本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種用于人類kras基因突變檢測(cè)的試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：目前，肺癌己成為全球癌癥死亡的首要原因，全球每年新發(fā)病例150萬(wàn)，嚴(yán)重威脅人類健康。在肺癌患者中，非小細(xì)胞肺癌約(nsclc)占80％，且就診時(shí)80％己失去手術(shù)或放射治療最佳機(jī)會(huì)，致使其長(zhǎng)期生存率低，療效令人堪憂。iiib/iv期非小細(xì)胞肺癌2年生存率僅10％-20％，中位生存時(shí)間僅10-12月。因此，人們需要不斷研究新的治療方法以提高肺癌治療的有效率，其中以分子靶向治療為代表的新治療方法，為晚期nsclc的治療帶來(lái)了新的希望。ras基因家族與人類腫瘤相關(guān)的基因有三種——h-ras、k-ras和n-ras，分別定位在11、12和1號(hào)染色體上。k-ras因編碼21kd的ras蛋白又名p21基因。在ras基因中，k-ras對(duì)人類癌癥影響最大，它好像分子開關(guān)：當(dāng)正常時(shí)能控制調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的路徑；發(fā)生異常時(shí)，則導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)，并阻止細(xì)胞自我毀滅。她參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞，當(dāng)k-ras基因突變時(shí)，該基因永久活化，不能產(chǎn)生正常的ras蛋白，使細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)紊亂，細(xì)胞增殖失控而癌變。k-ras基因就像體內(nèi)一個(gè)“開關(guān)”，它在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)以及血管生成等過(guò)程的信號(hào)傳導(dǎo)通路中起著重要調(diào)控作用，正常的k-ras基因可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，而一旦發(fā)生突變，它就會(huì)持續(xù)刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，打亂生長(zhǎng)規(guī)律，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。k-ras基因檢測(cè)是目前醫(yī)生了解大腸癌患者癌基因狀況最直接、最有效的方法。看k-ras基因有沒有突變，可以篩選出抗egfr(表皮生長(zhǎng)因子受體)靶向藥物治療有效的大腸癌患者，實(shí)現(xiàn)腫瘤病人的個(gè)體化治療，從而延長(zhǎng)患者生存期。對(duì)于沒有突變的患者，則能減少不必要的治療費(fèi)用和毒副作用。目前在歐美，k-ras檢測(cè)已成為大腸癌患者內(nèi)科治療前必做的常規(guī)檢查。突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)(amplificationrefractorymutationsystem，arms)也叫等位基因特異性pcr，該法是在pcr基礎(chǔ)上發(fā)展而成的，是一種直接用于點(diǎn)突變分析的pcr技術(shù)。其依據(jù)的基本原理是taqdna聚合酶缺少3′到5′外切酶活性，因此對(duì)于3′末端錯(cuò)配的引物以低于正常末端配對(duì)引物的速度延伸，當(dāng)錯(cuò)配堿基的數(shù)目達(dá)到一定程度或者條件達(dá)到一定的嚴(yán)謹(jǐn)程度時(shí)，擴(kuò)增反應(yīng)終止。大部分腫瘤的突變都是體細(xì)胞突變，突變細(xì)胞往往與野生型細(xì)胞混雜在一起。因此所提取的dna常帶有大量野生型dna，所以對(duì)體細(xì)胞突變檢測(cè)需要較高的特異性，而目前廣泛使用的直接測(cè)序法檢測(cè)能力有限，不能完全滿足臨床需要。