本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種兔瘟口服疫苗il-2佐劑及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

兔病毒性出血癥(rabbithaemorrhagicdisease,rhd)是由兔病毒性出血癥病毒(rabbithaemorrhagicdiseasevirus,rhdv)引起的一種急性、高致性傳染病，又稱“兔瘟、兔出血癥”。本病主要以實(shí)質(zhì)性器官出血、淤血及水腫，氣管出血，肺臟的出血腫脹及高燒(>40℃)為主要特征。兔病毒性出血癥于1984年在中國(guó)江蘇江陰、無(wú)錫等地首次報(bào)道，在不到一年的時(shí)間里約1億4千萬(wàn)家兔因本病死亡，感染面積近5萬(wàn)平方公里。兔病毒性出血癥只感染兔，其中對(duì)家兔和歐洲野兔(oryctolaguscuniculus)危害最大，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)表明其它兔類動(dòng)物感染本病后并未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，包括黑尾兔(lepuscalifornicus)、火山兔(romerolagusdiazi)和棉尾兔(sylvilagusfloridanus)。本病主要感染二月齡以上青壯年家兔與成年兔，乳兔及一月齡仔兔并不易感。rhd的爆發(fā)暫無(wú)明顯季節(jié)性因素，但北方多在較寒冷的季節(jié)發(fā)生，可能與環(huán)境因素等條件影響了家兔抵抗力有關(guān)。rhdv的傳播可分為直接傳播與間接傳播；直接傳播指接觸病兔及帶毒兔，或者接觸帶毒兔的排泄物和分泌物；間接感染主要指接觸感染兔使用過(guò)的食具、籠具、飼養(yǎng)器械等。另外，rhdv還可以通過(guò)附著于商品上通過(guò)貿(mào)易活動(dòng)及遷徙的鳥(niǎo)類進(jìn)行傳播。本病爆發(fā)來(lái)勢(shì)兇猛，感染家兔通常呈急性死亡癥狀，病死率高達(dá)70％-90％。

vp60蛋白是rhdv的主要結(jié)構(gòu)蛋白，分子量大小約為60ku，180個(gè)vp60單體共同組成病毒粒子的核衣殼。是病毒免疫保護(hù)性抗原，在誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)中起重要作用。torrecuadradan等研究發(fā)現(xiàn)vp60蛋白n端的第31位至第250位氨基酸殘基是rhdv的主要抗原區(qū)域，并且c端的第477位至第579位氨基酸殘基也是rhdv的抗原區(qū)域。farnos等將rhdvast/89株的vp60基因轉(zhuǎn)入畢赤酵母系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，免疫vp60蛋白的兔子能夠產(chǎn)生強(qiáng)烈的特異性反應(yīng)，并能夠抵御攻毒計(jì)量為100ld50的同型病毒。

由于體外培養(yǎng)系統(tǒng)的缺乏，目前生產(chǎn)上針對(duì)rhd的預(yù)防主要以來(lái)注射組織滅活苗，為了增強(qiáng)疫苗免疫效應(yīng)常常將佐劑與疫苗共同免疫以增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)，常用的免疫佐劑主要有油佐劑、鋁佐劑、皂苷類佐劑和細(xì)胞因子佐劑等，但研究發(fā)現(xiàn)，油佐劑和皂苷類佐劑易引起較為嚴(yán)重的不良反應(yīng)或副作用，鋁佐劑針對(duì)細(xì)菌或寄生蟲(chóng)性抗原為良好佐劑但對(duì)th1免疫應(yīng)答(細(xì)胞免疫)較弱，然而細(xì)胞因子來(lái)源于宿主本身安全性高，能夠促進(jìn)機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)因此可作為基因工程疫苗的良好佐劑。

1976年，morgan等利用絲裂原刺激t淋巴細(xì)胞后在其表面發(fā)現(xiàn)一種對(duì)t細(xì)胞增殖具有正向調(diào)控作用的因子，故稱為t細(xì)胞增長(zhǎng)因子(tcellgrowthfactor,tcgf)，1979年正式更名為白細(xì)胞介素-2。il-2與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合是其發(fā)揮功能的首要條件，1981年，robb等首次證實(shí)了白介素-2受體(il-2r)的存在，隨后在活化的t、b淋巴細(xì)胞、大顆粒細(xì)胞(lgl)等細(xì)胞表面均證實(shí)了數(shù)量結(jié)構(gòu)不同的il-2r受體的存在。il-2r主要由3個(gè)亞基組成分別為α、β和γ鏈。根據(jù)與il-2親和力的不同可分為強(qiáng)、中、弱三類分別由α、β、γ鏈組成；α、β鏈組成；α鏈組成，其中il-2rα只與il-2特異性結(jié)合；同時(shí)，β鏈?zhǔn)莍l-15受體的重要組成部分；γ鏈?zhǔn)莍l-2、il-4、il-7等受體的必要組成成分。il-2r(α、β、γ)和il-2r(α、β)是il-2功能信號(hào)傳導(dǎo)的主要受體，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

