本發(fā)明屬于豬小腸粘膜深加工
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種以豬小腸粘膜為原料，提取肝素鈉的方法。
背景技術(shù)：
：肝素鈉是一種由動物結(jié)締組織的肥大細(xì)胞產(chǎn)生的酸性粘多糖硫酸酯類物質(zhì)，廣泛存在于哺乳動物肝、肺、腸粘膜中，多與蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合體存在，因其具有強(qiáng)抗凝作用，是防治深層靜脈血栓形成等血栓栓塞性疾病的首選藥物。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)肝素鈉不僅有抗凝、抗血栓形成和調(diào)整血脂的作用，還有抗炎、抗過敏、抗癌等多種生物學(xué)功能。雖然肝素鈉用于臨床已有60余年的歷史，但迄今還沒有一種能夠完全替代它的產(chǎn)品，所以它仍然是最重要的抗凝血和抗血栓的生化藥物，且目前只能從動物的部分組織中提取，不能人工合成。但采用現(xiàn)有的提取方法從豬小腸粘膜上提取肝素鈉，提取一億國際單位(iu)肝素鈉粗品需2800-3000根豬小腸的粘膜，其收率低，產(chǎn)品效價(jià)也低，肝素鈉的效價(jià)一般為70-90u/mg。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，本發(fā)明提供了一種肝素鈉的提取方法，可有效解決現(xiàn)有提取方法收率低，純度低的問題。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：肝素鈉的提取方法，包括以下步驟：(1)制備漿液：將新鮮的豬小腸粘膜與水按每根小腸加水4-5kg混合，然后置于勻漿機(jī)中勻漿，得漿液；(2)超聲波酶解：將步驟(1)所得漿液ph調(diào)至8-9后加入復(fù)合酶，混合，在以超聲為介質(zhì)的條件下進(jìn)行酶解，超聲時(shí)間為20-30min，超聲功率為250-300w，單次超聲時(shí)間為2-4s，超聲時(shí)間與間歇時(shí)間比為2-5:1，然后離心，過濾，得濾液；(3)微波提?。合虿襟E(2)所得濾液中繼續(xù)加入復(fù)合酶，混合，然后置于微波提取器中提取，微波功率為250-300w，提取時(shí)間為5-10min；(4)酶解：向步驟(3)所得物質(zhì)中加入蛋白酶，于45-55℃條件下攪拌40-60min；其中，每升步驟(3)所得物質(zhì)中加入2-4g蛋白酶；(5)除雜：調(diào)節(jié)步驟(4)所得酶解產(chǎn)物的ph至9-10，然后加入氯化鈉，調(diào)節(jié)鹽度為2.5-3，攪拌1-2h，升溫至70-75℃，然后靜置10-20min，離心過濾，收集濾液，接著用孔徑為2μm的濾膜粗濾，再用孔徑為0.22μm的濾膜過濾，以除去雜質(zhì)，得濾液；(6)吸附：將步驟(5)所得濾液溫度調(diào)至45-55℃，ph調(diào)至8-9，加入樹脂中，吸附3-4h，收集樹脂；(7)清洗：將步驟(6)收集到的樹脂用清水清洗干凈，再用鹽度為18-20的鹽水洗脫樹脂2-2.5h，收集洗脫液，再用鹽度為20-22的鹽水洗脫樹脂1-1.5h，收集洗脫液；(8)沉淀：將步驟(7)所得兩次洗脫液合并，然后加入75％乙醇沉淀12h，除去上清液，得肝素鈉粗品；(9)精制：將肝素鈉粗品加水溶解，加入鹽酸溶液調(diào)節(jié)ph值為1.5-2，過濾，得濾液，然后再加氫氧化鈉調(diào)節(jié)濾液ph值為10-11，再加活性炭浸泡5-6h，過濾，得濾液，最后向?yàn)V液中加入75％乙醇沉淀6-8h，除去上清液，再真空干燥，得肝素鈉精品。進(jìn)一步地，步驟(2)中每升漿液中加入0.6-0.8g復(fù)合酶。進(jìn)一步地，復(fù)合酶為蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按質(zhì)量比為6-8:0.8-1.2:0.2-0.4混合的混合物。進(jìn)一步地，復(fù)合酶為蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按質(zhì)量比為8:1.0:0.2混合的混合物。進(jìn)一步地，蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均為3.5萬u/g。進(jìn)一步地，步驟(2)中超聲時(shí)間為30min，超聲功率為280w，單次超聲時(shí)間為3s，超聲時(shí)間與間歇時(shí)間比為4:1。