特異性探針?lè)ㄈ缫詓corpionsarms為代表的英國(guó)dxs和中國(guó)廈門adx的kras檢測(cè)試劑盒雖然檢測(cè)靈敏度高，但其檢測(cè)費(fèi)用較高，不適合國(guó)內(nèi)nsclc患者的常規(guī)檢測(cè)和篩查，因此，臨床迫切需要開發(fā)一種快速準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高的檢測(cè)kras基因突變的試劑盒，滿足臨床用藥和檢測(cè)診斷的時(shí)效性要求。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種高靈敏度的用于人類kras基因突變檢測(cè)的試劑盒和反應(yīng)體系，本發(fā)明的另一目的是提供一種用于檢測(cè)kras基因突變的檢測(cè)方法。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：用于人類kras基因突變檢測(cè)的試劑盒，其特征在于：包括7種基因的特異性引物對(duì)和7條與特異性引物配合使用的探針引物，所述的特異性引物對(duì)和探針引物為：優(yōu)選的，還包括質(zhì)控系統(tǒng)或/和內(nèi)控系統(tǒng)，所述的質(zhì)控系統(tǒng)為一對(duì)質(zhì)控引物和相應(yīng)的質(zhì)控探針，所述的內(nèi)控系統(tǒng)為一對(duì)內(nèi)控引物和相應(yīng)的內(nèi)控探針，具體如下：質(zhì)控引物：上游引物：5’aatataaacttgtggtagttgga3’下游引物：5’ttcgtccacaaaatgattctga3’質(zhì)控探針：5’ctgtatcgtcaaggcactctt3’；內(nèi)控引物：上游引物：5’cccagcagtttggccc3’下游引物：5’tccttaatgtcacgcacgat3’內(nèi)控探針：5’accaccacggccgagcgg3’。優(yōu)選的，所述的試劑盒還包括kraspcr反應(yīng)液、酶系1、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和depc水。優(yōu)選的，所述的試劑盒可用于血清游離dna樣本、組織樣本或穿刺樣本的kras基因突變的檢測(cè)。作為優(yōu)選，包括pcr擴(kuò)增試劑和對(duì)照試劑，所述的擴(kuò)增試劑、對(duì)照試劑的組成成分和終濃度如下：用于人類kras基因突變的檢測(cè)方法，所述的方法包含以下步驟：(1)樣本dna的提取血清游離dna提取和組織樣本dna提取；(2)pcr反應(yīng)體系的配制分別配制pcr反應(yīng)液16ul，酶系1、2ul、引物探針混合液2ul，模板dna5ul，陰性對(duì)照和質(zhì)控視為樣本，作相同處理；(3)結(jié)果判讀：根據(jù)熒光pcr擴(kuò)增儀顯示的ct值判斷檢測(cè)結(jié)果：利用特異性引物和熒光探針進(jìn)行pcr檢測(cè)，突變和質(zhì)控由fam指示，內(nèi)控由hex信號(hào)指示，通過(guò)計(jì)算δct的大小進(jìn)行判斷，反應(yīng)管的δct值＜δctcut-off值時(shí)，則樣品為該反應(yīng)管對(duì)應(yīng)信號(hào)突變陽(yáng)性，反之則為陰性或低于試劑盒的檢測(cè)下限。δct值＝突變樣本ct值-質(zhì)控ct值表cutoffδct值檢測(cè)靶點(diǎn)cutoffδct值12cys1012ser1012arg812val1212asp812ala1213asp10本發(fā)明提供了用于人類kras基因突變檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包括pcr反應(yīng)緩沖液、引物探針混合液、酶系1、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照。