本申請是申請日為2013年1月29日的、發(fā)明名稱為“從經(jīng)基因改造的微生物生產(chǎn)黏康酸”的中國專利申請201380017560.1(pct/us2013/023690)的分案申請。

相關申請的交叉引用

本申請要求于2012年1月30日提交的美國臨時申請系列號61/632,777的優(yōu)先權益。

發(fā)明領域

本發(fā)明處于使用生物催化劑生產(chǎn)可再生化學原料的領域，該生物催化劑已經(jīng)經(jīng)基因改造增加了其將可再生碳源轉(zhuǎn)化成有用化合物的能力。更具體而言，本發(fā)明提供利用基因改造的生物催化劑從可再生碳源生產(chǎn)黏康酸異構體的方法。

發(fā)明背景

己二酸是在尼龍66的制造中使用的大量化學品。己二酸目前是由石化產(chǎn)品制備，但合成并不是環(huán)境友好的(niu等人，2002)。備選地，己二酸可以由黏康酸的三種異構體(順，順；順，反；反，反)中的任一者經(jīng)化學氫化作用制得。通過用微生物進行發(fā)酵從可再生資源生產(chǎn)黏康酸、接著氫化成己二酸將會是令人合意的，因為這樣的至己二酸的途徑將比傳統(tǒng)的石化途徑更加環(huán)境友好。

目前針對微生物生產(chǎn)黏康酸的努力可以分組到三個類別，即：(1)用于黏康酸生產(chǎn)的芳族降解通路，其中供給多種芳族化合物，且芳族化合物的苯環(huán)部分氧化切割而打開；(2)黏康酸鹽積累(buildup)通路，其中黏康酸骨架從多種c2、c3、c4化合物或賴氨酸形成；和(3)芳族氨基酸生物合成黏康酸通路，其中黏康酸從3-脫氫莽草酸鹽(3-dehydroshikimate)形成，所述3-脫氫莽草酸鹽是許多生物體中芳族氨基酸生物合成通路中的中間體。

許多微生物能夠利用這樣的通路來降解含有苯環(huán)的芳族化合物例如苯酚、兒茶酚和苯甲酸，該通路切割芳環(huán)得到非芳族化合物的終末化合物或中間體化合物，例如順，順-黏康酸、或3-羧基-順，順-黏康酸(niu等人，2002；perez-pantoja等人，2008)。過去，許多小組已經(jīng)嘗試開發(fā)微生物以工業(yè)水平生產(chǎn)順，順-黏康酸的能力(mizuno等人，1988；yoshikawa等人，1990；choi等人，1997)。在1980年代末，美國的celgenecorporation和日本的mitsubishichemicalindustries分別積極研發(fā)從甲苯和苯甲酸制造黏康酸的方法，這由該領域中多項已授權的美國專利和日本專利所證實。

多種微生物已經(jīng)被報道為利用甲苯、苯甲酸、苯或兒茶酚生產(chǎn)順，順-黏康酸。例如，以兒茶酚作為碳源，利用表達cata基因的重組大腸桿菌(e.coli)細胞可以以近乎100％的摩爾轉(zhuǎn)化產(chǎn)率實現(xiàn)順，順-黏康酸生產(chǎn)，所述cata基因編碼作為生物催化劑負責催化兒茶酚的鄰位切割的惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)mt-2兒茶酚1,2-雙加氧酶(kaneko等人，2011)。利用該體系用于連續(xù)生產(chǎn)黏康酸的生物反應器已有過記載。

利用環(huán)狀c6碳化合物進行順，順-黏康酸的微生物生產(chǎn)的此方法從未在商業(yè)上實現(xiàn)；然而，在理解用于微生物中的黏康酸生產(chǎn)的降解通路中的酶的功能作用方面有著持續(xù)的學術興趣。

近來公開的國際專利申請(wo2011/017560)要求保護具有黏康酸鹽通路的生物催化劑和利用這些生物催化劑來生產(chǎn)黏康酸的方法。簡而言之，這件公開的專利申請公布了四種不同的生產(chǎn)黏康酸的通路。第一種用于黏康酸生產(chǎn)的通路以琥珀酰-coa和乙酰-coa起始。第二種用于黏康酸生產(chǎn)的通路以丙酮酸和丙二酸半醛起始。第三種用于黏康酸生產(chǎn)的通路以丙酮酸和琥珀酸半醛起始。第四種用于黏康酸生產(chǎn)的通路以賴氨酸起始。在此專利申請中提出的所有這些用于黏康酸生產(chǎn)的通路都是基于計算機建模，而這些生物催化劑究竟能否產(chǎn)生為具備商業(yè)上可接受的黏康酸生產(chǎn)力和產(chǎn)率還有待觀察。

利用基因改造的大腸桿菌體系的得到順，順-黏康酸的發(fā)酵途徑已經(jīng)記載于科學文獻(niu等人，2002)和專利文獻(us5,616,496；us5,487,987；wo2011/085311a1)中，但現(xiàn)有技術方法在用于大規(guī)模商業(yè)生產(chǎn)從而有經(jīng)濟吸引力的滴度、產(chǎn)率和適用性方面需要實質(zhì)改進。已有兩例經(jīng)基因改造以從葡萄糖生產(chǎn)順，順-黏康酸的釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)酵母菌的報道，但公開的滴度僅為1.5mg/l和140mg/l(weber等人，2012；curran等人，2012)。在這些滴度下，這些酵母方法對于商業(yè)生產(chǎn)無一有吸引力。本發(fā)明描述了通過在用于大規(guī)模商業(yè)生產(chǎn)的適用性方面與領域內(nèi)已知的公開方法相比有實質(zhì)改進的發(fā)酵來生產(chǎn)順，順-黏康酸或順，反-黏康酸的方法。

本文公開的本發(fā)明的目的之一是利用適用于大規(guī)模商業(yè)生產(chǎn)的基因改造的生物體，通過微生物發(fā)酵來生產(chǎn)順，順-黏康酸，該發(fā)酵起始于可再生的非芳族碳源例如糖或其它可源自光合作用植物的簡單的碳化合物。

在2002年，niu等人公開了這樣的生產(chǎn)己二酸的“無苯”途徑，其利用發(fā)酵方法生產(chǎn)順，順-黏康酸，然后是催化化學方法將順，順-黏康酸轉(zhuǎn)化成己二酸。該方法獲得專利權，但據(jù)本發(fā)明人所知，該方法尚未商業(yè)化(us5,487,987；us5,616,496)。此公開方法的發(fā)酵部分利用基因改造的大腸桿菌菌株，其最佳者命名為wn1/pwn2.248。該通路利用天然的芳族氨基酸生物合成通路(也稱為“莽草酸通路”、“莽草酸鹽通路”、“分支酸酯通路”、“共同芳族通路”、“中心芳族通路”，或簡單地為“芳族通路”，部分示于圖1中)的一部分。在此說明書中，在供給至生物體的碳源(如葡萄糖)下游的、和直接或間接通向分支酸的任何生化步驟被視為莽草酸通路的一部分，包括，例如由glf、glk、zwf、tkta、talb和pps催化的步驟。此外，該公開的方法利用三種異源的酶，所述異源的酶經(jīng)由中間體原兒茶酸和兒茶酚將3-脫氫莽草酸鹽(芳族通路中的中間體)轉(zhuǎn)化成順，順-黏康酸。改造的宿主菌株是大腸桿菌k-12的衍生物，其具有aroe353，sera::(arob,aroz)，lacz::(tkta,aroz)基因型，其中arob編碼3-脫氫奎尼酸合酶(以下稱為arob)，tkta編碼轉(zhuǎn)酮醇酶，且aroz是來自肺炎克雷伯桿菌(klebsiellapneumoniae)的編碼3-脫氫莽草酸脫水酶(以下稱為“aroz”)的異源的基因。該改造的菌株含有多拷貝質(zhì)粒pwn2.248，其衍生自pbr322且含有用于表達cata、catx、aroy、arof(反饋抗性的)、sera、laci^q和氨芐青霉素抗性的基因盒。異源的基因cata和catx來自乙酸鈣不動桿菌(acinetobactercalcoaceticus)且編碼兒茶酚1,2-雙加氧酶(以下稱為“cata”)和功能未知的可能增強cata活性的蛋白(“catx”)。在文獻中，catx基因也稱為“orf1”(neidle和ornston，1986)。在本專利說明書中，我們要將來自不動桿菌屬(acinetobacter)的cata加catx基因?qū)ΨQ為“catax.”。異源基因aroy來自肺炎克雷伯桿菌且編碼原兒茶酸脫羧酶(以下稱為“aroy”)。

與上述授權專利相關的較新的專利申請已經(jīng)公開(wo2011/085311a1)。在此申請中，利用同樣的上述菌株wn1/pwn2.248來生產(chǎn)順，順-黏康酸，其隨后被異構化成順，反-黏康酸。

然而，菌株wn1/pwn2.248并不能良好地適用于大規(guī)模商業(yè)生產(chǎn)，因此對于更加改進的方法有需求。本發(fā)明提供用于順，順-黏康酸的發(fā)酵生產(chǎn)的改進的生物催化劑。

wo2011/085311a1中記載的方法具有數(shù)個其它特征，這些特征使得不能實現(xiàn)商業(yè)大規(guī)模實施。順，順-黏康酸的發(fā)酵生產(chǎn)中使用的生物催化劑wn1/pwn2.248中所包含的aroe353突變的發(fā)揮作用以阻斷碳流入莽草酸鹽通路的較下部分，從而使進入得到順，順-黏康酸的期望通路的碳流最大化。但aroe突變是“無效”突變(使基因?qū)τ谒袑嶋H目的都失活的突變)，其具有將菌株變成芳族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)和芳族維生素或莽草酸鹽通路產(chǎn)生的維生素樣中間體(對羥基苯甲酸、對氨基苯甲酸和2,3-二羥基苯甲酸)的營養(yǎng)缺陷型的作用。芳族氨基酸相對昂貴，并且其需求將會對生產(chǎn)順，順-黏康酸的成本增加大量負擔。因此，對于不需要向生產(chǎn)介質(zhì)中添加這些昂貴的營養(yǎng)素的方法也存在需求。

