本發(fā)明屬于基因檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種分子信標(biāo)探針及引物對(duì)、gc基因snps位點(diǎn)檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

維生素d結(jié)合蛋白(group-specificcomponent/vitamindbindingprotein，gc)最初被稱為“種群特異性成分(沿用gc作為其正式縮寫(xiě)的原因)”，是白蛋白超家族的一員，存在于血漿等多種體液和多種類型的細(xì)胞表面。在血漿中，gc能夠與大部分維生素d或其代謝產(chǎn)物結(jié)合，并將其運(yùn)輸?shù)桨薪M織；同時(shí)，gc還具有其它功能，如清除胞外肌動(dòng)蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸、結(jié)合內(nèi)毒素、保護(hù)并增強(qiáng)補(bǔ)體因子c5a功能、影響t細(xì)胞反應(yīng)、調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞和破骨細(xì)胞，從而在脂代謝、免疫反應(yīng)、骨健康等方面發(fā)揮特定作用。

編碼gc蛋白的基因在人染色體上定位為4q13.3，具有超過(guò)200多種單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)和相應(yīng)基因型，其中三種最主要的基因型是根據(jù)位于第11號(hào)外顯子上的rs7041和rs4588兩個(gè)snps判定的。已知rs7041的g/t多態(tài)性和rs4588的a/c(最新數(shù)據(jù)顯示有極其罕見(jiàn)的t)多態(tài)性在單倍體中的基因型為g-c、t-c和t-a三種(沒(méi)有g(shù)-a)，文獻(xiàn)習(xí)慣上分別用1s、1f和2表示這三種單倍體基因型[對(duì)應(yīng)第432與436(原第416與420)位的氨基酸分別是glu與thr、asp與thr和asp與lys]，并可組合成6種二倍體基因型，即1f/1f、1s/1s、2/2、1f/1s、1f/2和1s/2。這些snps所致的氨基酸差異會(huì)導(dǎo)致血漿gc濃度差異，并可能對(duì)gc蛋白的功能產(chǎn)生不同程度的影響而使人體可能表現(xiàn)出差異的表型或健康效應(yīng)。gc濃度差異也可能通過(guò)影響血循環(huán)25羥維生素d(25-hydroxyvitamind，25ohd)濃度水平而產(chǎn)生維生素d營(yíng)養(yǎng)水平差異相關(guān)的表型。已知有9.9％的血循環(huán)25ohd濃度水平差異與上述rs7041和rs4588這兩個(gè)snps有關(guān)。因此，對(duì)人群的這兩個(gè)snps進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)分析gc基因與多種疾病風(fēng)險(xiǎn)和表型的相關(guān)性具有研究與預(yù)測(cè)價(jià)值。

針對(duì)rs7041和rs4588兩個(gè)snps的基因型分析，最早用多種檢測(cè)技術(shù)同時(shí)進(jìn)行驗(yàn)證分析的論文發(fā)表于1992年。該研究旨在分析鑒定這兩個(gè)snps在人群中實(shí)際存在的情況，采用的方法包括：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)后的限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(pcr-rflp)、taqman探針和測(cè)序三種。后來(lái)研究采用的方法還包括：等位基因特異性競(jìng)爭(zhēng)pcr基因分型法、芯片法等。pcr-rflp雖然廉價(jià)，但其操作步驟繁瑣，且需要兩個(gè)獨(dú)立的rflp實(shí)驗(yàn)進(jìn)行基因分型，在分析大量樣本時(shí)，尤其費(fèi)時(shí)。taqman探針、kasp和goldengate等技術(shù)也不能在一次反應(yīng)中同時(shí)對(duì)兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行分析。以taqman探針不論混合還是單獨(dú)反應(yīng)分析這兩個(gè)相距10bp的rs7041和rs4588時(shí)，都需精心設(shè)計(jì)、測(cè)試多套探針，增加了試劑成本。kasp、goldengate、時(shí)間飛行質(zhì)譜、測(cè)序等方法都依賴于昂貴的設(shè)備、封閉的試劑和較高的實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)，甚至需要摸索建立適宜的檢測(cè)條件；且因其單次運(yùn)行所需試劑用量有最低要求，間歇與隨時(shí)開(kāi)機(jī)運(yùn)行的成本較高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種分子信標(biāo)探針及引物對(duì)、gc基因snps位點(diǎn)檢測(cè)方法，旨在解決現(xiàn)有g(shù)c基因snps位點(diǎn)檢測(cè)步驟繁瑣、耗時(shí)、成本高的技術(shù)問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一方面，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)gc基因snps位點(diǎn)的分子信標(biāo)探針，所述分子信標(biāo)探針用于同時(shí)檢測(cè)gc基因多態(tài)性位點(diǎn)rs7041和rs4588，包括依次連接的上游序列、核心序列和下游序列，其中，所述核心序列為：5’-[g/t]gccacaccca[a/c]-3’或5’-[g/t]tgggtgtggc[a/c]-3’，所述上游序列和所述下游序列均包括：至少三個(gè)與gc基因互補(bǔ)配對(duì)的堿基或至少兩個(gè)與gc基因互補(bǔ)配對(duì)的c或g堿基；

