主要是運(yùn)用超聲波的機(jī)械效應(yīng)和空化作用。超聲波的機(jī)械作用可促成液體的乳化、凝膠的液化和固體的分散，當(dāng)超聲波流體介質(zhì)中形成駐波時(shí)，懸浮在流體中的微小顆粒因受機(jī)械力的作用而凝聚在波節(jié)處，在空間形成周期性的堆積；超聲波的空化作用是指超聲波作用于液體的時(shí)候可以產(chǎn)生大量小氣泡，一個(gè)原因是由于液體內(nèi)局部出現(xiàn)拉應(yīng)力而形成負(fù)壓，壓強(qiáng)的降低使原來溶于液體的氣體過飽和，而從液體逸出，成為小氣泡；另一個(gè)原因是由于強(qiáng)大的拉應(yīng)力把液體“撕開”成一空洞，成為空化?？斩磧?nèi)為液體蒸汽或溶于液體的另一種氣體，甚至可能是真空，因?yàn)榭栈饔眯纬傻男馀輹?huì)隨周圍介質(zhì)的振動(dòng)而不斷運(yùn)動(dòng)，長(zhǎng)大或突然破滅，破滅時(shí)周圍液體突然沖入氣泡而產(chǎn)生高溫、高壓，同時(shí)產(chǎn)生激波，這種作用力能破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞在瞬間破裂，超聲波的這些作用都有助于硫酸軟骨素鈉的提取。在超聲波為介質(zhì)的條件下酶解，即將超聲波導(dǎo)入溶液中，在超聲波破壞細(xì)胞膜的情況下，通過酶解過程使細(xì)胞內(nèi)的硫酸軟骨素鈉和蛋白質(zhì)分離，肝素保留于溶液中，而蛋白質(zhì)成為固體雜渣，通過離心過濾，便可將硫酸軟骨素鈉與蛋白質(zhì)初步分離。此過程所用的酶為蛋白酶、脂肪酶和核酸酶混合的復(fù)合酶，三者酶按照特定的比例關(guān)系復(fù)合，有利于去除與硫酸軟骨素鈉連接的蛋白質(zhì)，并且在酶解過程不需額外加熱，便可將蛋白質(zhì)去除。將超聲波酶解后所得濾液在微波場(chǎng)的作用下引起強(qiáng)烈的極性震蕩，從而導(dǎo)致細(xì)胞分子間氫鍵松弛，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)電擊穿破裂，加速了細(xì)胞膜的通透性，從而有助于硫酸軟骨素鈉的提取。在超聲波震蕩前，向?yàn)V液中加入了復(fù)合酶，然后一起進(jìn)行超聲波振動(dòng)，使其在破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞膜通透性的情況下，直接用復(fù)合酶對(duì)連接硫酸軟骨素鈉的蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解，使其與硫酸軟骨素鈉得到進(jìn)一步的分離。經(jīng)過超聲波酶解和微波提取過程后，硫酸軟骨素鈉上還連接有蛋白質(zhì)，通過進(jìn)一步的蛋白質(zhì)酶解過程，使其剩余蛋白質(zhì)得到更好的去除，有利于提供硫酸軟骨素鈉的純度和收率。超聲波酶解、微波提取和蛋白質(zhì)酶解，三個(gè)過程依次進(jìn)行，協(xié)同將硫酸軟骨素鈉從豬軟骨上提取出來，提高其收率和純度。步驟(5)沉淀過程中濾液溫度要維持在50-60℃，可使硫酸軟骨素鈉緩慢沉淀，減少蛋白雜質(zhì)與硫酸軟骨素鈉共沉淀現(xiàn)象，操作時(shí)加乙醇速度要慢，邊加邊攪拌，可減少硫酸軟骨素鈉沉淀時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)的包裹。通過上述環(huán)環(huán)相扣的步驟，使得硫酸軟骨素鈉的產(chǎn)量和純度得以顯著提高，降低了生產(chǎn)成本，提高了經(jīng)濟(jì)效益。具體實(shí)施方式實(shí)施例1一種硫酸軟骨素鈉的制備方法，包括以下步驟：(1)提?。簩⒇i軟骨和水按重量比為1:3混合，加熱煮沸30min，然后加入2％豬軟骨重量的氯化鈉，再用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph值至10；(2)超聲波酶解：向步驟(1)所得物中加入復(fù)合酶，混合，在以超聲為介質(zhì)的條件下進(jìn)行酶解，超聲時(shí)間為30min，超聲功率為250w，單次超聲時(shí)間為2s，超聲時(shí)間與間歇時(shí)間比為2:1，然后離心，過濾，得濾液；其中，所添加的復(fù)合酶占步驟(1)所得物重量的5％；復(fù)合酶為蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按質(zhì)量比為6:0.8:0.2混合的混合物，蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均為3.5萬u/g；(3)微波提?。