與目前可得的用于生產(chǎn)順，順-黏康酸的生物催化劑相關的再一問題涉及到維持多拷貝質(zhì)粒以表達一些必需基因的需求(niu等人，2002)。多拷貝質(zhì)粒經(jīng)常太不穩(wěn)定而不能用于大規(guī)模工業(yè)方法。而且，質(zhì)粒上基因中的至少一個從啟動子ptac表達，其需要異丙基硫代半乳糖苷(iptg)或乳糖來誘導，而這兩種化學品對于允許在經(jīng)濟上有吸引力的方法而言太過昂貴。因此，對于具有穩(wěn)定整合到生產(chǎn)菌的染色體中的表達盒的更穩(wěn)定菌株存在需求，并且對于從組成型啟動子高水平表達從而減輕對用于啟動子的化學誘導物的需求也存在需求。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供從非芳族碳源開始生產(chǎn)順，順-黏康酸的基因改造的微生物。該基因改造微生物不需要包含任何外源質(zhì)粒以生產(chǎn)黏康酸，盡管它們具有某些實現(xiàn)期望的表型所必需的外源或異源基因。引入到微生物中的外源基因穩(wěn)定地整合到染色體dna中。作為外源基因的此染色體dna整合的結果，使用抗生素或其它選擇性方法以維持攜帶外源dna的質(zhì)粒的需求全部消除。此外，使用不需要化學誘導物的強啟動子來表達從碳源如葡萄糖至順，順-黏康酸的通路所必需的基因。

在本發(fā)明的一個實施方案中，芳族氨基酸生物合成的負調(diào)節(jié)物的活性受基因操縱。在本發(fā)明的一個方面，負調(diào)節(jié)物tyrr的活性通過控制編碼tyrr蛋白的tyrr基因的表達而實質(zhì)降低。在本發(fā)明的另一方面，負調(diào)節(jié)物tyrr的活性通過將來自微生物的染色體dna的tyrr基因缺失或失活而完全消除。

在本發(fā)明的另一實施方案中，因某些代謝物引起的芳族氨基酸通路中某些酶的反饋抑制通過基因操縱而克服。在大多數(shù)野生型大腸桿菌菌株中，脫氧阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸(dahp)合酶作為已知由三種不同基因即arog、arof和aroh編碼的三種不同的異構酶出現(xiàn)。由該三種基因中的每種編碼的蛋白受到負責芳族氨基酸生物合成的莽草酸通路的一種或多種代謝物的反饋抑制。在本發(fā)明的一個方面，野生型arog基因被修飾的arog基因取代，所述修飾的arog基因編碼抵抗微生物細胞中芳族氨基酸通路的一種或多種代謝物的反饋抑制的arog蛋白。在本發(fā)明的另一方面，野生型arof基因被這樣的arof基因取代，所述arof基因編碼抵抗微生物細胞中芳族氨基酸通路的一種或多種代謝物的反饋抑制的arof蛋白。在本發(fā)明的另一方面，野生型aroh基因被這樣的aroh基因取代，所述aroh基因編碼抵抗微生物細胞中芳族氨基酸通路的一種或多種代謝物的反饋抑制的aroh蛋白。在本發(fā)明的另一實施方案中，選擇用于順，順-黏康酸的商業(yè)生產(chǎn)的生物催化劑可以具有多于一種的抵抗脫氧阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸(dahp)合酶的反饋的異構酶。

在本發(fā)明的另一實施方案中，通過在微生物細胞中的芳族氨基酸通路參與到碳流中的一種或多種酶的活性被增強。在本發(fā)明的一個方面，參與到芳族氨基酸通路和/或黏康酸通路的運轉(zhuǎn)中的一種或多種酶的活性的增強通過基因操縱而實現(xiàn)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，一種或多種編碼酶或蛋白arof、arog、aroh、arob、tkta、talb、aroz、qutc、qa-4、asbf、quic、aroy、rpe、rpi、pps、cata和catx或其同源物或類似物的基因的表達被增強，導致增強的所述酶的活性。rpe是核酮糖-5-磷酸差向異構酶，rpi是核酮糖-5-磷酸異構酶，且pps是磷酸烯醇丙酮酸合成酶(neidhardt和curtiss，1996)。如果宿主菌株是酵母(如釀酒酵母)，或絲狀真菌(如粗糙脈孢菌(neurosporacrassa))，數(shù)種催化莽草酸鹽通路中的反應的酶可以組合成一個大蛋白或多肽，稱為aro1p，在釀酒酵母情形中由aro1基因編碼。aro1p組合了arob、arod、aroe、arok(或arol)和aroa的功能。這樣，出于本發(fā)明的目的，aro1p和aro1或其部分可以作為arob、arod、aroe、arok和/或aroa的替代物使用、或者在arob、arod、aroe、arok和/或aroa之外使用。

在本發(fā)明的另一實施方案中，細菌細胞中經(jīng)由赤蘚糖-4-磷酸的通量通過過表達戊糖磷酸通路的運轉(zhuǎn)中的酶而增強。在本發(fā)明的一個方面，由talb或tala基因編碼的轉(zhuǎn)醛醇酶的超量產(chǎn)生被工程化。在本發(fā)明的另一方面，編碼轉(zhuǎn)醛醇酶和轉(zhuǎn)酮醇酶的基因的表達均通過基因操縱而增強。在本發(fā)明的另一方面，編碼核酮糖-5-磷酸差向異構酶和核酮糖-5-磷酸異構酶之一或二者的基因的表達通過基因操縱而增強。

在本發(fā)明的另一實施方案中，可用于芳族氨基酸通路的運作的pep(磷酸烯醇丙酮酸)通過基因操縱而增加。在本發(fā)明的一個方面，對pep池的競爭通過以用于葡萄糖攝取的pep獨立性體系消除和/或補償用于葡萄糖攝取的pep依賴性磷酸轉(zhuǎn)移酶體系(pts)而降低。在本發(fā)明的另一實施方案中，pep的可得性通過增加編碼pep合成酶的基因如pps的表達而增加。

附圖簡介

圖1.大腸桿菌中用于芳族氨基酸生物合成的通路。

圖2.大腸桿菌中用于黏康酸生產(chǎn)的通路。

圖3.顯示用于全部黏康酸和生化中間體的hplc分析的標準物的色譜。

圖4.顯示用于黏康酸異構體的hplc分析的標準物的色譜。

圖5.在用質(zhì)粒pcp32amp、pcp14和pcp54轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株myr34中生產(chǎn)dhs的滴度。大腸桿菌的myr34菌株具有aroe基因缺失。質(zhì)粒pcp32amp表達編碼dahp合酶的arog基因。質(zhì)粒pcp14表達編碼dhq合酶的arob基因。質(zhì)粒pcp54表達arob和arog基因二者。

圖6.在用質(zhì)粒pcp32amp和pcp54轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株myr34和myr170中生產(chǎn)dhs的滴度。大腸桿菌的myr34菌株具有aroe基因缺失。myr170菌株具有aroe基因缺失和在宿主染色體dna的ack基因座處整合的處于p15啟動子控制下的arob基因的第二拷貝。質(zhì)粒pcp32amp表達編碼dahp合酶的arog基因。質(zhì)粒pcp54表達arob和arog基因二者。

圖7.在僅用質(zhì)粒pmg37或用pmg37和pcp32amp質(zhì)粒二者轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株myr34和myr170中生產(chǎn)順，順-黏康酸的滴度。大腸桿菌myr34菌株具有aroe基因缺失。myr170菌株具有aroe基因缺失和在宿主染色體dna的ack基因座處整合的處于p15啟動子控制下的arob基因的第二拷貝。質(zhì)粒pcp32amp表達編碼dahp合酶的arog基因。質(zhì)粒pmg37表達編碼在黏康酸通路中起作用的蛋白的aroz、aroy和catax基因。

圖8.在僅用表達arog基因的質(zhì)粒(pcp32amp)或同時表達arog和tkta基因的質(zhì)粒(pcp50)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌myr170菌株中生產(chǎn)dhs的滴度。myr170菌株具有aroe基因缺失和在宿主染色體dna的ack基因座處整合的處于p15啟動子控制下的arob基因的第二拷貝。

圖9.來自用質(zhì)粒pcp32amp和pcp50轉(zhuǎn)化的大腸桿菌myr34和myr170菌株的dhs產(chǎn)率。dhs產(chǎn)率計算為每克消耗的葡萄糖所產(chǎn)生的dhs克數(shù)。質(zhì)粒pcp32amp表達arog基因，而pcp50表達arog和tkta。細菌菌株myr34具有aroe基因缺失。大腸桿菌myr170菌株衍生自myr34且具有在染色體dna上的ack基因座處整合的額外的arob基因。

圖10.來自用質(zhì)粒pcp32amp和pcp50轉(zhuǎn)化的大腸桿菌myr170和myr261菌株的dhs滴度。質(zhì)粒pcp32amp表達arog基因，而pcp50表達arob和tkta基因。myr170菌株具有aroe基因缺失和在宿主染色體dna的ack基因座處整合的處于p15啟動子控制下的arob基因的第二拷貝。大腸桿菌myr261菌株衍生自大腸桿菌myr170菌株。大腸桿菌myr261菌株具有在染色體dna的poxb基因座處整合的tkta基因的第二拷貝及其天然啟動子。

圖11.大腸桿菌菌株myr170、myr261和myr305中的黏康酸和乙酸生產(chǎn)，這些菌株轉(zhuǎn)化有表達編碼莽草酸生物合成通路中的dahp合酶的arog的質(zhì)粒pcp32amp和表達編碼在黏康酸通路中起作用的蛋白的aroz、aroy和catax基因的質(zhì)粒pmg37。myr170菌株具有aroe基因缺失和在宿主染色體dna中ack基因座處插入的處于p15啟動子控制下的arob基因的額外拷貝。myr261和myr305是myr170菌株的衍生物。myr261具有在宿主染色體dna上的poxb基因座處整合的tkta基因的額外拷貝，而myr305在宿主染色體dna上的poxb基因座處具有缺失

圖12.由大腸桿菌菌株myr34產(chǎn)生的內(nèi)源性dhs向黏康酸的轉(zhuǎn)化。大腸桿菌myr34菌株在編碼莽草酸脫氫酶的aroe基因中具有缺失。因此，存在dhs的積累。當myr34菌株用表達在黏康酸通路中起作用的蛋白的編碼基因aroz、aroy和catax的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化時，dhs轉(zhuǎn)化成黏康酸。然而，當用無任何外源基因的空質(zhì)粒載體(pcl1921)轉(zhuǎn)化myr34菌株時，沒有出現(xiàn)dhs轉(zhuǎn)化成黏康酸。