進(jìn)一步地，步驟(3)中微波功率為280w，提取時(shí)間為8min。進(jìn)一步地，步驟(6)中每升濾液中加入5g樹脂。進(jìn)一步地，所用樹脂為d254樹脂。本發(fā)明提供的肝素鈉的提取方法，具有以下有益效果：利用超聲波提取肝素鈉主要是運(yùn)用超聲波的機(jī)械效應(yīng)和空化作用。超聲波的機(jī)械作用可促成液體的乳化、凝膠的液化和固體的分散，當(dāng)超聲波流體介質(zhì)中形成駐波時(shí)，懸浮在流體中的微小顆粒因受機(jī)械力的作用而凝聚在波節(jié)處，在空間形成周期性的堆積；超聲波的空化作用是指超聲波作用于液體的時(shí)候可以產(chǎn)生大量小氣泡，一個原因是由于液體內(nèi)局部出現(xiàn)拉應(yīng)力而形成負(fù)壓，壓強(qiáng)的降低使原來溶于液體的氣體過飽和，而從液體逸出，成為小氣泡；另一個原因是由于強(qiáng)大的拉應(yīng)力把液體“撕開”成一空洞，成為空化?？斩磧?nèi)為液體蒸汽或溶于液體的另一種氣體，甚至可能是真空，因?yàn)榭栈饔眯纬傻男馀輹S周圍介質(zhì)的振動而不斷運(yùn)動，長大或突然破滅，破滅時(shí)周圍液體突然沖入氣泡而產(chǎn)生高溫、高壓，同時(shí)產(chǎn)生激波，這種作用力能破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞在瞬間破裂，超聲波的這些作用都有助于肝素鈉的提取。在超聲波為介質(zhì)的條件下酶解，即將超聲波導(dǎo)入溶液中，在超聲波破壞細(xì)胞膜的情況下，通過酶解過程使細(xì)胞內(nèi)的肝素鈉和蛋白質(zhì)分離，肝素保留于溶液中，而蛋白質(zhì)成為固體雜渣，通過離心過濾，便可將肝素鈉與蛋白質(zhì)初步分離。此過程所用的酶為蛋白酶、脂肪酶和核酸酶混合的復(fù)合酶，三者酶按照特定的比例關(guān)系復(fù)合，有利于去除與肝素鈉連接的蛋白質(zhì)，并且在酶解過程不需額外加熱，便可將蛋白質(zhì)去除。將超聲波酶解后所得濾液在微波場的作用下引起強(qiáng)烈的極性震蕩，從而導(dǎo)致細(xì)胞分子間氫鍵松弛，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)電擊穿破裂，加速了細(xì)胞膜的通透性，從而有助于肝素鈉的提取。在超聲波震蕩前，向?yàn)V液中加入了復(fù)合酶，然后一起進(jìn)行超聲波振動，使其在破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞膜通透性的情況下，直接用復(fù)合酶對連接肝素鈉的蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解，使其與肝素鈉得到進(jìn)一步的分離。經(jīng)過超聲波酶解和微波提取過程后，肝素鈉上還連接有蛋白質(zhì)，通過進(jìn)一步的蛋白質(zhì)酶解過程，使其剩余蛋白質(zhì)得到更好的去除，有利于提供肝素鈉的純度和收率。超聲波酶解、微波提取和蛋白質(zhì)酶解，三個過程依次進(jìn)行，協(xié)同將肝素鈉從豬小腸粘膜上提取出來，提高其收率和純度。經(jīng)過上述三個過程后，再進(jìn)一步地用堿性鹽法將肝素鈉從肝素鈉與其他物質(zhì)形成的復(fù)合物中分離出來，再次提高了肝素鈉的純度；通過升溫滅酶，最后依次通過離心，孔徑為2μm的濾膜粗濾，孔徑為0.22μm的濾膜過濾，可有效去除酶及其他雜質(zhì)。通過吸附作用，也是進(jìn)一步地提高肝素鈉的純度，再用鹽度較低的鹽水對樹脂進(jìn)行清洗，提高肝素鈉收率和純度，整個提取過程中所用鹽水濃度及使用量都大大減少了。本發(fā)明的提取過程中每個步驟是環(huán)環(huán)相扣的，通過此提取過程顯著提高了肝素鈉的收率和純度，收率達(dá)一億iu/1000-1100根豬小腸，純度達(dá)163-182iu/mg。具體實(shí)施方式實(shí)施例1肝素鈉的提取方法，包括以下步驟：(1)制備漿液：將新鮮的豬小腸粘膜與水按每根小腸加水5kg混合，然后置于勻漿機(jī)中勻漿，得漿液；(2)超聲波酶解：將步驟(1)所得漿液ph調(diào)至8后加入復(fù)合酶，混合，在以超聲為介質(zhì)的條件下進(jìn)行酶解，超聲時(shí)間為20min，超聲功率為250w，單次超聲時(shí)間為2s，超聲時(shí)間與間歇時(shí)間比為2:1，然后離心，過濾，得濾液；其中，每升漿液中加入0.6g復(fù)合酶，復(fù)合酶為蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按質(zhì)量比為6:0.8:0.2混合的混合物，蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均為3.5萬u/g；(3)微波提?。