合虿襟E(2)所得濾液中繼續(xù)加入復(fù)合酶，混合，然后置于微波提取器中提取，微波功率為250w，提取時(shí)間為10min；其中，所添加的復(fù)合酶占步驟(2)所得物重量的1％；復(fù)合酶為蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按質(zhì)量比為6:0.8:0.2混合的混合物，蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均為3.5萬u/g；(4)酶解：向步驟(3)所得物中加入蛋白酶，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph值至10，置于60℃條件下攪拌40min，再用鹽酸調(diào)節(jié)ph值至6.5，靜置，過濾，得濾液；其中，所添加的蛋白酶占步驟(3)所得物重量的2％；(5)沉淀：將步驟(4)所得濾液溫度維持在60℃，加入95％乙醇，靜置至沉淀量不再增加，過濾，得沉淀物；其中，步驟(4)所得濾液與95％乙醇的體積比為2:1；(6)脫色：將步驟(5)所得沉淀物加入氯化鈉溶液溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph值至10，再將溶液升溫至40℃，加雙氧水靜置氧化脫色2h，過濾，得濾液；其中，所加氯化鈉溶液的質(zhì)量濃度為2％，沉淀物占氯化鈉溶液重量的10％，雙氧水占氯化鈉溶液的0.5％；(7)沉淀：將步驟(6)所得濾液用鹽酸調(diào)節(jié)ph值至6.0，然后加乙醇使沉淀度數(shù)達(dá)60度，沉淀5h，再向沉淀物中加乙醇，使沉淀度數(shù)達(dá)80度，沉淀5h，收集沉淀物；(8)脫水：向步驟(7)所得沉淀物中加75％乙醇浸泡2次，真空干燥，得硫酸軟骨素鈉成品。實(shí)施例2一種硫酸軟骨素鈉的制備方法，包括以下步驟：(1)提?。簩⒇i軟骨和水按重量比為1:5混合，加熱煮沸40min，然后加入3％豬軟骨重量的氯化鈉，再用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph值至11；(2)超聲波酶解：向步驟(1)所得物中加入復(fù)合酶，混合，在以超聲為介質(zhì)的條件下進(jìn)行酶解，超聲時(shí)間為30min，超聲功率為300w，單次超聲時(shí)間為4s，超聲時(shí)間與間歇時(shí)間比為5:1，然后離心，過濾，得濾液；其中，所添加的復(fù)合酶占步驟(1)所得物重量的2％；復(fù)合酶為蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按質(zhì)量比為8:1.2:0.4混合的混合物，蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均為3.5萬u/g；(3)微波提?。合虿襟E(2)所得濾液中繼續(xù)加入復(fù)合酶，混合，然后置于微波提取器中提取，微波功率為300w，提取時(shí)間為10min；其中，所添加的復(fù)合酶占步驟(2)所得物重量的3％；復(fù)合酶為蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按質(zhì)量比為8:1.2:0.4混合的混合物，蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均為3.5萬u/g；(4)酶解：向步驟(3)所得物中加入蛋白酶，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph值至10，置于50℃條件下攪拌60min，再用鹽酸調(diào)節(jié)ph值至6，靜置，過濾，得濾液；其中，所添加的蛋白酶占步驟(3)所得物重量的4％；(5)沉淀：將步驟(4)所得濾液溫度維持在50℃，加入95％乙醇，靜置至沉淀量不再增加，過濾，得沉淀物；其中，步驟(4)所得濾液與95％乙醇的體積比為3:1；(6)脫色：將步驟(5)所得沉淀物加入氯化鈉溶液溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph值至10，再將溶液升溫至35℃，加雙氧水靜置氧化脫色3h，過濾，得濾液；其中，所加氯化鈉溶液的質(zhì)量濃度為5％，沉淀物占氯化鈉溶液重量的15％，雙氧水占氯化鈉溶液的0.8％；(7)沉淀：將步驟(6)所得濾液用鹽酸調(diào)節(jié)ph值至5.8，然后加乙醇使沉淀度數(shù)達(dá)70度，沉淀8h，再向沉淀物中加乙醇，使沉淀度數(shù)達(dá)90度，沉淀5h，收集沉淀物；(8)脫水：向步驟(7)所得沉淀物中加75％乙醇浸泡2次，真空干燥，得硫酸軟骨素鈉成品。