圖13.aroz同源物將dhs轉(zhuǎn)入黏康酸通路中的能力的比較。將三種不同的aroz同源物，即來自不動桿菌屬物種adp1的quic、來自蘇云金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis)的asbf和來自粗糙脈孢菌的qa-4克隆到還分別自p15和λpr啟動子表達catax和aroy基因的低拷貝質(zhì)粒中p26啟動子下。通過轉(zhuǎn)化使這三種不同的質(zhì)粒構建體在myr34中表達，并測量所產(chǎn)生的黏康酸的量。

圖14.將單拷貝的catax、aroy和quic染色體整合到大腸桿菌myr170菌株(δaroe,δack::p15-arob)中，產(chǎn)生myr352(seqidno.41)。還用攜帶黏康酸通路運作所需的所有基因的低拷貝質(zhì)粒pmg37轉(zhuǎn)化myr170，得到myr219菌株。用yep24(中拷貝的空載體)或pcp32amp(中拷貝的arog表達質(zhì)粒)或pcp50(中拷貝arog和tkta表達質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化myr352和myr219，并使用hplc方法對產(chǎn)生的pca、兒茶酚和黏康酸的量進行定量。

圖15.通過增加catax的表達來去除myr352中的兒茶酚積累。對myr352轉(zhuǎn)化僅表達aroy的質(zhì)粒(pmg27)或僅表達quic的質(zhì)粒(pmg39)或表達所有三種黏康酸通路基因即catax、aroy和quic的質(zhì)粒(pmg37)或僅表達黏康酸通路中的兩種基因即catax和aroy的質(zhì)粒(pmg33)。僅catax的過表達足以防止兒茶酚積累。

圖16.利用不同體系輸入葡萄糖的菌株的生長。ptshi和galp(myr31)的缺失導致在基本葡萄糖培養(yǎng)基中生長不足，而安置glf和glk基因(myr217)挽回生長。對照菌株myr34是δaroe，否則則是野生型。向培養(yǎng)基中添加三種芳族氨基酸和三種芳族維生素以允許營養(yǎng)缺陷型菌株的生長。

圖17.大腸桿菌myr34和myr217菌株中的dhs生產(chǎn)。當用導致dhs生產(chǎn)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化時，利用glf-glk用于葡萄糖輸入的myr217較之利用磷酸轉(zhuǎn)移酶體系(pts)的myr34的轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生更高滴度的dhs。

圖18.在7升發(fā)酵罐中以大腸桿菌myr428菌株進行的黏康酸生產(chǎn)。對用質(zhì)粒pcp32amp和pmg37轉(zhuǎn)化具有δaroeδacka::p15-arobδpoxb::tkta基因型的大腸桿菌myr261菌株以產(chǎn)生大腸桿菌myr428菌株。

優(yōu)選實施方式詳述

如本專利申請中所用，短語“例如”或“如”意指對于當下主題存在多于一種的方法、途徑、方案或物質(zhì)組成，且給出的實例并不意在局限于該實例。

術語“異源的”是指并非在生物體中天然或原生發(fā)現(xiàn)、但可以通過基因改造如通過轉(zhuǎn)化、交配或轉(zhuǎn)導而引入到生物體中的基因或蛋白。異源基因可以整合(插入)到染色體中或包含于質(zhì)粒上。術語“外源的”是指出于提高、降低或消除活性的目的通過基因改造如通過轉(zhuǎn)化、交配、轉(zhuǎn)導或突變已經(jīng)引入到生物體中或在生物體中改變的基因或蛋白。外源基因或蛋白可以是異源的，或者其可以是對于宿主生物體為原生但通過一種或多種方法例如突變、缺失、改變啟動子、改變終止子、重復或者在染色體或質(zhì)粒中插入一個或多個額外拷貝而改變的基因或蛋白。因此，例如，如果在染色體中在與原生位點不同的位點處插入arob基因的第二拷貝，第二拷貝將是外源性的。

如本發(fā)明中所用的術語“微生物”包括可通過發(fā)酵方法用于順，順-黏康酸的商業(yè)生產(chǎn)的細菌、古細菌、酵母、藻類和絲狀真菌。

對于命名法，基因或編碼區(qū)通常以斜體的小寫字母命名，例如“aroz”，而由基因所編碼的酶或蛋白可以以相同的字母命名但第一個字母大寫且不斜體，例如“aroz”或“aro1p”，后者為在酵母中使用的用于指示酶或蛋白的慣例的實例?！皃”是由所指示的基因編碼的蛋白的縮寫。酶或蛋白也可以用更加描述性的名稱指代，例如，aroz也可以指代3-脫氫莽草酸脫水酶。編碼具有特定催化活性的酶的實例之一的基因或編碼區(qū)可以因歷史不同起源或因為基因來源于不同種類而具有數(shù)種不同的名稱。例如，編碼蘇云金芽孢桿菌或炭疽桿菌(bacillusanthracis)的3-脫氫莽草酸脫水酶的基因可命名為asbf而非aroz，來自構巢曲霉(aspergillusnidulans)的相關基因可命名為qutc，來自粗糙脈胞桿菌的相關基因可命名為qa-4，而來自貝氏不動桿菌(acinetobacterbaylyi)(也稱為乙酸鈣不動桿菌和不動桿菌屬物種adp1)的相關基因可命名為quic。

“質(zhì)?！币庵笇嵸|(zhì)地小于染色體、與微生物的一個或多個染色體分開且獨立于一個或多個染色體進行復制的環(huán)狀或線性dna分子?！百|(zhì)粒”可以以每細胞約一拷貝或以每細胞多于一個的拷貝存在。將質(zhì)粒維持在微生物細胞中通常需要抗生素選擇，但也可使用營養(yǎng)缺陷型互補。

如本發(fā)明中所用的術語“染色體”或“染色體dna”在細菌細胞的環(huán)境下是實質(zhì)地大于質(zhì)粒且不需要任何抗生素選擇的環(huán)狀dna分子。

“表達盒”意指這樣的dna序列，其可以是染色體或質(zhì)粒的一部分，并且其含有至少啟動子和編碼酶或其它蛋白的基因或區(qū)域，從而使編碼區(qū)由啟動子表達，且含有該dna序列的宿主細胞產(chǎn)生該酶或蛋白。“表達盒”可以是至少部分合成的或通過基因工程方法構建，從而使編碼區(qū)從并非與編碼區(qū)天然關聯(lián)的啟動子表達。任選地，“表達盒”可含有轉(zhuǎn)錄終止子，其可以是或者可以不是與編碼區(qū)天然關聯(lián)的終止子?！氨磉_盒”可以具有針對多于一個蛋白的編碼區(qū)，在這種情況下其可稱為操縱子或合成操縱子。

基因或編碼區(qū)的“過表達”意指致使在相同或相似的生長條件下由該基因或編碼區(qū)編碼的酶或蛋白以高于宿主微生物野生型形式中所見水平的水平在宿主微生物中產(chǎn)生。這可以通過例如一種或多種以下方法而實現(xiàn)：1)安置更強的啟動子，2)安置更強的核糖體結合位點，如5’-aggagg的dna序列，使其位于翻譯起始密碼子上游約四至十個堿基的位置，3)安置終止子或更強的終止子，4)改善對編碼區(qū)中一個或多個位點處的密碼子的選擇，5)改善mrna穩(wěn)定性，和6)提高基因的拷貝數(shù)，通過在染色體中引入多個拷貝或是在多拷貝質(zhì)粒上放置盒。由過表達的基因產(chǎn)生的酶或蛋白被稱為“超量產(chǎn)生的”?！斑^表達的”基因或“超量產(chǎn)生的”蛋白可以是對于宿主微生物原生的基因或蛋白，或者其可以是已通過基因工程方法從不同的生物體移植到宿主微生物中的基因或蛋白，在這種情況下酶或蛋白以及編碼該酶或蛋白的基因或編碼區(qū)被稱為“外來的”或“異源的”。外來的或異源的基因和蛋白按定義是過表達和超量產(chǎn)生的，因為它們在未經(jīng)改造的宿主生物體中不存在。

第一基因、dna序列或蛋白的“同源物”是執(zhí)行與所述第一基因、dna序列或蛋白相似的生物學功能，且經(jīng)用于序列比較的blast計算機程序所測定(altschul等人，1990；altschul等人，1997)與所述第一基因或蛋白具有至少25％的序列同一性(當比較蛋白序列或比較從基因序列得到的蛋白序列時)，并允許缺失和插入的第二基因、dna序列或蛋白。大腸桿菌arog基因的同源物實例會是來自鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium)的arog基因。

第一基因、dna序列或蛋白的“類似物”是執(zhí)行與所述第一基因、dna序列或蛋白相似的生物學功能，且經(jīng)用于序列比較的blast計算機程序所測定(altschul等人，1990；altschul等人，1997)與所述第一基因、dna序列或蛋白具有少于25％的序列同一性(當比較蛋白序列或比較從基因序列得到的蛋白序列時)，并允許缺失和插入的第二基因、dna序列或蛋白。肺炎克雷伯桿菌aroz蛋白的類似物的實例會是來自構巢曲霉的qutc蛋白，因為兩種蛋白都是催化3-脫氫莽草酸脫水酶反應的酶，但在兩種酶或其各自的基因之間沒有顯著的序列同源性。本領域中有見解的科學家將會知曉，在許多不同的生物體中可以找到許多具有特定生物學功能的酶和蛋白，如dahp合酶或3-脫氫莽草酸脫水酶，它們或是作為同源物或是作為類似物，并且因為這些酶或蛋白家族的成員共有相同的功能，故盡管它們可能在結構上稍有不同或?qū)嵸|(zhì)不同，但在許多情況下，使用現(xiàn)有的基因改造方法，相同家族的不同成員可以用于執(zhí)行相同的生物學功能。因此，例如，aroz酶和qutc酶催化相同的反應，dhs脫水酶，這樣任一者在合適的環(huán)境下都會導致順，順-黏康酸產(chǎn)生，并且選哪一個來使用最終可通過選擇在相似的發(fā)酵條件下產(chǎn)生更高滴度的順，順-黏康酸的一個來作出選擇。

“非芳族碳源”或“非芳族化合物”是可作為碳源和/或能量用于供養(yǎng)本發(fā)明的微生物的含碳化合物，其中該化合物不含有與苯相關的六元環(huán)。非芳族碳源的實例包括葡萄糖、木糖、乳糖、甘油、醋酸、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、麥芽糖或蔗糖。“芳族化合物”是含有一個或多個與苯相關的六元環(huán)的化合物。芳族化合物的實例是兒茶酚或1,2-二羥基苯。