同時(shí)，所述分子信標(biāo)探針的長(zhǎng)度為25-35bp，tm值為62-65℃，所述分子信標(biāo)探針的5’端和3’端分別用熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記。

另一方面，本發(fā)明提供一組用于檢測(cè)gc基因snps位點(diǎn)的分子信標(biāo)探針和引物對(duì)，所述分子信標(biāo)探針為上述分子信標(biāo)探針，且所述引物對(duì)包括第一引物和第二引物，所述第一引物和所述第二引物的長(zhǎng)度均為20-30bp；且所述第一引物包含5’-ggcagagcg-3’，所述第二引物包含5’-ggaggc-3’或5’-gaggt-3’。

再一方面，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)gc基因snps位點(diǎn)的試劑盒，包括上述分子信標(biāo)探針和引物對(duì)，還包括taqhs酶、dntps、pcr緩沖液。

最后，本發(fā)明提供一種gc基因snps位點(diǎn)的檢測(cè)方法，包括如下步驟：

提取dna樣本；

將所述dna樣本與上述試劑盒配成pcr反應(yīng)體系，進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

根據(jù)所述擴(kuò)增結(jié)果分析樣本中g(shù)c基因snps位點(diǎn)。

本發(fā)明提供的分子信標(biāo)探針，其核苷酸序列可覆蓋gc基因的rs7041和rs4588兩個(gè)snps位點(diǎn)，僅需要qpcr儀和一條熒光標(biāo)記的分子信標(biāo)探針，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)大量樣品的gc基因中兩個(gè)重要多態(tài)性位點(diǎn)的分析，加上qpcr儀運(yùn)行成本和操作技術(shù)要求相對(duì)較低，這就大大降低了檢測(cè)成本和分析難度。

同時(shí)，設(shè)計(jì)一組與該分子信標(biāo)探針配套的引物對(duì)，一條(第一引物)位于rs7041上游100bp范圍內(nèi)的特異性引物，另一條(第二引物)位于rs4588下游100bp范圍內(nèi)的特異性引物。rs7041上游100bp的適宜引物都有共同位置上9bp的片段5’-ggcagagcg-3’；rs4588下游100bp的適宜引物有兩群，一群具有6bp的共同位置片段5’-ggaggc-3’，另一群具有5bp的共同位置片段5’-gaggt-3’；這樣可實(shí)現(xiàn)對(duì)大量樣品的gc基因中兩個(gè)重要多態(tài)性位點(diǎn)的分析。

該用于檢測(cè)gc基因snps位點(diǎn)的試劑盒，因含有本發(fā)明特有的分子信標(biāo)探針和引物對(duì)，所以具有高效、靈敏、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，而且該試劑盒成本低、使用方便，僅需要qpcr儀可實(shí)現(xiàn)對(duì)大量樣品的gc基因中兩個(gè)重要多態(tài)性位點(diǎn)的分析。

該gc基因snps位點(diǎn)的檢測(cè)方法，因使用本發(fā)明特有的試劑盒，根據(jù)熒光信號(hào)在熔解曲線程序中出現(xiàn)的峰型判斷gc不同的基因型。因此具有檢測(cè)步驟簡(jiǎn)單、耗時(shí)少、成本低的特點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中同時(shí)檢測(cè)由rs7041和rs4588組成的6種基因型原始數(shù)據(jù)圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中同時(shí)檢測(cè)由rs7041和rs4588組成的6種基因型原始數(shù)據(jù)處理圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中rs7041和rs4588組成的6種基因型的pcr檢測(cè)產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中同時(shí)檢測(cè)由rs7041和rs4588組成的6種基因型的大量樣本原始數(shù)據(jù)圖；