il-2作用的細(xì)胞種類廣泛，主要作用與于cd4⁺、cd8⁺t細(xì)胞、b淋巴細(xì)胞、nk細(xì)胞和中性粒細(xì)胞；主要表現(xiàn)為誘導(dǎo)cd4⁺t細(xì)胞的增殖與分化、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)th1和th2型細(xì)胞的分化但抑制th17型細(xì)胞，參與cd8⁺t效應(yīng)細(xì)胞的增殖與分化、增強(qiáng)溶細(xì)胞活性、同時(shí)促進(jìn)cd8⁺t的增殖與分化，il-2主要通過(guò)自分泌的方式反作用于t淋巴細(xì)胞，即由t淋巴細(xì)胞分泌的il-2又可作用與t淋巴細(xì)胞本身，從而促進(jìn)自身的增殖與分化；il-2可促進(jìn)活化的b淋巴細(xì)胞的增殖、提高抗體(igg和igm)分泌水平；促進(jìn)nk細(xì)胞的增殖及相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生、提高溶細(xì)胞能力；促進(jìn)中性粒細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌。il-2可作用于多種細(xì)胞因子受體(圖1)，il-2通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子受體的表達(dá)量從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化，il-2能夠通過(guò)誘導(dǎo)il-12rβ2和il-12rβ1的表達(dá)促進(jìn)th1型細(xì)胞的分化；誘導(dǎo)il-4rα的表達(dá)從而促進(jìn)th2型細(xì)胞的分化；通過(guò)增強(qiáng)il-2rα的表達(dá)來(lái)對(duì)調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的分化進(jìn)行正向調(diào)節(jié)；除此之外il-2對(duì)部分淋巴細(xì)胞同樣存在抑制作用，例如il-2對(duì)th17型細(xì)胞的分化起負(fù)向調(diào)控作用，il-2對(duì)il-7rα同樣具有抑制作用以達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞凋亡和記憶型t細(xì)胞的生成。

白細(xì)胞介素-2發(fā)現(xiàn)至今已約40年之久，隨著人們對(duì)其研究的深入，il-2已成為在人類醫(yī)學(xué)和動(dòng)物醫(yī)學(xué)上進(jìn)行疾病的預(yù)防、診斷和治療的首選細(xì)胞因子，并且在基因工程疫苗的制備方面展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。雖然關(guān)于人類在健康和疾病狀態(tài)下的血清il-2的水平認(rèn)知仍然相對(duì)有限，但是部分研究仍然證明了il-2在疾病發(fā)生過(guò)程的二者的相關(guān)性：如升高的il-2的水平與非小細(xì)胞肺癌相關(guān)；此外，血清中高水平的il-2與自身免疫性疾病如硬皮病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)；無(wú)獨(dú)有偶，在慢性乙型肝炎患者體內(nèi)il-2水平也呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)；然而，值得注意的是，在許多研究中已經(jīng)證實(shí)可溶性il-2受體(sil-2r)的表達(dá)水平與部分自身免疫性疾病相關(guān)且sil-2r水平的升高與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，因此有人預(yù)測(cè)可以通過(guò)這一現(xiàn)象監(jiān)測(cè)疾病的復(fù)發(fā)。il-2對(duì)自身免疫性疾病的治療同樣有促進(jìn)作用，koreth等(korethj,matsuokak,kimht,etal.interleukin-2andregulatorytcellsingraft-versus-hostdisease[j].newenglandjournalofmedicine,2011,365(22):2055-2066.)對(duì)經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療無(wú)效的gvhd活動(dòng)期患者，注射適量的il-2發(fā)現(xiàn)受試者病情均得到好轉(zhuǎn)且部分患者的糖皮質(zhì)激素的注射劑量明顯低于使用前；saadoun等(saadound,rosenzwajgm,jolyf,et.al.regulatoryt-cellresponsestolow-doseinterleukin-2inhcv-inducedvasculitis[j].newenglandjournalofmedicine,2011,365(22):2067-2077.)采用類似的方法治療丙型肝炎患者，同樣取得成效。