“強組成型啟動子”是這樣的dna序列，其通常位于由rna聚合酶轉(zhuǎn)錄的dna序列或基因的上游(當以習慣的5’至3’方向描述時在基因的5’側)，并且其導致所述dna序列或基因通過rna聚合酶轉(zhuǎn)錄以容易經(jīng)由任何適當?shù)臏y定法步驟直接或間接檢測到的水平表達。適當?shù)臏y定法步驟的實例包括1)定量逆轉(zhuǎn)錄酶+pcr，2)對于所編碼酶的酶測定法，3)考馬斯藍染色的蛋白凝膠，或4)可測量的作為所述轉(zhuǎn)錄的結果間接產(chǎn)生的代謝物的產(chǎn)生，且這樣的可測量的轉(zhuǎn)錄的發(fā)生不論特定調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平的蛋白、代謝物或誘導物化學品存在與否。不是“強組成型啟動子”的啟動子的實例是大腸桿菌的plac啟動子，因為其在沒有乳糖或誘導物iptg的情況下受阻遏物的阻遏。通過使用領域內(nèi)熟知的方法，可以使用“強組成型啟動子”取代原生的啟動子(否則天然存在于dna序列或基因上游的啟動子)，得到如下的表達盒，所述表達盒可以置于質(zhì)粒中或染色體中，且以高于原生啟動子水平的水平提供期望dna序列或基因的表達水平。強組成型啟動子可以是種或?qū)偬禺愋缘?，但來自細菌的強組成型啟動子常?？梢栽谶h緣相關的細菌中良好發(fā)揮功能。例如，來自枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)或來自通常在枯草芽孢桿菌上生長的噬菌體的啟動子可以在大腸桿菌中良好發(fā)揮功能?！皬娊M成型啟動子”與誘導型啟動子如ptac實質(zhì)地不相同，誘導型啟動子已在現(xiàn)有技術中用于生產(chǎn)順，順-黏康酸且對于期望的功能水平通常需要昂貴的化學品或其它環(huán)境變化(niu等人，2002)。強組成型啟動子的實例是來自枯草芽孢桿菌噬菌體sp01的p15、p26，和大腸桿菌噬菌體λpr(seqidno.1、2和3)。

“黏康酸通路”是指從dhs到pca到兒茶酚到順，順-黏康酸的生化通路，且“黏康酸通路基因”是這樣的基因，其編碼催化黏康酸通路中的步驟的酶，或編碼用來增強所述酶例如aroz、aroy、cata、catx和qutc中之一者的活性的輔助功能。dhs是3-脫氫莽草酸鹽的縮寫，且pca是原兒茶酸的縮寫?！梆た邓豳|(zhì)?！笔呛幸环N或多種黏康酸通路基因的質(zhì)粒。

本發(fā)明中所用的一些基因操縱的中心圍繞著如圖1所示的存在于細菌細胞中的芳族氨基酸生物合成共同通路。圖1所示的從dahp合酶到分支酸合酶的芳族氨基酸生物合成共同通路也稱為“莽草酸通路”。

關于微生物基因改造以生產(chǎn)芳族氨基酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸有著大量的已公開工作(us4,681,852、us4,753,883、us6,180,373、歐洲專利申請86300748.0)。方法包括利用反饋抗性酶(arof、arog、phea、tyra)、轉(zhuǎn)錄阻遏(tyrr)的去調(diào)控、增加啟動子強度(ptac、plac)和增加一個或多個基因(tkta)的拷貝數(shù)的多種組合。然而，上述方法的許多具體組合并未嘗試過，或是因為存在太多的組合而難以無過度實驗地進行嘗試，或是因為不能洞察哪一種將是最佳組合。更重要的是，這些基因操縱組合的任一種在開發(fā)用于使用可再生的非芳族碳源來商業(yè)生產(chǎn)黏康酸的生物催化劑中的適用性尚不知曉。

對于許多微生物特別是大腸桿菌，芳族氨基酸生物合成通路是熟知的(neidhardt和curtiss,1996)。在野生型細胞中，該通路受反饋抑制和轉(zhuǎn)錄阻遏的緊密調(diào)控。第一個關鍵步驟由脫氧-阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸(dahp)合酶催化，對其而言存在由arof、arog和aroh編碼的三種同工酶。三種同工酶arof、arog和aroh分別受芳族氨基生物合成通路的產(chǎn)物即酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的反饋抑制。對所有三者具有反饋抗性的突變體是已知的(draths等人，1992；lutke-eversloh和stephanopoulos,2007；hu等人，2003；shumilin等人，1999)。本發(fā)明的一個方面涉及利用arof、arog和aroh基因的反饋抗性等位基因以表達抵抗芳族氨基酸生物合成通路的產(chǎn)物的反饋抑制的arof、arog和aroh酶蛋白。芳族通路中涉及的數(shù)種操縱子的轉(zhuǎn)錄受tyrr基因所編碼的阻遏物或trpr基因所編碼的阻遏物或二者的調(diào)控(neidhardt等人，1996)。特別重要的是當tyrr蛋白與一種或多種芳族氨基酸結合時其對arog和arof轉(zhuǎn)錄的負調(diào)節(jié)。本發(fā)明的一個方面涉及通過從宿主細菌菌株的染色體中消除tyrr或trpr基因而去除這些基因的負調(diào)節(jié)。

本發(fā)明的主題是創(chuàng)造具有新的基因改造元件的基因改造盒的新組合，以提高用于大規(guī)模商業(yè)生產(chǎn)順，順-黏康酸產(chǎn)生菌株的發(fā)酵參數(shù)和適用性。特別地，生產(chǎn)順，順-黏康酸的現(xiàn)有技術并未教導遺傳元件的某些組合，例如但不限于，超量產(chǎn)生的反饋抗性的arog、超量產(chǎn)生的反饋抗性的arof、過表達的tkta、過表達的tala、染色體上整合的用于從強組成型啟動子表達aroz、aroy和catax(或其類似物或同源物)的表達盒，以及滲漏aroe等位基因(我們將其定義為編碼aroe酶的基因，該aroe酶對于芳族氨基酸和維生素的原養(yǎng)型，但不導致芳族化合物的顯著分泌)的多種組合。

本文公開的菌株構建體的所有具體實例衍生自野生型大腸桿菌c菌株(atcc8739)或大腸桿菌k-12菌株(ymc9或mm294)，但本文公開的遺傳元件可以組裝到任何其它合適的大腸桿菌菌株中，且本文公開的表達盒或遺傳元件的適當類似物和同源物可以組裝到任何其它的合適微生物中，如可通過發(fā)酵方法用于商業(yè)生產(chǎn)順，順-黏康酸的其它種類的細菌、古生菌、酵母、藻類和絲狀真菌。

在大腸桿菌中，自葡萄糖的芳族氨基酸生物合成通路起始于戊糖磷酸通路(ppp)的非氧化分支。非氧化戊糖磷酸通路中的四種關鍵酶是轉(zhuǎn)酮醇酶、轉(zhuǎn)醛醇酶、核酮糖-5-磷酸差向異構酶和核酮糖-5-磷酸異構酶。這些酶催化導致從己糖或戊糖糖類形成赤蘚糖-4-磷酸(e4p)的反應。為提高大腸桿菌中e4p的可得性，可以過表達編碼轉(zhuǎn)酮醇酶的tkta基因(niu等人，2002)。類似地，還預期過表達轉(zhuǎn)醛醇酶基因在一些情況中提高e4p的可得性(bongaerts等人，2001)。在本發(fā)明的另一方面，通過導致轉(zhuǎn)酮醇酶和轉(zhuǎn)醛醇酶的酶活性增加的基因操縱來增強轉(zhuǎn)酮醇酶和轉(zhuǎn)醛醇酶基因的表達。在本發(fā)明的另一方面，通過超量產(chǎn)生核酮糖-5-磷酸差向異構酶和核酮糖-5-磷酸異構酶來提高經(jīng)由ppp的非氧化分支的通量。

共同芳族氨基酸通路中的第一關鍵步驟和最緊密調(diào)節(jié)的反應是經(jīng)dahp合酶(由arog、arof和aroh編碼)的磷酸烯醇丙酮酸(pep)和e4p的縮合以產(chǎn)生脫氧阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸(dahp)。大腸桿菌消耗的d-葡萄糖部分通過ppp且部分通過糖酵解被帶入芳族生物合成。當通過用提高拷貝數(shù)而使表達增強的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化來擴增轉(zhuǎn)酮醇酶(tkta)和dahp合酶(arog)的同工酶時，進入芳族通路的葡萄糖流大大提高(niu等人，2002)。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，出于擴大轉(zhuǎn)酮醇酶和dahp合酶的酶活性的目的，將外源arog和tkta基因整合到染色體dna中。

在本發(fā)明的另一實施方案中，通過增加dahp合成可用的pep來提高微生物細胞中經(jīng)由pep的通量。許多菌屬細胞在利用磷酸轉(zhuǎn)移酶體系(pts)的跨細胞膜葡萄糖轉(zhuǎn)運中消耗pep，其中對于每分子跨細菌外膜轉(zhuǎn)運的葡萄糖消耗一個pep分子。通過用非pep依賴性的(pep獨立的)葡萄糖攝取機制取代或補償pep依賴性的pts，可以增加微生物細胞內(nèi)芳族氨基酸生物合成通路可用的pep池的大小。例如，用于糖攝取的pts體系可以由基于galp的糖攝取體系或基于glf/glk蛋白的糖轉(zhuǎn)運體體系進行取代或補償(chandran等人，2003；yi等人，2003)。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，除了出于保存微生物細胞內(nèi)的pep池的目的將用于糖攝取的pts體系缺失外，還出于保存微生物細胞內(nèi)的atp的目的將基于galp的糖攝取體系失活。在pts體系和基于gal-p的糖攝取體系(δpts/δgalp)的運作都有缺陷的微生物細胞中，可通過引入編碼glf的外源基因，或編碼glf(葡萄糖易化擴散蛋白)和glk(葡糖激酶)蛋白二者的外源基因來實現(xiàn)糖攝取。如本發(fā)明所用，術語功能性的葡萄糖易化擴散蛋白是指任何glf蛋白以及在功能上等同于glf且作用于通過易化擴散將糖轉(zhuǎn)運到微生物細胞中的任何其它蛋白。在本發(fā)明的一個方面，將編碼葡萄糖易化蛋白glf的基因引入δpts/δgalp微生物細胞中，且轉(zhuǎn)運到微生物細胞中的葡萄糖通過內(nèi)源葡萄糖激酶而磷酸化。在本發(fā)明的另一方面，將編碼glf和glk蛋白二者的基因引入到δpts/δgalp微生物細胞中。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，引入到微生物細胞中的外源glf和glk基因被整合到宿主染色體dna中。