其中，附圖標(biāo)記為：

1：gc-1s/1s；2：gc-1f/1f；3：gc-2/2；

4：gc-1s/1f；5：gc-1s/2；6：gc-1f/2。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種用于檢測(cè)gc基因snps位點(diǎn)的分子信標(biāo)探針，其用于同時(shí)檢測(cè)gc基因多態(tài)性位點(diǎn)rs7041和rs4588，包括依次連接的上游序列、核心序列和下游序列，其中，核心序列為：5’-[g/t]gccacaccca[a/c]-3’或5’-[g/t]tgggtgtggc[a/c]-3’，上游序列和下游序列均包括：至少三個(gè)與gc基因互補(bǔ)配對(duì)的堿基或至少兩個(gè)與gc基因互補(bǔ)配對(duì)的c或g堿基；同時(shí)，分子信標(biāo)探針的長(zhǎng)度為25-35bp，tm值為62-65℃，分子信標(biāo)探針的5’端和3’端分別用熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記。

該分子信標(biāo)探針的核苷酸序列覆蓋gc基因的rs7041和rs4588兩個(gè)snps位點(diǎn)，僅需要qpcr儀和一條熒光標(biāo)記的分子信標(biāo)探針，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)大量樣品的gc基因中兩個(gè)重要多態(tài)性位點(diǎn)的分析，加上qpcr儀運(yùn)行成本和操作技術(shù)要求相對(duì)較低，這就大大降低了檢測(cè)成本和分析難度。

具體地，該分子信標(biāo)探針的長(zhǎng)度為25-35bp。分子信標(biāo)探針是一種可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針，本發(fā)明實(shí)施例中，“環(huán)”一般長(zhǎng)15-30個(gè)核苷酸，是與目標(biāo)序列互補(bǔ)的探針主體，tm值比qpcr的退火溫度高7-10℃，如推薦ta＝55℃，探針的tm便在62-65℃；“莖”一般長(zhǎng)5-7對(duì)核苷酸，可部分或全部由人為加入的堿基形成，cg堿基含量占75-100％，以使“莖”的tm比qpcr的ta高7-10℃，熒光分子一端不宜緊接g堿基，避免后者的熒光淬滅作用。

該分子信標(biāo)探針核心序列包含一段兩個(gè)snps(rs7041和rs4588)之間的dna片段(10bp)，再通過(guò)人工設(shè)計(jì)上有序列和下游序列，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。具體地，在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，分子信標(biāo)探針的核苷酸序列為：

seqidno:1：cacagctgatgccacacccaaggaactgtg；或

seqidno:2：cgtgagctgatgccacacccaaggaactcacg；或

seqidno:3：ctggtctgatgccacacccaaggaaccga。

具體地，分子信標(biāo)探針的5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為fam、hex、tet、vic、rox、cy5、cy3、joe、alex和cal中的至少一種；分子信標(biāo)探針的3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為dabcyl、bhq、eclipse和tamra中的至少一種。

另一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一組用于檢測(cè)gc基因snps位點(diǎn)的分子信標(biāo)探針和引物對(duì)，該分子信標(biāo)探針為上述分子信標(biāo)探針，且該引物對(duì)包括第一引物和第二引物，第一引物和第二引物的長(zhǎng)度均為20-30bp；且第一引物包含5’-ggcagagcg-3’，第二引物包含5’-ggaggc-3’或5’-gaggt-3’。

具體地，在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，第一引物與分子信標(biāo)探針在同一鏈上，且第一引物的tm值為62-65℃，第二引物的tm值為58-60℃。一優(yōu)選實(shí)施例中，第一引物為：seqidno:4：ggtttttcagactggcagagcgacta；

第二引物為：seqidno:5：gaggtgagtttatggaacagca。

又一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供一種用于檢測(cè)gc基因snps位點(diǎn)的試劑盒，包括本發(fā)明實(shí)施例的分子信標(biāo)探針和引物對(duì)，還包括taqhs酶、dntps、pcr緩沖液。該用于檢測(cè)gc基因snps位點(diǎn)的試劑盒，因含有本發(fā)明特有的分子信標(biāo)探針和引物對(duì)，所以具有高效、靈敏、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，而且該試劑盒成本低、使用方便，僅需要qpcr儀可實(shí)現(xiàn)對(duì)大量樣品的gc基因中兩個(gè)重要多態(tài)性位點(diǎn)的分析。