引物探針混合液包含突變位點(diǎn)基因和內(nèi)控引物探針，質(zhì)控基因和內(nèi)控檢測(cè)引物探針，突變和質(zhì)控探針標(biāo)記fam熒光素，內(nèi)控標(biāo)記hex熒光素，質(zhì)控及內(nèi)控均作為結(jié)果判讀的一部分，質(zhì)控基因選擇是人類kras基因相對(duì)保守的區(qū)段，內(nèi)控選擇的是人β-actin保守基因，雙控體系共同用于監(jiān)控血漿樣本dna質(zhì)量和pcr反應(yīng)過(guò)程，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：1)高靈敏度：可在100ng野生型人類基因組背景下檢測(cè)出1％微量突變模板，減少了假陰性結(jié)果的出現(xiàn)；2)全封閉反應(yīng)，避免假陽(yáng)性結(jié)果的發(fā)生；3)雙控反應(yīng)體系，質(zhì)控及內(nèi)源對(duì)照，有效檢測(cè)pcr擴(kuò)增及核酸提取。附圖說(shuō)明圖1為12cys靈敏度結(jié)果圖2為12ser靈敏度結(jié)果圖3為12arg靈敏度結(jié)果圖4為12val靈敏度結(jié)果圖5為12asp靈敏度結(jié)果圖6為12ala靈敏度結(jié)果圖7為13asp靈敏度結(jié)果圖8為臨床陽(yáng)性樣本用12cys檢測(cè)結(jié)果圖9為臨床陽(yáng)性樣本用12ser檢測(cè)結(jié)果圖10為臨床陽(yáng)性樣本用12arg檢測(cè)結(jié)果圖11為臨床陽(yáng)性樣本用12val檢測(cè)結(jié)果圖12為臨床陽(yáng)性樣本用12asp檢測(cè)結(jié)果圖13為臨床陽(yáng)性樣本用12ala檢測(cè)結(jié)果圖14為臨床陽(yáng)性樣本用13asp檢測(cè)結(jié)果具體實(shí)施方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例1利用本發(fā)明實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)kras7種基因突變的方法包括如下步驟：1、核酸提取以石蠟包埋組織為例，按照推薦的qiaampdnaffpetissuekit說(shuō)明書進(jìn)行石蠟包埋組織基因組dna的提取。2、pcr反應(yīng)體系的配制(25ul)試劑名稱加入量pcr反應(yīng)液16ul酶系12ul引物探針混合液2ul模板dna5ul所述的模板dna包含樣本dna和陰性、陽(yáng)性對(duì)照dna。3、pcr擴(kuò)增實(shí)時(shí)pcr擴(kuò)增條件為：50℃2min，1個(gè)循環(huán)；95℃5min；95℃10s，55℃15s,72℃30s，5個(gè)循環(huán)；95℃10s，60℃45s(收集fam和hex熒光信號(hào))，40個(gè)循環(huán)。4、結(jié)果判定1)檢測(cè)結(jié)果除陰性對(duì)照外，突變反應(yīng)管的內(nèi)控信號(hào)hex應(yīng)有擴(kuò)增曲線，且ct≤33；若ct＞33，則提示樣本dna模板量偏低或存在pcr抑制劑，需重新提取或者增加pcr模板量再做，但是如果管內(nèi)fam有信號(hào)，可能是由于突變的擴(kuò)增抑制了內(nèi)控序列的擴(kuò)增，結(jié)果仍然可信。2)質(zhì)控管fam信號(hào)ct＜21，提示樣品加入量過(guò)高，需減少樣本加入量再實(shí)驗(yàn)；質(zhì)控管fam信號(hào)ct＞26或陰性，提示該樣本加入量過(guò)低或提取失敗，需要增加樣本量再實(shí)驗(yàn)或重新提取。3)質(zhì)控管fam信號(hào)21≤ct≤26a：arms引物管ct＜30，樣本結(jié)果判讀為陽(yáng)性。b：arms引物管＞陰性臨界值或無(wú)擴(kuò)增曲線，樣本結(jié)果判讀為陰性。c：相應(yīng)arms引物管30≤ct值＜陰性臨界值(如下表)，且其與質(zhì)控管fam信號(hào)的δct≤△ctcut-off值，該樣本結(jié)果判讀為陽(yáng)性；反之則判讀為陰性。實(shí)施例2利用本發(fā)明檢測(cè)kras基因突變陽(yáng)性患者石蠟包埋組織樣本10例，并與測(cè)序結(jié)果進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果：檢測(cè)出12val陽(yáng)性4例，12asp陽(yáng)性5例，13asp陽(yáng)性1例，與測(cè)序法符合率100％。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12