在本發(fā)明的另一實施方案中，當生長用的碳源和能量需要糖異生(例如如果碳源是醋酸鹽或琥珀酸鹽)時，可通過提高細胞內(nèi)已存在的羧化酶(例如pep羧化激酶，其由大腸桿菌中的pck編碼)的活性或通過引入外源的羧化酶而增加pep池。在優(yōu)選的實施方案中，引入的編碼羧化酶的外源基因穩(wěn)定整合到宿主染色體中。編碼羧化酶的基因可以源自多種多樣的微生物種類。編碼羧化酶的基因還可經(jīng)歷基因操縱，從而使得用于順，順-黏康酸生產(chǎn)的生物催化劑內(nèi)的羧化酶表達顯著增加。

在本發(fā)明的另一實施方案中，通過降低或消除利用pep作為底物的丙酮酸激酶如pyka和pykf的活性而增加微生物細胞內(nèi)的pep池。

從dahp，芳族氨基酸通路經(jīng)由多個中間體至分支酸(cha)，其是三種芳族氨基酸即l-酪氨酸(l-tyr)、l-苯丙氨酸(l-phe)和l-色氨酸(l-trp)的生物合成的分支點。

在共同芳族氨基酸通路的初始階段，3-脫氫奎尼酸(dhq)合酶(arob)從dahp移除磷酸基，導致dhq的形成。酶dhq脫水酶(arod)從dhq中移除水分子，導致3-脫氫莽草酸鹽(dhs)的形成，其隨后被莽草酸脫氫酶(aroe)還原成莽草酸鹽(shk)。莽草酸激酶i/ii(arok，arol)將莽草酸鹽磷酸化成莽草酸3-磷酸(s3p)。s3p與pep進行縮合，導致5烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸(epsp)的形成。epsp的形成由epsp合酶(aroa)介導。epsp的磷酸基由分支酸合酶(aroc)移除，導致分支酸(cha)的形成。

如圖2中所示，芳族氨基酸通路可以因aroe基因突變在3-脫氫莽草酸鹽(dhs)轉(zhuǎn)化成莽草酸鹽(shk)的水平被阻斷，導致dhs的積累(niu等人，2002)。引入外源aroz基因起到將dhs轉(zhuǎn)化成原兒茶酸(pca)的作用。pca隨后通過由aroy酶介導的脫羧反應轉(zhuǎn)化成兒茶酚。兒茶酚通過cata基因產(chǎn)物的作用最終轉(zhuǎn)化成順-順黏康酸(ccmua)。ccmua可以受馬來酰乙酰乙酸異構酶的作用而產(chǎn)生反-反黏康酸(ttmua)。從dhs到ccmua和ttmua的生物合成通路被稱為黏康酸通路。負責將dhs轉(zhuǎn)化成ccmua的三種不同基因可以從多種微生物種類獲得并引入到選擇用于黏康酸生產(chǎn)的微生物如大腸桿菌中。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，編碼黏康酸通路所涉及蛋白的外源基因被整合到宿主染色體dna中。

在將芳族氨基酸通路重定向到順，順-黏康酸生產(chǎn)的過程中，aroe基因突變是關鍵性的。aroe基因可以完全失活，導致芳族氨基酸生物合成的完全阻斷，如使用描述用于黏康酸生產(chǎn)的大腸桿菌wn1/pwn2.248菌株所進行的(niu等人，2002)。采用wn1/pwn2.248大腸桿菌菌株和相關菌株的重大缺點在于，由于aroe基因完全失活，該菌株成為上述的芳族酸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸以及芳族維生素或維生素類化合物的營養(yǎng)缺陷型。結果，在其生長以生產(chǎn)順，順-黏康酸的過程中，該菌株需要外源添加這六種化合物(或共同中間體，如莽草酸鹽)，由此使得利用該菌株進行的順，順-黏康酸商業(yè)生產(chǎn)的成本實質(zhì)增加。克服對芳族氨基酸的外部來源的這種依賴性的新方法是使用具有aroe滲漏突變的菌株。滲漏aroe突變體將允許有限的碳流向莽草酸，同時積累顯著量的dhs，其隨后可用于經(jīng)由aroz酶的作用轉(zhuǎn)化成pca。由此，使用aroe的滲漏突變體形式將消除對外源芳族氨基酸的依賴性，同時仍然將碳流轉(zhuǎn)向順，順-黏康酸。

用于合成dhs轉(zhuǎn)化成順，順-黏康酸所必需的aroz、aroy和cata蛋白的編碼基因可以源自許多微生物種類。在一個實施方案中，這些外源基因整合到正在開發(fā)的生物催化劑的宿主染色體中。在優(yōu)選的實施方案中，這些外源基因在生物催化劑內(nèi)的表達由組成型啟動子驅(qū)動而不需要任何誘導物。

中間體原兒茶酸的生物合成需要3-脫氫莽草酸脫水酶(aroz；ec4.2.1.118)這種酶。在本說明書中，“aroz”應指任何催化3-脫氫莽草酸脫水酶反應的酶。在現(xiàn)有技術中，該酶從肺炎克雷伯桿菌菌株a170-40(atcc25597)的aroz基因表達(niu等人，2002；draths和frost，1995)。然而，aroz的比活在生物體之間廣泛變化，從0.1至261微摩爾/min/mg(wheeler等人，1996；fox等人，2008；pfleger等人，2008)，因此，通過從比肺炎克雷伯桿菌具有更高的比活的生物體，例如貝氏不動桿菌、構巢曲霉(wheeler等人,1996)(現(xiàn)在也稱為構巢裸胞殼(emericellanidulans))、或粗糙脈孢菌(rutledge，1984；stroman等人，1978)、或鵝柄孢殼菌(podosporaanserina，也稱為podosporapauciseta)(hansen等人，2009)表達aroz基因，其也稱為asbf(fox等人,2008；pfleger等人,2008)、qutc(wheeler等人,1996)、qa-4(rutledge,1984)和quic，可以具有顯著的改進。

作為一個特別的實例，來自粗糙脈孢菌的編碼3-脫氫莽草酸脫水酶的qa-4基因的編碼序列可以通過數(shù)種已知方法中的任一者獲得，例如全基因dna合成、cdna克隆或通過基因組dna克隆與pcr或合成dna接頭合成的組合。由于qa-4基因中沒有內(nèi)含子，可以通過pcr從基因組dna獲得編碼區(qū)(rutledge,1984)。qa-4酶的蛋白序列(seqidno.4)和原生基因的dna序列(seqidno.5)是已知的。

備選地，可以從構巢曲霉針對3-脫氫莽草酸脫水酶構建表達盒。來自構巢曲霉的qutc酶的編碼序列可以通過數(shù)種已知方法中的任一者獲得，例如全基因dna合成、cdna克隆或通過基因組dna克隆與pcr或合成dna接頭合成的組合。qutc的蛋白序列(seqidno.6)和不含內(nèi)含子的原生基因的dna序列是已知的(seqidno.7；genbank檢索號m77665.1)。表達盒可以通過dna合成，或通過基因組克隆與pcr的組合得到，從而使qutc酶能在大腸桿菌中準確產(chǎn)生。通過在大腸桿菌中從強組成型啟動子表達qutc的編碼序列，可以從整合到染色體中的一個或兩個拷貝的基因獲得充分表達，省去了可能導致不穩(wěn)定性的并且如現(xiàn)有技術中所公開的在多拷貝質(zhì)粒上維持多于兩個拷貝的表達盒的需求(niu等人，2002)。上述方法通?？梢杂糜讷@得編碼期望的酶的dna序列，并且該編碼序列隨后可用于構建設計為在大腸桿菌中或另一合適的微生物宿主生物體中發(fā)揮功能的表達盒。

aroz的比活也可以通過利用現(xiàn)有技術的蛋白序列(niu等人，2002)但構建改進的表達盒來加以改進，例如，其中在編碼區(qū)之前已安置更強的啟動子和/或核糖體結合位點(rbs)，如實施例4中所描述的。

來自肺炎克雷伯桿菌菌株a170-40的編碼aroz(3-脫氫莽草酸脫水酶)的aroz基因可以按現(xiàn)有技術中所描述的來獲得。該基因的dna序列和周圍的dna可以通過領域內(nèi)熟知的方法確定?？衫迷膁na序列將本發(fā)明的異源基因例如aroz建立到表達盒中，或者其可用針對預定宿主生物體密碼子優(yōu)化的序列合成?？梢园从涊d的(draths和frost,1995)從任何其它含有活性aroz基因的微生物克隆aroz基因，其中所述微生物例如肺炎克雷伯桿菌菌株342、不動桿菌屬物種adp1(貝氏不動桿菌adp1)、蘇云金芽孢桿菌、構巢裸胞殼、解淀粉歐文氏菌(erwiniaamylovora)、惡臭假單胞菌w619和許多其它菌。

中間體兒茶酚的生物合成需要原兒茶酸脫羧酶(aroy；ec4.1.1.63)這種酶。在本說明書中，“aroy”應指任何催化原兒茶酸脫羧酶反應的酶。在現(xiàn)有技術中，該酶從在多拷貝質(zhì)粒上的肺炎克雷伯桿菌菌株a170-40(atcc25597)的aroy基因表達(niu等人，2002)。然而，再一次地，可以通過從整合到宿主生物體的染色體中的一個或兩個拷貝的表達盒產(chǎn)生充足的酶來獲得方法改進。這可以通過從以下的生物體獲得aroy基因來實現(xiàn)，所述生物體天然產(chǎn)生較之現(xiàn)有技術的肺炎克雷伯桿菌aroy酶具有更高比活的aroy酶，或通過提高肺炎克雷伯桿菌aroy的表達水平而實現(xiàn)，所述提高表達水平是通過構建例如利用強組成型啟動子和/或強rbs的表達盒而進行，如以上對實施例4描述的。來自肺炎克雷伯桿菌菌株a170-40的aroy的蛋白序列在seqidno.8中給出。對應的基因aroy可以如上所述進行克隆(draths和frost,1995)，或者基于蛋白序列，其可以用針對預定宿主生物體優(yōu)化的密碼子合成。

aroy基因可以從含有同源物或類似物的任何其它微生物獲得，例如肺炎克雷伯桿菌菌株nctc418(atcc15380)、肺炎克雷伯桿菌342和arxulaadeninivorans(sietmann等人,2010)。來自肺炎克雷伯桿菌342的aroy基因的dna序列和周圍的dna在seqidno.9中給出。