合虿襟E(2)所得濾液中繼續(xù)加入復(fù)合酶，混合，然后置于微波提取器中提取，微波功率為250w，提取時(shí)間為5min；其中，每升濾液中加入0.3g復(fù)合酶，復(fù)合酶為蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按質(zhì)量比為6:0.8:0.2混合的混合物，蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均為3.5萬u/g；(4)酶解：向步驟(3)所得物質(zhì)中加入蛋白酶，于45℃條件下攪拌40min；其中，每升步驟(3)所得物質(zhì)中加入2g蛋白酶；(5)除雜：調(diào)節(jié)步驟(4)所得酶解產(chǎn)物的ph至9，然后加入氯化鈉，調(diào)節(jié)鹽度為2.5，攪拌1h，升溫至70℃，然后靜置20min，離心過濾，收集濾液，接著用孔徑為2μm的濾膜粗濾，再用孔徑為0.22μm的濾膜過濾，以除去雜質(zhì)，得濾液；(6)吸附：將步驟(5)所得濾液溫度調(diào)至45℃，ph調(diào)至9，加入樹脂中，吸附3h，收集樹脂；其中，每升濾液中加入5g樹脂，所用樹脂為d254樹脂；(7)清洗：將步驟(6)收集到的樹脂用清水清洗干凈，再用鹽度為18的鹽水洗脫樹脂2h，收集洗脫液，再用鹽度為20的鹽水洗脫樹脂1h，收集洗脫液；(8)沉淀：將步驟(7)所得兩次洗脫液合并，然后加入75％乙醇沉淀12h，除去上清液，得肝素鈉粗品；(9)精制：將肝素鈉粗品加水溶解，加入鹽酸溶液調(diào)節(jié)ph值為1.5，過濾，得濾液，然后再加氫氧化鈉調(diào)節(jié)濾液ph值為10，再加活性炭浸泡5h，過濾，得濾液，最后向?yàn)V液中加入75％乙醇沉淀6h，除去上清液，再真空干燥，得肝素鈉精品。實(shí)施例2肝素鈉的提取方法，包括以下步驟：(1)制備漿液：將新鮮的豬小腸粘膜與水按每根小腸加水5kg混合，然后置于勻漿機(jī)中勻漿，得漿液；(2)超聲波酶解：將步驟(1)所得漿液ph調(diào)至8后加入復(fù)合酶，混合，在以超聲為介質(zhì)的條件下進(jìn)行酶解，超聲時(shí)間為30min，超聲功率為300w，單次超聲時(shí)間為4s，超聲時(shí)間與間歇時(shí)間比為5:1，然后離心，過濾，得濾液；其中，每升漿液中加入0.8g復(fù)合酶，復(fù)合酶為蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按質(zhì)量比為8:1.2:0.4混合的混合物，蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均為3.5萬u/g；(3)微波提?。合虿襟E(2)所得濾液中繼續(xù)加入復(fù)合酶，混合，然后置于微波提取器中提取，微波功率為300w，提取時(shí)間為10min；其中，每升濾液中加入0.2g復(fù)合酶，復(fù)合酶為蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按質(zhì)量比為8:1.2:0.4混合的混合物，蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均為3.5萬u/g；(4)酶解：向步驟(3)所得物質(zhì)中加入蛋白酶，于55℃條件下攪拌60min；其中，每升步驟(3)所得物質(zhì)中加入4g蛋白酶；(5)除雜：調(diào)節(jié)步驟(4)所得酶解產(chǎn)物的ph至10，然后加入氯化鈉，調(diào)節(jié)鹽度為3，攪拌2h，升溫至75℃，然后靜置20min，離心過濾，收集濾液，接著用孔徑為2μm的濾膜粗濾，再用孔徑為0.22μm的濾膜過濾，以除去雜質(zhì)，得濾液；(6)吸附：將步驟(5)所得濾液溫度調(diào)至55℃，ph調(diào)至9，加入樹脂中，吸附4h，收集樹脂；其中，每升濾液中加入5g樹脂，所用樹脂為d254樹脂；(7)清洗：將步驟(6)收集到的樹脂用清水清洗干凈，再用鹽度為20的鹽水洗脫樹脂2.5h，收集洗脫液，再用鹽度為22的鹽水洗脫樹脂1.5h，收集洗脫液；(8)沉淀：將步驟(7)所得兩次洗脫液合并，然后加入75％乙醇沉淀12h，除去上清液，得肝素鈉粗品；(9)精制：將肝素鈉粗品加水溶解，加入鹽酸溶液調(diào)節(jié)ph值為1.5，過濾，得濾液，然后再加氫氧化鈉調(diào)節(jié)濾液ph值為10，再加活性炭浸泡6h，過濾，得濾液，最后向?yàn)V液中加入75％乙醇沉淀8h，除去上清液，再真空干燥，得肝素鈉精品。