il-2不僅在人類疾病治療與預(yù)防發(fā)面發(fā)揮重要作用，在動(dòng)物疾病防治方面同樣如此。多項(xiàng)研究表明，il-2可以提高機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答能力，并且可以促進(jìn)多種細(xì)胞因子的分泌與表達(dá)從而增強(qiáng)機(jī)體抵御和預(yù)防疾病的能力。il-2作為免疫治療劑和免疫增強(qiáng)劑在畜禽疾病治療方面發(fā)揮重要作用。隨著我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，迫于養(yǎng)殖條件、養(yǎng)殖環(huán)境等因素的影響，疾病的爆發(fā)也愈發(fā)嚴(yán)重，尤其是雞的馬立克氏病、雞的新城疫、傳染性法氏囊病、豬的呼吸與繁殖障礙綜合癥、圓環(huán)病、豬瘟等免疫抑制性疾病對(duì)畜禽業(yè)的發(fā)展造成巨大危害。作為免疫治療劑，il-2在上述疾病的治療上具有良好效果，lowenthal等(lowenthaljw,connickte,mcwaterspg,etal.developmentoftcellimmuneresponsivenessinthechicken[j].immunology&cellbiology,1994,72(2):115-122.)將il-2注入剛孵化的t淋巴細(xì)胞的小雞可產(chǎn)生一定保護(hù)力，秦翠麗等(秦翠麗,李松彪,邱智軍,等.白細(xì)胞介素-2對(duì)兔大腸桿菌病的治療試驗(yàn)[j].中國(guó)畜牧雜志,2007,43(9):61-62.)利用il-2治療患大腸桿菌病的家兔，治愈率高達(dá)95％，il-2在犬傳染性肝炎的治療上同樣取得良好成效；另一方面，鑒于il-2具有提高機(jī)體免疫性應(yīng)答水平、促進(jìn)各種炎性細(xì)胞的增殖及分化等功能，研究者逐漸將目光轉(zhuǎn)向il-2作為疫苗佐劑或與疫苗聯(lián)合表達(dá)以期望達(dá)到更好的免疫效果上。余波等(余波.鵝白細(xì)胞介素-2成熟蛋白基因表達(dá)及其免疫佐劑效應(yīng)的研究[d]；四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.)通過(guò)將鵝白介素2與小鵝瘟弱毒苗共同注射青年鵝發(fā)現(xiàn)，佐劑組可以有效的增強(qiáng)細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答并明顯提高免疫保護(hù)率；謝榮輝等(謝榮輝,萬(wàn)旺軍,李龍,等.雞白細(xì)胞介素2口服免疫佐劑增強(qiáng)傳染性法氏囊病病毒dna疫苗免疫效果的研究[j].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版),2007,33(3):237-242.)通過(guò)口服重組il-2質(zhì)粒與ibdv聯(lián)合免疫雛雞發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組中il-2能夠明顯增強(qiáng)t、b淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)且具有較高的免疫保護(hù)率；希尼尼根等(希尼尼根，程安春，汪銘書(shū)，等，豬il-2真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及對(duì)prrsv-orf5基因疫苗免疫佐劑作用的研究[j].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，38(9):1003-1008)將構(gòu)建好的真核質(zhì)粒與prrs疫苗聯(lián)合免疫豬發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的igg含量、t淋巴細(xì)胞增殖活性、cd4⁺和cd8⁺的比例明顯增高。在基因工程疫苗的研制過(guò)程中常常將細(xì)胞因子基因與抗原基因串聯(lián)在一起進(jìn)行融合表達(dá)，一方面克服細(xì)胞因子在體內(nèi)半衰期短、價(jià)格昂貴等缺陷、另一方面在一定程度上增強(qiáng)單基因核酸疫苗的免疫效果。亓麗紅等(亓麗紅,朱劍英,艾武,等.雞新城疫病毒f基因與雞白介素-2(il-2)基因在真核載體中串連表達(dá)及免疫原性[j].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2012,20(11):1327-1332.)將雞il-2與新城疫病毒的f蛋白進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)并免疫spf雞發(fā)現(xiàn)，免疫后20d實(shí)驗(yàn)組抗體水平達(dá)到峰值并明顯高于純疫苗組，保護(hù)率達(dá)到70％；侯洪烈等(侯洪烈,張?jiān)S科,李運(yùn)娜,等.adf-il-2基因重組卡介苗的構(gòu)建及免疫保護(hù)效果[j].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2013,33(7):1016-1020.)將柔嫩艾美爾球蟲(chóng)adf基因與il-2基因融合表達(dá)免疫雛雞，抗球蟲(chóng)指數(shù)高達(dá)172.89并且在一定程度上能夠抵御球蟲(chóng)卵囊的攻擊；吳志明等(吳志明,閆若潛,王東方,等.pcv2orf2/il-2嵌合表達(dá)質(zhì)粒在豬體免疫及免疫保護(hù)效果研究；中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2010學(xué)術(shù)年會(huì)暨中國(guó)獸醫(yī)臨床大會(huì),2010[c])將豬il-2基因與豬圓環(huán)病毒2型orf2基因進(jìn)行嵌合表達(dá)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明融合組的抗體水平顯著高于無(wú)佐劑組，攻毒后28d融合質(zhì)粒組免疫豬的tc含量顯著高于單基因疫苗組，免疫保護(hù)力也明顯高于后者。綜上，il-2在畜禽基因工程疫苗的研制方面已取得了顯著的效果，事實(shí)表明，il-2與保護(hù)性抗原基因的融合表達(dá)對(duì)疾病的預(yù)防與治療具有一定效果，奠定了il-2作為基因疫苗佐劑的研究基礎(chǔ)。

現(xiàn)有針對(duì)細(xì)胞因子佐劑的制備方法主要為原核表達(dá)方法，對(duì)目的基因進(jìn)行克隆連接至原核表達(dá)載體如pet-32等，然后將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，同時(shí)需要對(duì)表達(dá)的相關(guān)條件進(jìn)行優(yōu)化以達(dá)到最優(yōu)條件，同時(shí)需要對(duì)重組表達(dá)蛋白的可溶性進(jìn)行檢測(cè)。原核表達(dá)蛋白的純化主要通過(guò)對(duì)細(xì)菌的大量培養(yǎng)破碎后進(jìn)行目的蛋白的純化最終應(yīng)用于動(dòng)物的免疫，主要流程如下：將目的基因克隆至原核表達(dá)載體上，然后通過(guò)轉(zhuǎn)化到bl21等菌株中，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，然后進(jìn)行蛋白純化。原核表達(dá)的缺點(diǎn)如下：(1)由于缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機(jī)制，只能表達(dá)克隆的cdna，不宜表達(dá)真核基因組dna；(2)由于缺乏適當(dāng)?shù)姆g后加工機(jī)制，表達(dá)的真核蛋白質(zhì)不能形成適當(dāng)?shù)恼郫B或進(jìn)行糖基化修飾；(3)表達(dá)的蛋白質(zhì)常常形成不溶性的包涵體，欲使其具有活性尚需進(jìn)行復(fù)雜的復(fù)性處理；(4)很難表達(dá)大量的可溶性蛋白，因此需要對(duì)蛋白表達(dá)的條件進(jìn)行優(yōu)化等等，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；(5)原核表達(dá)后的蛋白免疫時(shí)多需要進(jìn)行乳化，乳化過(guò)程雖簡(jiǎn)單但較為費(fèi)時(shí)，且乳化后的蛋白免疫方式多為注射，易使動(dòng)物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，影響免疫效果。