順，順-黏康酸生物合成的最后步驟需要兒茶酚1,2-雙加氧酶(cata；ec1.13.11.1)這種酶。在本說明書中，“cata”應指任何催化兒茶酚1,2-雙加氧酶反應的酶。在現(xiàn)有技術中，該酶從多拷貝質(zhì)粒上的乙酸鈣不動桿菌菌株adp1的cata基因表達(niu等人，2002)。來源菌株，乙酸鈣不動桿菌菌株adp1顯然已重命名為不動桿菌屬物種adp1和貝氏不動桿菌adp1(neidle和ornston,1986；barbe等人,2004；deberardinis等人,2008)。在該現(xiàn)有技術實例中，cata基因從ptac啟動子表達，該啟動子需要乳糖或iptg(異丙基硫代半乳糖苷)作為誘導物。這些化合物對于用于商業(yè)發(fā)酵而言太過昂貴，因此再一次地，需要通過將表達盒整合到染色體中對方法進行顯著改進，既為了消除對昂貴誘導物的需求，也為了產(chǎn)生更穩(wěn)定的菌株。這可以通過構建利用強組成型啟動子、強rbs、和/或更穩(wěn)定的mrna的cata基因的表達盒而實現(xiàn)，如以上其他實施例中所述。

來自貝氏不動桿菌adp1的cata基因的dna序列和周圍序列在seqidno.10中給出。來自相同菌株的cata的蛋白序列在seqidno.11中給出。在優(yōu)選的實施方案中，cata的表達盒含有一個或兩個額外的天然存在于cata下游的開放閱讀框，以提高cata基因的表達水平(schirmer和hillen，1998)。許多其它生物體可以是cata基因的來源，例如小田假單胞菌(pseudomonasarvilla)、熒光假單胞菌(pseudomonasfluorescens)(nakazawa等人，1967；kojima等人，1967)、鏈霉菌屬物種菌株2065(streptomycessp.strain2065)(iwagami等人，2000)、鉤蟲貪銅菌335t(cupriavidusnecator335t)和許多其它菌(perez-pantoja等人，2008)。

為了提高朝向順，順-黏康酸的碳流，除了通過利用滲漏aroe突變體減小從dhs到莽草酸鹽(shk)的碳流，還有必要阻斷從芳族氨基酸通路分支出的某些其它通路。一些細菌，例如不動桿菌屬和假單胞桿菌屬中的一些細菌，含有名為poba的基因，其編碼將dhs轉(zhuǎn)化成沒食子酸的對羥基苯甲酸水解酶這種酶。盡管大腸桿菌中未曾發(fā)現(xiàn)poba同源物或類似物，但經(jīng)改造以生產(chǎn)dhs的大腸桿菌菌株分泌可測量量的沒食子酸(li和frost,1999)，因此有可能這種酶確實存在于大腸桿菌中。此外，源自dhs的pca可以通過由poba基因所編碼的對羥基苯甲酸水解酶(poba)酶的作用轉(zhuǎn)化成沒食子酸。由此產(chǎn)生的沒食子酸可以在隨后被轉(zhuǎn)化成焦性沒食子酸。阻斷所選的生物催化劑中通向沒食子酸和焦性沒食子酸的碳流以提高順，順-黏康酸的一種方式是通過基因操縱而阻斷或減小對羥基苯甲酸水解酶(poba)蛋白的活性。相似地，dhs的前體——dhq也可以受aroe所編碼的莽草酸脫氫酶的作用，導致奎寧酸的產(chǎn)生。在本發(fā)明的實施方案中，對滲漏aroe突變體酶額外選擇或篩選其在將dhq轉(zhuǎn)化成奎寧酸方面的失能或降低的能力。

生產(chǎn)反，反-黏康酸代替順，順-黏康酸有數(shù)個優(yōu)點。在使用乙烯用于生產(chǎn)對苯二甲酸的狄爾斯–阿爾德反應(dielsalderreaction)中對反，反-黏康酸的偏好高于順，順-黏康酸。具有經(jīng)基因操縱的芳族通路的生物催化劑產(chǎn)生順，順-黏康酸，所述順，順-黏康酸可以在細胞外利用化學轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化成反，反-黏康酸。另一方面，通過將馬來酰乙酰乙酸異構酶或相似的異構酶引入到生物催化劑中，可以在細菌生物催化劑中將順，順-黏康酸轉(zhuǎn)化成反，反-黏康酸。

本專利申請的說明書提供了與構建足以生產(chǎn)黏康酸的微生物菌株相關的本發(fā)明的數(shù)個不同方面。本領域技術人員能夠匯編本發(fā)明的數(shù)個不同方面以構建具有極高效率的用于生產(chǎn)黏康酸的生物催化劑。

實驗部分

總論

菌株和接種體制備：本發(fā)明中所用的細菌菌株和質(zhì)粒的清單提供于表1中。本文公開的菌株構建體的所有具體實例衍生自野生型大腸桿菌c菌株(atcc8739)或大腸桿菌k-12菌株(ymc9或mm294)，但本文公開的遺傳元件可以組裝到任何其它合適的大腸桿菌菌株中，且本文公開的表達盒或遺傳元件的適當類似物和同源物可以組裝到任何其它的合適微生物中，如可通過發(fā)酵方法用于商業(yè)生產(chǎn)順，順-黏康酸的其它種類的細菌、古生菌、酵母、藻類和絲狀真菌。

大腸桿菌c能在am1礦物培養(yǎng)基中發(fā)酵10％葡萄糖。am1培養(yǎng)基含有2.63g/l(nh4)2hpo4、0.87g/lnh4h2po4、1.5mmmgso4、1.0mm甜菜堿、和1.5ml/l痕量元素。痕量元素制備成1000x儲液并且含有以下組分：1.6g/lfecl3、0.2g/lcocl2·6h2o、0.1g/lcucl2、0.2g/lzncl2·4h2o、0.2g/lnamoo4、0.05g/lh3bo3、和0.33g/lmncl2·4h2o。用1.0～10.0mkoh或1.0～9.0m氫氧化銨使發(fā)酵液的ph維持在7.0。

發(fā)酵：通過從經(jīng)基因改造的并存儲于-80℃冰箱中的大腸桿菌菌株的40％甘油儲液在新鮮的nbs-2％葡萄糖(jantama等人,2008a)平板上劃線接種而開始發(fā)酵。通過在瓊脂板和液體培養(yǎng)基中包含合適的(一種或多種)抗生素而保留質(zhì)粒(如果存在的話)。氨芐青霉素(鈉鹽)以150mg/l使用，壯觀霉素hcl以100mg/l使用，四環(huán)素hcl以15mg/l使用，且硫酸卡那霉素以50mg/l使用。在24至48小時(37℃)后，將單克隆挑選到搖瓶中25ml的相同培養(yǎng)基中。在于37℃200rpm震蕩直至細胞生長至約1.0的od600后，在冰上冷卻培養(yǎng)物并添加等體積的無菌80％甘油。然后將2ml的等分物在-80℃凍存以用作發(fā)酵用的接種物。

細胞生長：通過使用thermoelectronicspectronic20分光光度計測量550nm(od550)或600nm(od600)下的光密度來估算細胞質(zhì)量。

對莽草酸通路和黏康酸通路中的中間體的分析：利用購自sigma-aldrich的標準物，通過hplc和watersalliance儀器并監(jiān)測210nm下的吸光度或45℃下的折射率來測定發(fā)酵液中所產(chǎn)生的全部黏康酸(包括順，順-黏康酸和順,反-黏康酸以及其它生化中間體)。柱子是bioradaminexhpx-87h，以8mm硫酸作為流動相在0.6ml/min的流速下在50℃運行40分鐘。購買的標準物(sigma-aldrich)的色譜圖示于圖3。為準備用于hplc，將發(fā)酵樣品在0.05m磷酸鉀緩沖液(ph7.0)中稀釋10或100倍，以防止順，順-形式的黏康酸異構化為順，反-形式。

為分離黏康酸的異構體，將如上制備的樣品在第二hplc體系中運行。儀器是agilent1200hplc，柱子是agilenteclipsexdb-c18,4.6x150mm，以用磷酸調(diào)節(jié)至ph3.0的50mmkh2po4于30％甲醇中的流動相在30攝氏度運行。流速為1ml/min，持續(xù)4分鐘，進行278nm下的吸光度檢測。通過將順，順-黏康酸溶解于水中并允許其在室溫下經(jīng)歷約2小時的自發(fā)的酸催化的異構化來產(chǎn)生順，反-黏康酸標準物，直至hplc峰已經(jīng)完全移動至新位置。其它標準物購自sigma-aldrich。顯示標準物的色譜圖示于圖4中。

用于發(fā)酵方法的黏康酸生產(chǎn)培養(yǎng)基的組成：每升的發(fā)酵培養(yǎng)基含有50ml/l的1mkh2po4、10ml的200g/l檸檬酸+25g/l檸檬酸鐵、1.2ml的98％硫酸和一滴antifoam204。將這些組分與足量的水混合以允許有添加以下其它組分的空間。在高壓滅菌后，添加以下組分：10、20、30或40ml的50％葡萄糖(以得到5、10、15或20g/l終濃度)、2ml的1mmgso4、1ml的0.1mcacl2、10ml的1000x痕量元素(jantama等人,2008a)、1、2、4或8ml的50g/l苯丙氨酸+50g/l酪氨酸+50g/l色氨酸(以得到0.5、0.1、0.2或0.4g/l終濃度)、10ml的1g/l對羥基苯甲酸+1g/l對氨基苯甲酸+1g/l2,3-二羥基苯甲酸和必要時的1ml的150mg/ml氨芐青霉素(鈉鹽)和/或1ml的100mg/ml壯觀霉素hcl。

對于補料分批發(fā)酵，給料瓶含有600g/l的無水葡萄糖和32ml/l的50g/l苯丙氨酸+50g/l酪氨酸+50g/l色氨酸。9mnh4oh用作堿以維持發(fā)酵培養(yǎng)基的ph。