最后，本發(fā)明實(shí)施例提供一種gc基因snps位點(diǎn)的檢測(cè)方法，包括如下步驟：

提取dna樣本；

將上述dna樣本與本發(fā)明實(shí)施例的試劑盒配成pcr反應(yīng)體系，進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果分析樣本中g(shù)c基因snps位點(diǎn)。

該gc基因snps位點(diǎn)的檢測(cè)方法，因使用本發(fā)明實(shí)施例特有的試劑盒，根據(jù)熒光信號(hào)在熔解曲線程序中出現(xiàn)的峰型判斷gc不同的基因型，因此檢測(cè)步驟簡(jiǎn)單、耗時(shí)少、成本低的特點(diǎn)。

具體地，上述pcr擴(kuò)增為降落pcr擴(kuò)增。

具體地，上述dna樣本為人全血dna樣本。

本發(fā)明先后進(jìn)行過(guò)多次試驗(yàn)，現(xiàn)舉一部分試驗(yàn)結(jié)果作為參考對(duì)發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)描述，下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。本說(shuō)明書(shū)中的英文縮寫(xiě)的全稱和中文內(nèi)容對(duì)應(yīng)如下：

1)25ohd：25羥維生素d，25-hydroxyvitamind

2)asp：天冬氨酸，asparticacid

3)dab：二甲氨基偶氮苯甲酰(一種熒光淬滅劑)，dabsyl

4)fam：羧基熒光素，carboxyfluorescein

5)gc：種群特異性成分/維生素d結(jié)合蛋白，group-specificcomponent/vitamindbindingprotein。斜體表示其基因。

6)glu：谷氨酸，glutamicacid

7)kasp：等位基因特異性競(jìng)爭(zhēng)pcr基因分型法，kbiosciencescompetitiveallele‐specificpcrgenotypingsystem

8)lys：賴氨酸，lysine

9)ncbi：美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心，nationalcenterforbiotechnologyinformation

10)pcr：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，polymerasechainreaction

11)qpcr：定量pcr，quantitativepolymerasechainreaction

12)rflp：限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性，restrictionfragmentlengthpolymorphism

13)snp(s)：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性位點(diǎn)，singlenucleotidepolymorphism(s)

14)thr：蘇氨酸，threonine

15)ta：退火溫度，annealingtemperature

16)tm：熔解溫度，meltingtemperature。

實(shí)施例1分子信標(biāo)探針及引物對(duì)設(shè)計(jì)

1)獲得目標(biāo)snps基本信息

從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(ncbi)網(wǎng)站的snp數(shù)據(jù)庫(kù)查詢gc基因的rs7041和rs4588這兩個(gè)snps位點(diǎn)信息，結(jié)果如下：

rs7041[homosapiens]：agcgactaaaagcaaaattgcctga[g/t]gccacacccacggaactggcaaagc

rs4588[homosapiens]：gcaaaattgcctgatgccacaccca[a/c/t]ggaactggcaaagctggttaacaag

然后在geneview鏈接的dbsnp數(shù)據(jù)庫(kù)中核查這兩個(gè)snps。rs7041確認(rèn)為[g/t]二態(tài)性，rs4588確認(rèn)為[a/c]二態(tài)性，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。rs4588的t堿基可能極其罕見(jiàn)，根據(jù)后續(xù)設(shè)計(jì)的探針，t將被合并計(jì)入a或c的情況。然后再在ncbi的gene數(shù)據(jù)庫(kù)查詢?nèi)祟恎c基因信息(geneid：2638)，并鏈接至dna序列(refseqgene：ng_012837.2)。通過(guò)序列比對(duì)，將以上兩個(gè)snps定位到dna，確定一段這兩個(gè)snps居中的dna片段(如下所示)，用于后續(xù)的引物和探針設(shè)計(jì)，兩個(gè)snps間隔10bp，使一條探針覆蓋這兩個(gè)snps成為可能。

2)探針與引物設(shè)計(jì)

分子信標(biāo)探針和引物的設(shè)計(jì)總結(jié)為以下法則：

①“環(huán)”一般長(zhǎng)15-30個(gè)核苷酸，是與目標(biāo)序列互補(bǔ)的探針主體，tm值比qpcr的退火溫度(ta)高7-10℃，如推薦ta＝55℃，探針的tm便在62-65℃；