實(shí)施例3肝素鈉的提取方法，包括以下步驟：(1)制備漿液：將新鮮的豬小腸粘膜與水按每根小腸加水5kg混合，然后置于勻漿機(jī)中勻漿，得漿液；(2)超聲波酶解：將步驟(1)所得漿液ph調(diào)至8.5后加入復(fù)合酶，混合，在以超聲為介質(zhì)的條件下進(jìn)行酶解，超聲時(shí)間為30min，超聲功率為280w，單次超聲時(shí)間為3s，超聲時(shí)間與間歇時(shí)間比為4:1，然后離心，過濾，得濾液；其中，每升漿液中加入0.8g復(fù)合酶，復(fù)合酶為蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按質(zhì)量比為8:1.0:0.2混合的混合物，蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均為3.5萬u/g；(3)微波提?。合虿襟E(2)所得濾液中繼續(xù)加入復(fù)合酶，混合，然后置于微波提取器中提取，微波功率為280w，提取時(shí)間為8min；其中，每升濾液中加入0.25g復(fù)合酶，復(fù)合酶為蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按質(zhì)量比為8:1.0:0.2混合的混合物，蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均為3.5萬u/g；(4)酶解：向步驟(3)所得物質(zhì)中加入蛋白酶，于55℃條件下攪拌40min；其中，每升步驟(3)所得物質(zhì)中加入3g蛋白酶；(5)除雜：調(diào)節(jié)步驟(4)所得酶解產(chǎn)物的ph至10，然后加入氯化鈉，調(diào)節(jié)鹽度為2.5，攪拌1.5h，升溫至75℃，然后靜置15min，離心過濾，收集濾液，接著用孔徑為2μm的濾膜粗濾，再用孔徑為0.22μm的濾膜過濾，以除去雜質(zhì)，得濾液；(6)吸附：將步驟(5)所得濾液溫度調(diào)至55℃，ph調(diào)至9，加入樹脂中，吸附3.5h，收集樹脂；其中，每升濾液中加入5g樹脂，所用樹脂為d254樹脂；(7)清洗：將步驟(6)收集到的樹脂用清水清洗干凈，再用鹽度為20的鹽水洗脫樹脂2h，收集洗脫液，再用鹽度為22的鹽水洗脫樹脂1h，收集洗脫液；(8)沉淀：將步驟(7)所得兩次洗脫液合并，然后加入75％乙醇沉淀12h，除去上清液，得肝素鈉粗品；(9)精制：將肝素鈉粗品加水溶解，加入鹽酸溶液調(diào)節(jié)ph值為1.5，過濾，得濾液，然后再加氫氧化鈉調(diào)節(jié)濾液ph值為10，再加活性炭浸泡5h，過濾，得濾液，最后向?yàn)V液中加入75％乙醇沉淀6h，除去上清液，再真空干燥，得肝素鈉精品。實(shí)施例4與實(shí)施例3不同之處為，缺少步驟(2)超聲波酶解這個步驟。實(shí)施例5與實(shí)施例3不同之處為，步驟(2)超聲波酶解中不添加復(fù)合酶。實(shí)施例6與實(shí)施例3不同之處為，步驟(2)超聲波酶解中添加的酶為蛋白酶。實(shí)施例7與實(shí)施例3不同之處為，缺少步驟(3)微波提取這個步驟。實(shí)施例8與實(shí)施例3不同之處為，步驟(3)微波提取中不添加復(fù)合酶。實(shí)施例9與實(shí)施例3不同之處為，(3)微波提取中添加的酶為蛋白酶。實(shí)施例10與實(shí)施例3不同之處為，缺少步驟(4)酶解這個步驟。實(shí)施例11與實(shí)施例3不同之處為，步驟(5)除雜僅為離心，過濾，得濾液。實(shí)施例12與實(shí)施例3不同之處為，缺少步驟(6)吸附和步驟(7)清洗。實(shí)施例1-12所提供的肝素鈉的提取方法提取肝素鈉，其收率和純度見下表：收率純度(u/mg)實(shí)施例11100163實(shí)施例21080175實(shí)施例31000182實(shí)施例41300139實(shí)施例51500123實(shí)施例61360132實(shí)施例71250145實(shí)施例81475128實(shí)施例91400130實(shí)施例101216150實(shí)施例111189156實(shí)施例121225151上述收率是指提取一億iu肝素鈉所需的豬小腸數(shù)量。當(dāng)前第1頁12