目前對(duì)于兔病毒性出血癥(rabbithaemorrhagicdisease,rhd)的預(yù)防主要通過(guò)注射組織滅活苗的方式，雖取得了一定效果，但隨著滅活苗的應(yīng)用同樣發(fā)現(xiàn)些許弊端，疫苗制備原材料的獲取困難、制備過(guò)程的繁瑣及存在生物安全性問(wèn)題等弊端在一定程度上限制了本病的預(yù)防。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供一種兔瘟口服疫苗il-2佐劑及應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了一種家兔il-2的真核表達(dá)載體pvax1-il-2，該載體裝載有家兔il-2基因。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種含有上述的真核表達(dá)載體pvax1-il-2的重組菌。

進(jìn)一步地，所述重組菌為重組沙門氏菌。

進(jìn)一步地，所述的重組沙門氏菌為重組減毒沙門氏菌sl7207，命名為sl7207-pvax1-il-2。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種上述的真核表達(dá)載體pvax1-il-2或者上述的重組菌sl7207-pvax1-il-2在制備預(yù)防兔病毒性出血癥的口服疫苗免疫佐劑或口服疫苗中的應(yīng)用。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種預(yù)防兔病毒性出血癥的口服疫苗免疫佐劑或口服疫苗，是由上述的重組菌sl7207-pvax1-il-2和重組菌sl7207-pvax1-vp60混合制備而成。

進(jìn)一步地，所述重組菌sl7207-pvax1-il-2與重組菌sl7207-pvax1-vp60的體積比為1:1，所述重組菌sl7207-pvax1-il-2與重組菌sl7207-pvax1-vp60的濃度均為5×10⁹cfu/ml。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種上述的預(yù)防兔病毒性出血癥的口服疫苗免疫佐劑或口服疫苗在制備預(yù)防兔病毒性出血癥的藥物中的用途。

進(jìn)一步地，所述預(yù)防兔病毒性出血癥的藥物的劑型為口服劑。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：

1)安全、生物安全性高：本發(fā)明所制疫苗屬基因工程疫苗，相比于常規(guī)組織滅活苗僅包被部分抗原基因即可達(dá)到較高的抗體水平，避免了組織滅活苗因滅活不徹底而導(dǎo)致的易散毒問(wèn)題，同時(shí)提高了生物安全性。

2)真核表達(dá)產(chǎn)物更接近天然構(gòu)象且具有活性：運(yùn)用真核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)，使目的蛋白更真實(shí)地接近天然構(gòu)象，從而使蛋白有生物活性。相比之下傳統(tǒng)的原核表達(dá)產(chǎn)物通常是沒(méi)有活性或者活性很低，經(jīng)常需要復(fù)性才能獲得有活性的蛋白，因?yàn)樵思?xì)胞內(nèi)缺少如分子伴侶和一些與糖基化，乙酰化以及二硫健形成的一些維持蛋白正確構(gòu)象的功能蛋白。

3)免疫方式簡(jiǎn)單高效：將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入減毒細(xì)菌載體sl7207通過(guò)口服免疫的方式避免了常規(guī)疫苗注射方式給動(dòng)物帶來(lái)的應(yīng)激；同時(shí)減毒沙門氏菌較強(qiáng)的腸道侵襲性能夠保證重組表達(dá)系統(tǒng)在體內(nèi)的充分表達(dá)；疫苗的制備僅需培養(yǎng)細(xì)菌即可省時(shí)省力。

4)疫苗制備簡(jiǎn)單：只需通過(guò)培養(yǎng)細(xì)菌即可，同時(shí)運(yùn)輸及保存方便；從實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示疫苗佐劑組在抗體水平和il-4表達(dá)水平上相比于單疫苗組均有顯著的提高，可以有效的增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫促進(jìn)特異性抗體分泌及il-4的表達(dá)。

5)雙重佐劑效果：試驗(yàn)所使用的減毒沙門氏菌sl7207雖已減毒但仍保留了沙門氏菌較強(qiáng)的腸道侵襲性能夠保證重組表達(dá)系統(tǒng)在體內(nèi)的充分表達(dá)，另一方面在一定程度上sl7207同樣可以被看作一種疫苗佐劑促進(jìn)并刺激機(jī)體免疫應(yīng)答。

5)本發(fā)明分別構(gòu)建減毒沙門氏菌sl7207遞呈的重組菌株sl7207-pvax1-il2和sl7207-pvax1-vp60并將兩種重組細(xì)菌共同免疫家兔，il-2能夠發(fā)揮免疫刺激作用從而增強(qiáng)口服疫苗的免疫效果。