②探針的兩端到臨近snp的核苷酸序列中應(yīng)至少有3個(gè)堿基能與目的dna片段完全互補(bǔ)(即snp不應(yīng)在靠近探針兩端的3個(gè)堿基范圍內(nèi))，或至少2個(gè)c或g堿基與目的dna序列互補(bǔ)，以保證待測(cè)位點(diǎn)與探針不互補(bǔ)時(shí)，探針兩端有一定的結(jié)合能力；

③“莖”一般長(zhǎng)5-7對(duì)核苷酸，可部分或全部由人為加入的堿基形成，cg堿基含量占75-100％，以使“莖”的tm比qpcr的ta高7-10℃，熒光分子一端不宜緊接g堿基，避免后者的熒光淬滅作用；

④5’末端標(biāo)記熒光分子，3’末端標(biāo)記淬滅分子；

⑤整個(gè)分子信標(biāo)探針全長(zhǎng)一般25-35個(gè)核苷酸，不能與引物形成可以引發(fā)擴(kuò)增的穩(wěn)定二聚體，且探針和引物與目的dna的互補(bǔ)結(jié)合區(qū)域沒(méi)有重疊部分；

⑥引物擴(kuò)增目的dna片段的產(chǎn)物長(zhǎng)度宜在200bp以內(nèi)，最好短于150bp；

⑦對(duì)應(yīng)于同一條dna單鏈上的引物和探針具有相近的tm值，且高于另一條引物tm值的5-8℃；

⑧引物符合上述要求外，再符合其余的引物設(shè)計(jì)常規(guī)法則。

其中，⑤⑥⑦三條法則連同后文qpcr反應(yīng)體系(見(jiàn)后文表5)中提高探針及其互補(bǔ)鏈引物濃度(即：提高探針互補(bǔ)鏈產(chǎn)量的非對(duì)稱pcr)的策略，都有助于增強(qiáng)探針與目標(biāo)鏈結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。根據(jù)這些條件，以gc蛋白質(zhì)編碼的正義dna鏈為模板，同時(shí)覆蓋rs7041和rs4588兩個(gè)snps的候選探針信息可能的探針序列如表1。類似地，也可根據(jù)正義鏈的互補(bǔ)dna鏈為模板設(shè)計(jì)探針。

表1

¹pta1-5、ptc1-2和pgc1分別對(duì)應(yīng)的單倍體型為t-a、t-c和g-c。

²下劃線堿基為snps，方框內(nèi)堿基為發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

³以tmutilityv1.3軟件計(jì)算的tm值，條件為：探針0.2μm、目的dna0.2μm、mg²⁺2.0mm、總dntp0.8mm。

⁴以primerexpress3.0、dnafoldingform等軟件的分析發(fā)現(xiàn)。

遵循上述原則，以primerpremier5軟件在第一個(gè)snp上游100bp范圍內(nèi)設(shè)計(jì)上游引物，在第二個(gè)snp下游100bp范圍內(nèi)設(shè)計(jì)下游引物，引物長(zhǎng)度預(yù)設(shè)(25±5)bp，產(chǎn)物長(zhǎng)度預(yù)設(shè)80-150bp，搜索嚴(yán)格程度從“非常高(veryhigh)”開(kāi)始，其余參數(shù)為默認(rèn)值，沒(méi)有符合條件的引物對(duì)；然后搜索嚴(yán)格程度設(shè)為“高(high)”，出現(xiàn)10對(duì)引物。表2列出了ta值最接近55℃的一對(duì)引物及產(chǎn)物評(píng)分高過(guò)此對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物評(píng)分的全部引物對(duì)。

表2

¹以rs7041上游100bp的堿基為1開(kāi)始計(jì)算位置，后同。

²以tmutilityv1.3軟件計(jì)算的tm值，條件為：引物0.2μm、目的dna0.2μm、mg²⁺2.0mm、總dntp0.8mm。

以在線軟件ncbiprimer-blast和primer3在rs7041上游100bp范圍內(nèi)搜索上游引物、在rs4588下游100bp范圍內(nèi)搜索下游引物，參數(shù)設(shè)置均為默認(rèn)，對(duì)更多引物的位置做擴(kuò)展檢索。表3列出了候選引物群的代表性序列。