對于搖瓶，用nbs鹽(jantama等人2008a)加0.2mmops緩沖液(ph7.4)替代如上所述的高壓滅菌前的混合物，但葡萄糖和其它添加物相同。

補料分批發(fā)酵在7lnewbrunswickscientific發(fā)酵罐中進行，ph、do、溫度、葡萄糖和進料速度通過dcu控制器或biocommand軟件來加以控制。溫度維持在37℃，ph通過9n氨水維持在7.0，溶解氧(do)維持在30％空氣飽和同時將葉輪速度從750rpm升高至1200rpm。期望的培養(yǎng)基中的初始葡萄糖濃度為約5至25g/l。當葡萄糖濃度降至低于5g/l時，將葡萄糖溶液添加至發(fā)酵罐中，并通過溶解氧水平來控制葡萄糖的進料速度?？偘l(fā)酵時間為48小時，最終滴度為16g/l的黏康酸。

表達黏康酸通路基因的質(zhì)粒的構建：將dhs轉(zhuǎn)化成黏康酸所需的三種異源基因單獨或組合克隆到低拷貝質(zhì)粒pcl1921中(lerner和inouye,1990)。pcl1921的dna序列在表3seqidno.20中給出。簡言之，catax、aroy和aroz類似物或同源物的編碼序列經(jīng)密碼子優(yōu)化用于在大腸桿菌中表達并商業(yè)合成(geneart,invitrogen)。然后利用攜帶獨特的核糖體結合位點的正向引物和攜帶各基因獨特的終止子序列的反向引物將這些序列經(jīng)pcr擴增。將所得的pcr片段經(jīng)限制性酶消化并通過標準分子克隆方法克隆到獨特的組成型啟動子序列的下游。通過從之前描述過的來源dna序列進行pcr擴增(美國專利申請20090191610；美國專利7244593)，之后是限制性消化和標準分子克隆，來克隆啟動子序列。啟動子-rbs-編碼序列-終止子序列在一起組成表達盒。接著將單獨的表達盒組合以產(chǎn)生表達一個、兩個或所有三個黏康酸通路基因的質(zhì)粒。

實施例1

增加arog和arof的表達

大腸桿菌的tyrr基因可通過數(shù)種熟知方法中的任一種來突變，例如化學或輻射誘變和篩選(例如通過pcr和dna測序)或選擇類似物抗性(例如，對4-氟酪氨酸的抗性)、轉(zhuǎn)座子誘變、細菌噬菌體mu誘變或轉(zhuǎn)化。在優(yōu)選的實施方案中，tyrr基因中的突變是無效突變(導致沒有可檢測的活性的突變)，而在更優(yōu)選的實施方案中，至少部分tyrr基因缺失。這可以通過例如利用使用線性dna分子的兩步轉(zhuǎn)化法(jantama等人,2008a；jantama等人,2008b)來實現(xiàn)。在第一步中，通過雙重組和選擇氯霉素抗性將cam^r、sacb盒在tyrr基因座處整合以取代大部分的或所有的tyrr開放閱讀框。在第二步中，通過雙重組、在豐富營養(yǎng)基如lb中選擇對5％蔗糖的抗性將包括缺失型的tyrr基因的線性dna整合。通過診斷性聚合酶鏈式反應(pcr)來鑒定和確定正確的缺失。將tyrr缺失的目的是增加arog和arof的表達。實現(xiàn)相似結果的可選方法是用強組成型啟動子取代arog和/或arof之前的原生啟動子和(如果必要的話)，添加轉(zhuǎn)錄終止子。關于總體如何實現(xiàn)的更多細節(jié)在以下實施例4中給出。

以上描述的用于克服tyrr蛋白對arog和arof活性的抑制的兩種途徑中后者是優(yōu)選的，因為tyrr缺失會引起不希望的基因如arolm的過表達(neidhardt和curtiss,1996)。關于總體如何實現(xiàn)的更多細節(jié)在以下實施例4中給出。

實施例2

反饋抗性的arog和arof

導致反饋抗性的arog酶(3-脫氧-d-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶或dahps)的arog基因中的突變是領域內(nèi)已知的(shumilin等人,1999；kikuchi等人,1997；shumilin等人,2002)。還已知的是產(chǎn)生、鑒定和表征這些突變的方法(ger等人,1994,hu等人,2003)。優(yōu)選的突變是引起對苯丙氨酸抑制完全抗性的突變?？梢酝ㄟ^數(shù)種已知方法中的任一種將任何已知的已公開的反饋抗性突變引入到染色體中或質(zhì)粒上所包含的arog基因中，其中一個方法實例是誘變pcr，其中期望的突變作為pcr引發(fā)寡核苷酸的部分被合成(hu等人,2003)。通過dna測序來證實突變的正確置入。來自大腸桿菌c的野生型arog基因的序列在seqidno.18中給出。優(yōu)選的突變是將arog的氨基酸150從脯氨酸變成亮氨酸的點突變，例如通過將密碼子150從cca變成cta(hu等人,2003)。在更優(yōu)選的實施方案中，密碼子150從cca變成ctg，其是大腸桿菌中的優(yōu)選密碼子。該特別的arog等位基因是優(yōu)選的，因為所編碼的dahp合酶對高達3mm的苯丙氨酸抑制完全抵抗，并且其具有與野生型酶相似的比活(hu等人,2003)。

可以通過誘變和選擇對一種或多種苯丙氨酸類似物(如β-2-噻吩丙氨酸、p-氟代苯丙氨酸、p-氯代苯丙氨酸、o-氟代苯丙氨酸和o-氯代苯丙氨酸)的抗性、接著證明導致抗性的突變與arog基因關聯(lián)，來得到另外的反饋抗性arog等位基因(ger等人,1994；us專利4,681,852)。與arog的關聯(lián)可以通過dna測序或苯丙氨酸存在和不存在情況下的酶測定來直接證明(ger等人,1994)，或通過噬菌體介導的轉(zhuǎn)導和對arog基因座處或其附近的可供陽性或陰性選擇的遺傳標記物的選擇而間接證明(us專利4,681,852)。這樣的遺傳標記物可以是arog基因自身中的缺失或點突變，或者是任何合適的緊密關聯(lián)的基因(如大腸桿菌情況下的nada)中的突變。例如，在大腸桿菌中，在誘變和選擇苯丙氨酸類似物抗性后，單個突變體或突變體集合可被用作供體用于經(jīng)p1介導轉(zhuǎn)導至缺失所有三種dahp合酶基因arog、arof和aroh的原生受體中，并選擇在合適的基本培養(yǎng)基上的生長。然后轉(zhuǎn)導子將富集(一個或多個)期望的基因中的突變。備選地，在誘變和選擇類似物抗性后，單個突變體或突變體集合可被用作供體用于經(jīng)p1介導轉(zhuǎn)導至包含nada基因中的無效突變的原生受體菌株中，再次選擇在缺乏煙酰胺的基本培養(yǎng)基上的生長。另一方法是在這樣的菌株背景中選擇抗性突變體，所述菌株背景在arog基因附近(如在nada基因中)含有轉(zhuǎn)座子(如tn10)插入。從類似物抗性突變體p1轉(zhuǎn)導到不包含所述轉(zhuǎn)座子的菌株背景中和選擇四環(huán)素或其它合適的抗生素抗性將富集期望的arog突變。在所有這些方法中，反饋抗性最終通過酶測定和對基因的dna測序而得以證實。我們將對反饋抑制具有抗性的arog的等位基因稱為arog*。

菌株wm191(δtyrr，δarof)衍生自ymc9(atcc33927)。利用兩步基因取代法(jantama等人,2008a)置入tyrr和arof的完全缺失(cleandeletion)，以得到菌株wm191。接著，從cag12147(cgsc7351,coligeneticstockcenter,yaleuniversity)轉(zhuǎn)導入nada::tn10等位基因，以得到菌株wm189(δtyrr,δarof,nada::tn10)。在lb+四環(huán)素hcl(15mg/l)上進行選擇。菌株ry890(δtyrr::kan,arof363)通過p1轉(zhuǎn)導以三步從mm294(atcc33625)得到。供體菌依次為jw1316-1(cgsc9179,coligeneticstockcenter,yaleuniversity)、nk6024(cgsc6178,coligeneticstockcenter,yaleuniversity)和ab3257(cgsc3257,coligeneticstockcenter,yaleuniversity)，并且三次選擇依次為lb+硫酸卡那霉素(50mg/l)、lb+鹽酸四環(huán)素(15mg/l)和nbs最低限葡萄糖(jantama等人,2008a)及硫胺素hcl(5mg/l)。

用uv光對wm189誘變至約20％存活，并鋪板于含有o-氟代苯丙氨酸(1mm)、硫胺素(5mg/l)和煙酰胺(1mm)的nbs最低限葡萄糖培養(yǎng)基中(jantama等人,2008a)。將從數(shù)個板各自得到的菌落收集到單獨的池中，并在各個池上制備p1vir溶菌物。使用這些溶菌物在lb培養(yǎng)基上將wm191轉(zhuǎn)導成四環(huán)素抗性(15mg/l)，并將得到的菌落復制鋪板到含有1mmo-氟代苯丙氨酸、硫胺素(5mg/l)和煙酰胺(1mm)的nbs最低限葡萄糖培養(yǎng)基上。假定在四環(huán)素和類似物上均存活的菌落復制物在arog中含有反饋抗性突變。從5個獨立的池中選擇八個單獨的菌落用于dna測序。通過聚合酶鏈式反應將arog編碼區(qū)擴增并測序。示于圖4的結果顯示，八個菌株各自在其arog基因中包含點突變。一些等位基因與已公開的等位基因相同，但一些是新的。

使用來自以上描述的池之一的p1vir溶菌物將ry890(其具有arog野生型等位基因)轉(zhuǎn)導成四環(huán)素抗性并通過如上所述的復制鋪板轉(zhuǎn)導成對o-氟代苯丙氨酸(0.3mm)抗性。挑取四個克隆，命名為ry893、ry897、ry899和ry901，用于dna測序(表4)，再次地，兩個等位基因與已公開的等位基因相同，但兩個是新的。與后四個菌株同基因但卻含有野生型arog基因的菌株ry890通過從cag12147轉(zhuǎn)導被構建為對照。這五株菌在搖瓶中在25mlnbs最低限葡萄糖(15g/l)+硫胺素hcl(5mg/l)和煙酰胺(1mm)中過夜生長。所得的細胞通過離心收集，重懸以用10ml水漂洗，再離心，并重懸于0.5ml的50mm磷酸鉀(ph7.0)中。重懸的細胞通過與三滴氯仿一起渦旋而裂解，并使用與文獻中所描述的方法類似的方法測定粗溶菌物的dahp合酶活性(hu等人,2003)，有以下改動。磷酸鹽緩沖液是50mm(終濃度)，ph7.0，最終的赤蘚糖-4-磷酸濃度為2mm，最終的磷酸烯醇丙酮酸濃度為5mm，孵育溫度為30℃，反應在10分鐘時終止。我們將1mu定義為每分鐘每毫克蛋白產(chǎn)生1nmdahp的活性。為測試反饋抗性，在有或沒有終濃度18mm的苯丙氨酸的存在下對各個粗溶菌物進行測定。測定結果示于表5。酶顯示出不同的比活和對苯丙氨酸的抗性，但所有選擇的進行測試的突變體形式顯著比野生型對照具有更高抗性。