當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。

附圖說(shuō)明

此處所說(shuō)明的附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1是背景技術(shù)中il-2對(duì)細(xì)胞因子受體的調(diào)節(jié)作用；

圖2是本發(fā)明兔il-2基因pcr擴(kuò)增結(jié)果，其中，m:dl2000marker；1:陰性對(duì)照；2：il-2基因擴(kuò)增產(chǎn)物(482bp)；

圖3是本發(fā)明pmd19-t-il-2重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果，其中，m:dl2000marker；1:il-2pcr產(chǎn)物；2：pmd19-t-il-2重組質(zhì)粒單酶切產(chǎn)物3：pmd19-t-il-2重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；

圖4是本發(fā)明pvax1-il2單雙酶切鑒定結(jié)果；其中，1代表dl2000marker，2代表il-2單基因片段，3代表pvax1-il2的質(zhì)粒模板的單酶切，4代表pvax1-il2的質(zhì)粒模板的雙酶切；

圖5是本發(fā)明轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞蛋白免疫印跡試驗(yàn)；其中，m：marker1：細(xì)胞蛋白；

圖6是本發(fā)明重組細(xì)菌sl7207-pvax1-il-2及單雙酶切鑒定；其中，m代表dl2000marker；1代表sl7207-pvax1-il-2pcr鑒定；2代表sl7207-pvax1-il2雙酶切結(jié)果；3代表sl7207-pvax1-il-2單酶切結(jié)果；

圖7是本發(fā)明重組沙門氏菌16srdna測(cè)序鑒定結(jié)果；

圖8是本發(fā)明實(shí)施例4中的抗體水平，其中，空載：sl7207-pvax1，vp60：sl7207-pvax1-vp60，混合：sl7207-pvax1-vp60+sl7207-pvax1-il-2(不同字母表示差異顯著)；

圖9是本發(fā)明實(shí)施例4中的il-4含量檢測(cè)，其中，空載：sl7207-pvax1，vp60：sl7207-pvax1-vp60，混合：sl7207-pvax1-vp60+sl7207-pvax1-il-2(不同字母表示差異顯著)。

具體實(shí)施方式

以下將配合實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，藉此對(duì)本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來(lái)解決技術(shù)問(wèn)題并達(dá)成技術(shù)功效的實(shí)現(xiàn)過(guò)程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。

實(shí)施例1家兔il-2基因(登陸號(hào)：nm_001163180.1)和vp60基因的克隆

1.1總rna提取(以健康家兔脾臟為材料進(jìn)行組織rna的提取)具體操作步驟如下：

(1)在無(wú)菌條件下用剪刀對(duì)組織(100mg)進(jìn)行破碎，無(wú)菌條件下液氮研磨至粉末狀，加入1ml裂解液。

(2)將研磨后的組織液裝入離心管中室溫靜置5min。

(3)靜置后的組織液4℃、12000r/min離心5min，除脂肪蛋白等，吸取上清液加入2ml離心管中。

(4)向離心管中加入氯仿200μl，猛烈振蕩15sec，靜置5min。4℃、12000r/min離心15min。

(5)離心后的溶液分為上中下三層(無(wú)色水相、白色蛋白質(zhì)、有機(jī)相)，將上層無(wú)色相加入新的離心管中。加入適量異丙醇，輕微混勻，靜置10min。

(6)靜置后的離心管12000r/min、4℃條件下離心10min(一般管底會(huì)出現(xiàn)白色沉淀)。

(7)小心棄去上清液，沿管壁緩慢加入預(yù)冷的75％乙醇，輕輕混勻，12000r/min、4℃、5min。

(8)棄去酒精，室溫條件下干燥2-5min，加入10μl(rnaise-free)depc水溶解，-80℃保存，待反轉(zhuǎn)錄用。

1.2cdna的合成

參照primescript^tmrtreagentkitwithgdnaeraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行rna的反轉(zhuǎn)錄。具體反應(yīng)體系如下：

(1)去除基因組dna反應(yīng)如下表：

表1去除基因組dna反應(yīng)

反應(yīng)條件：42℃、2min，反應(yīng)結(jié)束后立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄

(2)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下表

表2反轉(zhuǎn)錄體系

反應(yīng)條件：37℃、15min，85℃、5sec，反應(yīng)結(jié)束后cdna保存至-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3引物的設(shè)計(jì)與合成

參照ncbigenbank中已公布的家兔il-2序列和vp60序列，運(yùn)用生物軟件oligo6.0或primer5.0設(shè)計(jì)1對(duì)引物序列如下表，用于兔源il-2基因和vp60基因的擴(kuò)增及后續(xù)表達(dá)載體的構(gòu)建，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為482bp和1760bp。

注：gctagc、aagctt分別為nhei、hindiii酶切位點(diǎn)；atgatgatgatgatgatg為組氨酸標(biāo)簽；gctagcatg為kozak序列。

1.4目的基因的pcr擴(kuò)增

以得到的cdna為模板，采用高保真酶對(duì)il-2和vp60基因進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下表：

表3pcr反應(yīng)體系

反應(yīng)條件分別為：

il-2基因的擴(kuò)增：95℃4min；95℃1min，58℃30sec，72℃40sec，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，產(chǎn)物12℃保存。

vp60的pcr擴(kuò)增條件如下：95℃4min；95℃1min，65℃1min，72℃2min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，產(chǎn)物12℃保存。