表3

¹粗體下劃線字母代表同一引物群在共有位置上的片段。上游引物群i的共同片段也存在于表2；下游引物群ii與表2中的下游引物也具有共同片段。

²共同位置片段位于中部的其余引物未再列出。

可見(jiàn)，rs7041上游100bp的適宜引物都具有一段長(zhǎng)9bp的共同位置5’-ggcagagcg-3’；rs4588下游100bp的適宜引物有兩群，一群具有6bp的共同位置5’-ggaggc-3’，另一群具有8bp的共同位置5’-gaggaggt-3’。

3)最佳探針與引物的理論篩選

以primerexpress3.0的引物探針測(cè)試工具(primerprobetesttool)對(duì)上述引物對(duì)和探針進(jìn)行分析，從自身發(fā)夾(hairpin)、自身二聚體(selfdimers)和交叉二聚體(crossdimers)的形成情況濾除欠佳的組合，保留f1-r3和f3-r4兩對(duì)引物(表2中的粗體字)。在qpcr的ta為55℃及體系組分構(gòu)成的條件下，探針同鏈的(上游)引物tm宜在62-65℃之間，探針互補(bǔ)鏈的(下游)引物tm宜在58-60℃之間，并且不能與探針形成可以擴(kuò)增的二聚體，因此，初步考慮f3與r3組成引物對(duì)，并進(jìn)一步手動(dòng)調(diào)整和評(píng)估。滿足條件的上游引物命名為gc-f(seqidno:4：ggtttttcagactggcagagcgacta)、下游引物記為gc-r(seqidno:5：gaggtgagtttatggaacagca)，見(jiàn)表4。由于一條熒光探針的價(jià)格大約在900-1200元，因此，更需對(duì)其事先做好理論分析，挑選最優(yōu)的一條合成。

對(duì)表1中pta1、pta2和ptc1三條待進(jìn)一步評(píng)估的探針，在其末端加入可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的適當(dāng)堿基，利用在線分析工具dnafoldingform(http://unafold.rna.albany.edu/)進(jìn)行“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)的質(zhì)量評(píng)估。在特定熔解曲線分析條件下，分子構(gòu)象合理而穩(wěn)定(自由能差值dg<0)的分子信標(biāo)探針，其預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要滿足以下條件：①有正確的“莖”結(jié)構(gòu)，保證熒光分子和淬滅分子空間靠近；②不宜出現(xiàn)7對(duì)以上堿基互補(bǔ)的“莖”結(jié)構(gòu)。如不滿足上述條件，需調(diào)整探針位置或/和構(gòu)成“莖”的堿基。

本發(fā)明擬用熔解曲線分析的ta為40℃、na⁺50mm、mg²⁺2mm，該條件下，以pta1、pta2或ptc1為“環(huán)”主體的分子信標(biāo)探針的合理而穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)如下(小寫(xiě)字母為人為加入的堿基)：

三種分子信標(biāo)探針對(duì)應(yīng)的核苷酸序列如下：

seqidno:1：cacagctgatgccacacccaaggaactgtg；

seqidno:2：cgtgagctgatgccacacccaaggaactcacg；

seqidno:3：ctggtctgatgccacacccaaggaaccga。

可見(jiàn)，pta1(seqidno:1)、pta2(seqidno:2)和ptc1(seqidno:3)三者均可能構(gòu)成有效的分子信標(biāo)探針。本發(fā)明隨機(jī)選了pta1送公司合成，并在5’端連接fam熒光分子，3’端連接dab熒光淬滅分子，命名為gc-p，見(jiàn)表4。

表4

¹粗體下劃線是與表2、表3中上游或下游引物具有相同位置的片段，中括號(hào)內(nèi)堿基為snps，小寫(xiě)字母為手動(dòng)加入、構(gòu)成“莖”結(jié)構(gòu)的堿基。

²以tmutilityv1.3軟件計(jì)算的tm值，條件為：oligo0.2μm、目的dna0.2μm、mg²⁺2.0mm、總dntp0.8mm。gc-p的tm計(jì)算不含兩端手動(dòng)加入的堿基(小寫(xiě)字母)。

³探針5’端連接fam熒光分子，3’端連接dab熒光淬滅分子；該探針與上游引物對(duì)應(yīng)于同一條dna鏈?；パa(bǔ)序列為23bp，全長(zhǎng)30bp。