實(shí)施例3一種硫酸軟骨素鈉的制備方法，包括以下步驟：(1)提?。簩⒇i軟骨和水按重量比為1:5混合，加熱煮沸40min，然后加入2.5％豬軟骨重量的氯化鈉，再用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph值至11；(2)超聲波酶解：向步驟(1)所得物中加入復(fù)合酶，混合，在以超聲為介質(zhì)的條件下進(jìn)行酶解，超聲時(shí)間為30min，超聲功率為280w，單次超聲時(shí)間為3s，超聲時(shí)間與間歇時(shí)間比為4:1，然后離心，過濾，得濾液；其中，所添加的復(fù)合酶占步驟(1)所得物重量的3％；復(fù)合酶為蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按質(zhì)量比為8:1.0:0.2混合的混合物，蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均為3.5萬u/g；(3)微波提?。合虿襟E(2)所得濾液中繼續(xù)加入復(fù)合酶，混合，然后置于微波提取器中提取，微波功率為280w，提取時(shí)間為8min；其中，所添加的復(fù)合酶占步驟(2)所得物重量的1.8％；復(fù)合酶為蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按質(zhì)量比為8:1.0:0.2混合的混合物，蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均為3.5萬u/g；(4)酶解：向步驟(3)所得物中加入蛋白酶，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph值至10，置于55℃條件下攪拌50min，再用鹽酸調(diào)節(jié)ph值至6.5，靜置，過濾，得濾液；其中，所添加的蛋白酶占步驟(3)所得物重量的2.5％；(5)沉淀：將步驟(4)所得濾液溫度維持在55℃，加入95％乙醇，靜置至沉淀量不再增加，過濾，得沉淀物；其中，步驟(4)所得濾液與95％乙醇的體積比為3:1；(6)脫色：將步驟(5)所得沉淀物加入氯化鈉溶液溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph值至10，再將溶液升溫至37℃，加雙氧水靜置氧化脫色3h，過濾，得濾液；其中，所加氯化鈉溶液的質(zhì)量濃度為3％，沉淀物占氯化鈉溶液重量的12％，雙氧水占氯化鈉溶液的0.6％；(7)沉淀：將步驟(6)所得濾液用鹽酸調(diào)節(jié)ph值至6.0，然后加乙醇使沉淀度數(shù)達(dá)65度，沉淀8h，再向沉淀物中加乙醇，使沉淀度數(shù)達(dá)80度，沉淀6h，收集沉淀物；(8)脫水：向步驟(7)所得沉淀物中加75％乙醇浸泡2次，真空干燥，得硫酸軟骨素鈉成品。實(shí)施例1-3所制得的硫酸軟骨素鈉成品色澤潔白，粉末疏松，收率達(dá)32％以上，降低了生產(chǎn)成本，提高了經(jīng)濟(jì)效益。將實(shí)施例1-3所得硫酸軟骨素鈉成品進(jìn)行分析，結(jié)果如下：實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3比旋度-26.1°-26.9°-27.8°420nm吸光度0.1940.1890.163酸度6.626.536.41總氮量3.0％2.9％2.8％干燥失重9.0％8.3％8.0％熾灼殘?jiān)?7.8％26.1％25.2％有機(jī)殘留3771ppm3002ppm2558ppmcpc含量95.5％96.2％96.7％hplc含量93.1％95.2％97.5％當(dāng)前第1頁12