反應(yīng)結(jié)束后，取5μl產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，120v，30min，在紫外燈下觀察目的片段大小與預(yù)期片段大小進(jìn)行比較，pcr產(chǎn)物送公司進(jìn)行測(cè)序比較。

1.5目的基因pcr產(chǎn)物的ta克隆

(1)pcr產(chǎn)物的純化

pcr產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳結(jié)束后在紫外燈下觀察并切下對(duì)應(yīng)目的片段大小的凝膠，放入ep管中使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(minibestagarosegeldnaextractionkit)進(jìn)行膠回收，具體操作方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將膠回收產(chǎn)物分別與6×loadingbuffer按照1：5體積比混勻后再次進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶大小與目的片段比較以確定所回收片段為目的基因。

(2)連接

采用19-tsimplevector試劑盒對(duì)目的基因片段分別進(jìn)行t/a克隆，具體反應(yīng)體系如下：19-tsimplevector1μl、solutioni5μl、dna模板3μl、dh2o1μl(共10μl)，16℃條件下反應(yīng)過(guò)夜。

(3)轉(zhuǎn)化

a.將連接產(chǎn)物(10μl)全部加入100μldh5α感受態(tài)細(xì)胞中冰上孵育30min。

b.反應(yīng)結(jié)束后立即42℃熱刺激90sec，隨后在冰水中孵育5min。

c.向離心管中加入890μllb液體培養(yǎng)基，37℃(150r/min)培養(yǎng)2h。

d.取400μl菌液均勻的平鋪在事先溫浴好的amp-lb平板上，待菌液完全吸收后，將平板置于37℃培養(yǎng)箱中翻轉(zhuǎn)靜置培養(yǎng)過(guò)夜。

(4)鑒定

挑取單個(gè)白色菌落一部分加入預(yù)混合好的pcr反應(yīng)液進(jìn)行菌落pcr鑒定，反應(yīng)條件參照1.4，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行凝膠電泳與目的片段大小進(jìn)行比對(duì)，菌落另一部分接種于10mlamp-lb肉湯中擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃(180r/min)培養(yǎng)過(guò)夜，對(duì)鑒定為陽(yáng)性的菌落培養(yǎng)的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，送公司測(cè)序鑒定。將克隆得到的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切(反應(yīng)體系見(jiàn)下表4)和測(cè)序鑒定，將測(cè)序正確的大腸桿菌分別命名為dh5αpmd19-t-il-2和dh5αpmd19-t-vp60，質(zhì)粒分別命名為pmd19-t-il-2和pmd19-t-vp60。

表4酶切反應(yīng)體系

2、結(jié)果與分析

(1)以家兔脾臟rna為模板，加入特異性引物pcr擴(kuò)增后，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段大小與預(yù)期相符(圖2)。

(2)將pcr產(chǎn)物經(jīng)純化后連接中pmd19-t載體，重組質(zhì)粒經(jīng)nhei和hindiii單雙酶切鑒定后與預(yù)期大小片段相符。陽(yáng)性大腸桿菌命名為dh5αpmd19-t-il-2，質(zhì)粒命名為pmd19-t-il-2(圖3)，同理，得到質(zhì)粒pmd19-t-vp60。

實(shí)施例2家兔il-2和vp60的真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)

1重組載體的構(gòu)建

(1)t克隆鑒定正確的質(zhì)粒，按照下表5中的酶切體系同時(shí)對(duì)t-il2以及pvax1載體進(jìn)行酶切。

表5酶切體系

將酶切后的片段進(jìn)行膠回收并16℃過(guò)夜，反應(yīng)體系如下表6：

表6t4連接酶連接反應(yīng)體系

(2)轉(zhuǎn)化及鑒定

轉(zhuǎn)化具體操作流程參照實(shí)施例1中的1.5(3)，將amp-lb平板換為kan-lb，將pmd19-t載體更換為pvax1真核表達(dá)載體；鑒定同上，將amp換為kan。

結(jié)果如圖4所示，通過(guò)菌落pcr鑒定及特異性限制性內(nèi)切酶酶切鑒定可以得出il-2已成功連接至真核表達(dá)載體pvax1，重組真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建完成，獲得的重組真核表達(dá)質(zhì)粒分別命名為pvax1-il-2，同理，構(gòu)建成重組真核表達(dá)質(zhì)粒pvax1-vp60。

2目的蛋白表達(dá)的鑒定

2.1質(zhì)粒的制備

取100μl重組細(xì)菌接種于10mlkan-lb液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，無(wú)菌條件下取1ml菌液加入100mlkan-lb液體培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)。采用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒進(jìn)行去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提并保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

293t細(xì)胞的培養(yǎng)：將293t細(xì)胞接種于75mm²的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞基本平鋪整個(gè)細(xì)胞瓶后，棄培養(yǎng)液，使用10ml預(yù)熱好的pbs溶液沖洗三遍，然后加入經(jīng)預(yù)熱處理的0.25％胰酶300μl，輕輕搖晃、緩慢吹打至細(xì)胞呈單個(gè)散在游離狀態(tài)，立即加入15ml細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液終止胰酶消化反應(yīng)，輕輕吹打至在顯微鏡下細(xì)胞漂浮于營(yíng)養(yǎng)液之上的狀態(tài)。將消化下來(lái)的細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種量約為2ml，細(xì)胞匯合度達(dá)到80％待用。