經(jīng)過(guò)上述篩選得到的引物和探針對(duì)應(yīng)于qpcr擴(kuò)增片段(123bp)的位置如下：qpcr擴(kuò)增產(chǎn)物全長(zhǎng)123bp?；疑磕ǖ膲A基為上游引物序列和下游引物反向互補(bǔ)序列，方框內(nèi)的堿基為探針部分序列，中括號(hào)內(nèi)的堿基為多態(tài)性位點(diǎn)。

此外，表1-表3中的全部引物(或其互補(bǔ)序列)和探針(或其互補(bǔ)序列)也可通過(guò)適當(dāng)組合、評(píng)估，人工增減堿基，以達(dá)到本發(fā)明的目的，這里不再一一分析、驗(yàn)證，具體地，凡是具有表4中相同性能的引物和探針都在本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。

實(shí)施例2gc基因snps位點(diǎn)檢測(cè)

1)dna樣本制備：根據(jù)全血dna提取試劑盒(北京天根生物技術(shù)有限公司的全血dna提取試劑盒，貨號(hào)dp318-03)的操作說(shuō)明提取待檢測(cè)的dna樣品，用微量分光光度計(jì)(ge公司的nanovueplus)檢測(cè)樣本在280nm和260nm波長(zhǎng)下的比值，由此吸光度值計(jì)算的dna濃度。

2)qpcr實(shí)驗(yàn)測(cè)試引物和探針：按表5中的qpcr成分配制反應(yīng)試劑，并按表6的qpcr反應(yīng)程序進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。三個(gè)優(yōu)選條件：①熱啟動(dòng)dna聚合酶，確保引物、探針?lè)謩e與互補(bǔ)鏈雜交的特異性；②非對(duì)稱產(chǎn)物擴(kuò)增，提高一側(cè)引物濃度以提高分子信標(biāo)探針互補(bǔ)鏈的產(chǎn)量。③降落pcr(touch-down)程序提高擴(kuò)增的特異性。本實(shí)驗(yàn)的qpcr儀為roche480ii，同時(shí)檢測(cè)rs7041和rs4588組成的6種基因型，熒光信號(hào)檢測(cè)波長(zhǎng)為465-510nm，圖1為roche480iiqpcr軟件生成的熔解曲線峰原始圖：圖中包含6種基因型的熒光曲線：1：gc-1s/1s；2：gc-1f/1f；3：gc-2/2；4：gc-1s/1f；5：gc-1s/2；6：gc-1f/2；橫坐標(biāo)為溫度，縱坐標(biāo)為檢測(cè)到的熒光信號(hào)相對(duì)值。圖2為原始數(shù)據(jù)處理的結(jié)果圖。從圖1和圖2可知，本實(shí)施例的gc基因snps位點(diǎn)檢測(cè)方法，只需要根據(jù)熒光信號(hào)在熔解曲線程序中出現(xiàn)的峰型，即可判斷gc的基因型是哪一種(見(jiàn)表7，基因型判斷表：rs7041和rs4588的3種單倍體基因型及其組合的6種二倍體基因型)。因此，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程步驟簡(jiǎn)單、耗時(shí)少、成本低，在臨床與預(yù)防醫(yī)學(xué)的分子流行病學(xué)相關(guān)工作中非常實(shí)用。

表5

¹taq熱啟動(dòng)酶(takarataqtmhotstartversion)試劑盒，貨號(hào)r007a，takara(大連)公司，含：takarataqhs酶、10×pcrbuffer(mg²⁺plus)和dntpmixture(各2.5mm)。

²分子信標(biāo)探針與上游引物對(duì)應(yīng)于同一條dna鏈上，分子信標(biāo)探針濃度和下游引物的用量高于上游引物，確保在與下游引物pcr產(chǎn)物互補(bǔ)結(jié)合過(guò)程中，探針比上游引物pcr產(chǎn)物更具競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。

表6

¹表中各中文名詞對(duì)應(yīng)于roche480iiqpcr操作軟件的英文依次如下：程序名稱(programname)；分析模式(analysismode)；循環(huán)數(shù)(cycles)；目標(biāo)溫度(target)；時(shí)間(hold)；斜率(ramprate)；第二目標(biāo)溫度(sectarget)；步長(zhǎng)(stepsize)；信號(hào)采集次數(shù)(acquisitions)；采集模式(acquisitionmode)；預(yù)變性(pre-incubation)；無(wú)(none)；降落pcr(touch-down)；擴(kuò)增(amplification)；定量(quantification)；單次(single)；熔解曲線(meltingcurve)；連續(xù)(continuous)；冷卻(cooling)。