2.2293t細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

用6孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80％進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照dnafecttransfectionreagent說(shuō)明書(shū)進(jìn)行pvax1-il2質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，取4μg質(zhì)粒dna與10μldna轉(zhuǎn)染試劑分別稀釋于100μl的opti-mem中，將稀釋的dna與轉(zhuǎn)染試劑均勻混合后室溫孵育20min，緩慢加入細(xì)胞板，輕輕搖動(dòng)混勻，設(shè)置空質(zhì)粒載體pvax1為空白對(duì)照，在5％co2條件下培養(yǎng)48-72h后進(jìn)行目的基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)。

2.3western-blot檢測(cè)

2.3.1293t細(xì)胞蛋白的提取

待轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48-72h進(jìn)行目的基因表達(dá)的檢測(cè)，將培養(yǎng)液吸凈，每孔加入1mltrizol裂解細(xì)胞，充分吹打幾次后將裂解液移入新的離心管中，加入氯仿200μl/管，搖晃混勻，室溫下靜置3-5min。靜置后離心15min(12000r/min，4℃)，離心后裂解液分上中下三層吸取中下層并加入5倍體積的丙酮，冰上孵育1h，離心20min(2000r/min，4℃)，棄去上清后室溫干燥，加入5×loadingbuffer，95℃恒溫30min，-20℃保存待sds-page用。

2.3.2western-blot檢測(cè)

western-blot具體操作如下：

轉(zhuǎn)膜：將處理好的蛋白樣品進(jìn)行sds-page電泳，同時(shí)參照凝膠大小裁剪pvdf膜一片和6片濾紙，將pvdf膜和濾紙分別放入甲醇溶液、轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡10-15min備用，從下至上依次放置三層濾紙、pvdf膜、膠、三層濾紙，放置過(guò)程中運(yùn)用玻璃棒滾動(dòng)以免形成氣泡影響轉(zhuǎn)膜效率，100-150v，轉(zhuǎn)膜90min。

膜的封閉：將pvdf膜取出后放入干凈的平皿中加入適量3％bsa的tbst緩沖液(沒(méi)過(guò)膜)，37℃輕搖2h。

洗膜：棄去封閉液，用tbst緩沖液洗膜3次(10min/次)。

一抗孵育：棄去tbst，將一抗anti-6xhistag抗體按1：1000的比例稀釋于0.5％bsa/tbst，迅速加入平皿中，37℃輕搖1h。

洗膜：棄去一抗，用tbst緩沖液洗膜3～5次(10min/次)。

二抗孵育：棄tbst，將二抗hrp標(biāo)記的羊抗鼠igg稀釋于0.5％bsa/tbst(稀釋比例1：5000)，加入平皿37℃溫和孵育2h。

洗膜：棄去二抗，用tbst緩沖液洗膜3～5次(10min/次)。

顯色：將ecl試劑盒的a液和b液在試管內(nèi)等體積混合(共2ml)，迅速滴加于pvdf膜的正面，直接進(jìn)行曝光顯色。

結(jié)果：對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行蛋白提取，并進(jìn)行蛋白免疫印跡試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在17kda左右出現(xiàn)單一條帶(如下圖5)，與目的片段大小近似，由此看出，真核表達(dá)載體pvax1-il-2在細(xì)胞中能夠完成瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及表達(dá)。

實(shí)施例3減毒沙門氏菌口服疫苗佐劑的構(gòu)建

3.1沙門氏菌感受態(tài)的制備

將-80℃低溫保存的減毒沙門氏菌(sl7207)劃線接種于普通lb固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取形態(tài)均勻的單個(gè)菌落接種于10mllb液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩(160r/min)培養(yǎng)12-16h后，提取細(xì)菌dna進(jìn)行pcr鑒定并送測(cè)序。將鑒定正確的沙門氏菌(sl7207)接種至10％甘油中，分裝并保存于-20℃中備用。

將復(fù)蘇后的沙門氏菌劃線接種于lb平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜后，挑取單個(gè)均一菌落接種到5mllb肉湯中，37℃(160r/min)振蕩培養(yǎng)12-16h后，吸取1ml菌液接種到100mllb肉湯中，37℃(160r/min)振蕩培養(yǎng)至od600為0.5～0.6左右，將菌液4℃(4000r/min)離心10min，用預(yù)冷的去離子水重懸清洗菌體以去除胞內(nèi)分泌物，重復(fù)兩次以充分洗滌菌體，將沙門氏菌分裝成小量接種于500μl的15％甘油中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2電轉(zhuǎn)化

(1)電轉(zhuǎn)杯依次經(jīng)70％和100％乙醇浸泡過(guò)夜后，用去離子水對(duì)電轉(zhuǎn)杯內(nèi)外進(jìn)行反復(fù)沖洗以去除酒精，擦凈后，將電轉(zhuǎn)杯置于紫外燈下光照過(guò)夜以充分滅菌。