²儀器設(shè)置：檢測(cè)模式(detectionformat)為多色探針(multicolorhydro-probe)；定制(customize)：熒光(fluos,465-510)；模塊規(guī)格(blocksize)：96孔；反應(yīng)體積(reactionvolume)：25μl。

³表格中的“—”表示無(wú)需設(shè)置。

⁴連續(xù)監(jiān)測(cè)40-80℃升溫區(qū)間的熒光信號(hào)，分子信標(biāo)探針從發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi)，并結(jié)合到互補(bǔ)dna鏈上，熒光信號(hào)達(dá)到最大值。隨著溫度升高，有錯(cuò)配的探針-dna雜交鏈會(huì)在較低溫度下解鏈，形成熔解曲線峰值；而匹配程度高的探針-dna雜交鏈會(huì)在較高溫度下解鏈。

表7

3)將pcr產(chǎn)物送往商業(yè)服務(wù)公司進(jìn)行測(cè)序，以驗(yàn)證分子信標(biāo)qpcr的分型結(jié)果。測(cè)序結(jié)果如圖3所示，6種基因型的樣品各3個(gè)測(cè)序的結(jié)果與本發(fā)明技術(shù)分析的結(jié)果一致，圖3將6種基因型的結(jié)果各列舉了一例。

4)大量樣本檢測(cè)：按照上述預(yù)實(shí)驗(yàn)成功的實(shí)驗(yàn)條件，進(jìn)行大量樣本的基因分型檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。

在研究gc基因與人群多種慢性病的關(guān)系時(shí)，分析rs7041和rs4588兩個(gè)snps構(gòu)成的gc-1f、gc-1s和gc-2基因型是一項(xiàng)重要內(nèi)容。利用我們發(fā)明的這種方法，我們?cè)鴱哪呈腥巳毫餍胁W(xué)研究中納入分析了1906名18-83歲成年女性gc-1f、gc-1s和gc-2基因型的頻率差異。rs7041和rs4588兩個(gè)snps基因型分布的hardy-weinberg平衡檢驗(yàn)證實(shí)樣本具有良好代表性。表8顯示了不同血漿25ohd濃度下gc的6種基因型頻率：gc-2/2和1f/2的基因型頻率隨著血漿25ohd濃度的升高而下降(p<0.05)；gc-1s/1s和1s/1f的基因型頻率卻隨著血漿25ohd濃度升高而升高(p<0.05)。表9顯示了不同年齡段、不同血漿25ohd濃度下gc的3種等位基因型頻率：gc-2等位基因型的頻率隨著血漿25ohd濃度的升高而下降(p<0.05)；gc-1s等位基因型的頻率卻隨著血漿25ohd濃度升高而升高(p<0.05)。這就提示，gc-2等位基因型是維生素d缺乏的危險(xiǎn)因素，而gc-1s等位基因型是保護(hù)因素。已知gc-2與較低的血循環(huán)gc蛋白濃度相關(guān)，且與維生素d及其代謝產(chǎn)物的結(jié)合能力低于gc-1f和1s。因而，gc-2通常導(dǎo)致血循環(huán)較低的25ohd濃度。本發(fā)明方法檢測(cè)到的這組人群的結(jié)果與此前研究一致，也說(shuō)明該方法在應(yīng)用上有效。

表8

¹以血漿25ohd(nmol/l)為判斷標(biāo)準(zhǔn)，缺乏：-<50；不足：50-<75；充足：≥75。

表9

¹以血漿25ohd(nmol/l)為判斷標(biāo)準(zhǔn)，缺乏：-<50；不足：50-<75；充足：≥75。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>深圳市慢性病防治中心

<120>分子信標(biāo)探針及引物對(duì)、gc基因snps位點(diǎn)檢測(cè)方法

<160>5

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>30

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

cacagctgatgccacacccaaggaactgtg30

<210>2

<211>32

<212>dna

<213>人工合成

<400>2

cgtgagctgatgccacacccaaggaactcacg32

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<211>29

<212>dna

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ctggtctgatgccacacccaaggaaccga29

<210>4

<211>26

<212>dna

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ggtttttcagactggcagagcgacta26

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<212>dna

<213>人工合成

<400>5

gaggtgagtttatggaacagca22