(2)將-80℃保存的沙門氏菌感受態(tài)置于冰上解凍后加入電轉(zhuǎn)杯中，分別加入pvax1空載體、pvax1-vp60和pvax1-il-2質(zhì)粒2-5μg，微量移液器輕輕混勻，以上操作均在冰上進(jìn)行。

(3)取出電轉(zhuǎn)杯，用紙巾擦干杯壁外側(cè)的水，放入電轉(zhuǎn)儀中準(zhǔn)備電轉(zhuǎn)，具體參數(shù)如下：電壓：1800v，電阻：200ω，電容：25μf。

(4)迅速取出電轉(zhuǎn)杯，將電轉(zhuǎn)杯中的菌液接種至800μllb液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)1h。

(5)將培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行低速離心(4000r/min，5min)以收集菌體，離心后棄去約400μl上清液，重懸菌體后均勻的平鋪在kan-lb平板上，待完全吸收后，37℃翻轉(zhuǎn)倒置培養(yǎng)過(guò)夜。

3.3重組菌的鑒定

挑取單個(gè)形態(tài)均一的菌落，加入預(yù)混合的pcr反應(yīng)液中進(jìn)行菌落pcr鑒定并進(jìn)行革蘭氏染色鑒定，同時(shí)將菌落的另一部分加入含kan的10mllb液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，將鑒定為陽(yáng)性的克隆子擴(kuò)大培養(yǎng)后收集菌體，分別提取細(xì)菌基因組dna和質(zhì)粒；運(yùn)用細(xì)菌通用引物進(jìn)行細(xì)菌16srdna的鑒定、對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行單雙酶切鑒定，將構(gòu)建成功的重組菌分別命名為sl7207-pvax1、sl7207-pvax1-vp60和sl7207-pvax1-il-2。

實(shí)施例4動(dòng)物免疫

4.1口服重組菌株的制備

(1)活菌計(jì)數(shù)：將重組沙門氏菌sl7207-pvax1-vp60和sl7207-pvax1-il-2劃線接種于含kan的lb平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落接入10mllb肉湯中，37℃、120r/min培養(yǎng)過(guò)夜，吸取適量菌液以1：100的比例加入100ml的kan-lb中，160r/min培養(yǎng)6h后，取適量菌液分別進(jìn)行10^-3、10^-4、10^-5倍比稀釋后接種至含kan-lb平板上，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)24h后進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。

(2)口服疫苗的制備：按照(1)中方法確定好細(xì)菌濃度后，以7000r/min沉淀菌體，并用0.01mol/l的無(wú)菌pbs洗三遍以除去胞外產(chǎn)物，并利用pbs將細(xì)菌濃度調(diào)整至5×10⁹cfu/ml，每試驗(yàn)組各制備20ml，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

4.2免疫及采血

45只(30日齡)家兔購(gòu)自成都天元兔業(yè)有限公司，免疫前暫養(yǎng)7d以觀察實(shí)驗(yàn)兔健康狀況，并抽取耳中動(dòng)脈血進(jìn)行rhdv特異性抗體檢測(cè)以確定實(shí)驗(yàn)兔rhdv為陰性。暫養(yǎng)7d后，45只家兔共分為3組，每組15只，第一組至第三組分別口服1ml濃度為5×10⁹cfu/ml的sl7207-pvax1、sl7207-pvax1-vp60、sl7207-pvax1-vp60+sl7207-pvax1-il-2(sl7207-pvax1-vp60和sl7207-pvax1-il-2的體積含量均為0.5ml)，第一組至第三組分別在第21d進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫前斷水8小時(shí)。在免疫后的7d、14d、28d、42d各實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取4只家兔進(jìn)行耳中央動(dòng)脈采血。

4.3血清制備

將采集的兔血37℃靜置1h后，置于4℃過(guò)夜，以便血清更易析出，4000r/min離心15-20min收集血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.4抗體水平監(jiān)測(cè)

將采集的兔血37℃靜置1h后，置于4℃過(guò)夜，以便血清更易析出，4000r/min離心15-20min收集血清，將待測(cè)血清稀釋50倍后采用兔瘟抗體elisa檢測(cè)試劑盒進(jìn)行血清特異性igg的檢測(cè)，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

如圖8所示，免疫后7d開(kāi)始，單疫苗組與混合疫苗組抗體水平均有明顯上升，在免疫后28d，混合疫苗組特異性抗體水平顯著高于單疫苗組并且在免疫后42d混合疫苗組抗體水平達(dá)到峰值，仍顯著高于單疫苗組。

4.5il-4含量水平監(jiān)測(cè)

兔源白介素-4檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，利用試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線后，將血清稀釋10倍后進(jìn)行兔白介素4表達(dá)量的檢測(cè)，反應(yīng)結(jié)束后立即將樣品放入酶標(biāo)儀中進(jìn)行讀數(shù)，按照標(biāo)準(zhǔn)品含量制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算il-4的表達(dá)量。

上述說(shuō)明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對(duì)其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過(guò)上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí)進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>四川農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種兔瘟口服疫苗il-2佐劑及應(yīng)用

<130>2017

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

cggctagcatgggttacaaagtacaactcttg32

<210>2

<211>48

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ccaagcttttaatgatgatgatgatgatgtgaactcgatgctgagatg48

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<212>dna

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cggctagcatggagggcaaagcccgcac28

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<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ccaagctttcaatgatgatggacataagaaaagccattg39