將來自如上所述的ry893、ry899、ry901和ry902的arog等位基因按如下引入黏康酸生產(chǎn)菌株背景中。將來自arog*和arogwt供體菌株的p1vir溶菌物用于將myr219(大腸桿菌c,δaroe,δack::p15-arob,pmg37)轉(zhuǎn)導成四環(huán)素hcl抗性(15mg/l)，以分別得到新菌株ry903、ry909、ry911和ry912。然后使用jw1316-1的p1vir溶菌物以引入δtyrr::kan等位基因，將這些菌各自轉(zhuǎn)導成硫酸卡那霉素抗性(50mg/l)，，分別得到菌株ry913、ry919、ry921和ry922。始終維持壯觀霉素選擇以維持黏康酸質(zhì)粒。所得的四株菌在37℃在搖瓶中在含有20g/l葡萄糖、0.2mmops緩沖液(ph7.4)、煙酰胺(1mm)、苯丙氨酸(100mg/l)、酪氨酸(100mg/l)、色氨酸(100mg/l)、對羥基苯甲酸(1mg/l)、對氨基苯甲酸(1mg/l)、2,3-二羥基苯甲酸(1mg/l)、酚紅(10mg/l)和硫酸銨(1g/l)的補充物的nbs基本培養(yǎng)基(jantama等人,2008a)中生長48小時。通過針對ph7.0標準物目視酚紅顏色估計，通過按要求對搖瓶人工添加1ml的1.0mkoh等分物，將ph保持在接近7。產(chǎn)生的黏康酸如上所述通過hplc進行檢測，結果顯示在表6中。所有三株含有反饋抗性的arog*等位基因的菌株較之含有野生型arog等位基因的同基因菌株產(chǎn)生更多的黏康酸。在本文公開的單獨實驗中，在多拷貝質(zhì)粒pcp32amp上含有arog的菌株myr205在搖瓶中產(chǎn)生1.5g/l黏康酸。因此，發(fā)明人已經(jīng)顯示，較之含有同基因的arog質(zhì)粒的菌株，δtyrr和單拷貝染色體arog*的組合可以表現(xiàn)良好地在搖瓶中產(chǎn)生黏康酸。染色體等位基因相較于質(zhì)粒等位基因的固有的優(yōu)異遺傳穩(wěn)定性，加之減弱了對于為了維持質(zhì)粒的選擇性培養(yǎng)基的需求，使得本文描述的新菌株更加適合于大規(guī)模商業(yè)發(fā)酵。而且，不需要化學誘導物用于黏康酸通路基因的表達。因此，上述的本發(fā)明菌株較之全部在不理想的多拷貝質(zhì)粒上包含用于過表達dahp合酶的基因的現(xiàn)有技術(niu等人,2002)而言有改進。

按與以上針對arog描述內(nèi)容相似的方式，可以在質(zhì)粒上或在染色體中置入產(chǎn)生抵抗由酪氨酸的反饋抑制的arof或aroh同工酶的突變。優(yōu)選的突變是將arof的氨基酸148從脯氨酸變?yōu)榱涟彼岬狞c突變，例如通過將密碼子148從ccg變?yōu)閏tg(weaver等人,1990)，得到命名為arof*的基因?？梢园磁c以上針對arog*等位基因描述內(nèi)容類似的方式通過對酪氨酸類似物(例如o-氟代酪氨酸、m-氟代酪氨酸、p-氟代苯丙氨酸等)的抗性來分離其它arof*等位基因?？梢酝ㄟ^與轉(zhuǎn)座子或卡那霉素抗性插入物關聯(lián)而選擇、富集以及轉(zhuǎn)導arof*等位基因，例如，在諸如jw2584(cgsc10051,coligeneticstockcenter,yaleuniversity)的菌株中在緊密連接的δyfir::kan中。

實施例3

從染色體dna缺失aroe和黏康酸生產(chǎn)

在該實施例中研究了過表達多拷貝質(zhì)粒上的arob和arog以及表達在黏康酸通路中有功能的蛋白的編碼基因的作用。在編碼莽草酸脫氫酶的aroe基因中含有缺失的菌株myr34被用作這些研究中的親本菌株。以與上述實施例1中所描述內(nèi)容相似的方式完成aroe的染色體拷貝的缺失。當用過表達編碼在莽草酸通路中有功能的dahp合酶蛋白的arog基因的質(zhì)粒pcp32amp轉(zhuǎn)化myr34時，dhs的積累有顯著提高。當用從組成型啟動子表達arob基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化myr34時，沒有注意到dhs積累的顯著提高。然而，當用表達arob和arog基因二者的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株myr34時，相比使用僅轉(zhuǎn)化有arog的myr34時所觀察的情況，dhs的積累有增加，因此表明arob是dhs生產(chǎn)中的第二瓶頸(圖5)。

在圖6呈現(xiàn)的實驗中，檢視了整合到宿主染色體dna中的arob基因的額外的拷貝的效果。在衍生自myr34的大腸桿菌菌株myr170中，將處于p15啟動子控制下的arob基因的額外拷貝在ack基因座處整合到宿主染色體中。當用pcp32amp質(zhì)粒轉(zhuǎn)化myr170菌株時，與用相同質(zhì)粒轉(zhuǎn)化myr34菌株時所檢測到的dhs積累相比，dhs積累有輕微的增加。myr170中dhs積累的輕微增加可以歸因于整合到宿主染色體dna中的arob基因的額外拷貝。當用表達arob和arog基因二者的pcp54轉(zhuǎn)化myr170菌株時，dhs積累有進一步的增加，意味著arob是dhs生產(chǎn)中的第二瓶頸。

圖7提供了使用大腸桿菌菌株myr34和myr170的黏康酸生產(chǎn)結果。在建立了在aroe缺失菌株myr34和myr170中在arob和arog基因的過表達下有dhs積累后，工作致力于觀察編碼在黏康酸生產(chǎn)通路中有功能的蛋白的“黏康酸通路”基因的表達是否會導致dhs轉(zhuǎn)變成順，順-黏康酸。在這些實驗中，單獨用質(zhì)粒pmg37或用質(zhì)粒pmg37和pcp32amp二者轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株myr34和myr170。質(zhì)粒pmg37表達編碼在黏康酸通路中有功能的蛋白的aroz、aroy和catax基因。當用質(zhì)粒pmg37和pcp32amp二者轉(zhuǎn)化這些細菌菌株時，與僅用pmg37質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的這兩種菌株中的黏康酸產(chǎn)量相比，myr34和myr170二者中的黏康酸產(chǎn)量增加，這提示在這些菌株中，arob表達是順，順-黏康酸生產(chǎn)的瓶頸。

實施例4

tkta的過表達

由tkta編碼的轉(zhuǎn)酮醇酶是戊糖磷酸通路中的關鍵酶，并被認為對于黏康酸生產(chǎn)中的關鍵中間體之一——赤蘚糖-4-磷酸的生產(chǎn)是限制性的。已知通過將基因及其原生啟動子置于多拷貝質(zhì)粒上來過表達編碼轉(zhuǎn)酮醇酶的tkta(sprenger等人,1995,1995a)能提高進入芳族通路中的流量(draths等人,1992)。然而，這樣的質(zhì)粒不穩(wěn)定，并且往往需要抗生素選擇以維持。現(xiàn)有技術中的另一方法是向宿主菌株的染色體中添加tkta基因的一個額外拷貝(niu等人,1992)。然而，tkta的一個額外拷貝及其原生啟動子并不足以用赤蘚糖-4-磷酸飽和芳族通路，因為其原生啟動子并非完全接近于理想。這樣，該方法需要實質(zhì)的改進。

可以例如，通過用強組成型啟動子例如來自枯草芽孢桿菌噬菌體spo1的p15或p26啟動子(分別為seqidno.1和seqidno.2)，或來自細菌噬菌體λ的pr啟動子(seqidno.3)來替代染色體中的原生tkta啟動子，來獲得改進的tkta過表達。這通過如實施例1中描述的兩步而實現(xiàn)，不同在于在第一步驟中使用cam^r,sacb盒來取代原生染色體tkta啟動子。在第二步中，通過轉(zhuǎn)化線性dna并進行蔗糖抗性選擇而置入強組成型啟動子，所述線性dna包含強組成型啟動子，其側翼是在強組成型啟動子下游側的tkta編碼區(qū)5’端的至少50個堿基和在強組成型啟動子上游側的就在原生tkta啟動子上游的同源的至少50個堿基對。自這樣的表達盒的改進的表達還通過增加從表達盒轉(zhuǎn)錄的mrna的穩(wěn)定性而實現(xiàn)。mrna穩(wěn)定性的提高通過在mrna的5’端、mrna的3’端或兩端增加莖環(huán)結構而實現(xiàn)。莖-環(huán)結構往往存在于mrna的末端，其由rho-非依賴性的轉(zhuǎn)錄終止子自然終止，但如果不是這樣，則可以通過遺傳工程的公知方法(連接、pcr等)向dna序列中添加rho-非依賴性的轉(zhuǎn)錄終止子。這樣的終止子可以由在各重復序列中的4至20個堿基的反向重復序列組成，所述反向重復序列由3個或更多個堿基的“環(huán)”隔開，后接富含t(脫氧胸苷)的一個或多個堿基的區(qū)域。反向重復序列富含g和c(脫氧鳥苷和脫氧胞苷)。類似地，可以通過就在轉(zhuǎn)錄起始點的下游但在核糖體結合位點之前插入含有如上所述的莖-環(huán)但沒有t-富集的區(qū)的dna序列，將莖-環(huán)構建到mrna的5’端中。對于此的實例結合p15啟動子(seqidno.1)給出。

在過表達tkta基因?qū)?jīng)由莽草酸通路的碳流的作用的分析中，大腸桿菌菌株myr170被用作親本菌株。myr170在編碼莽草酸脫氫酶的aroe基因中有缺失并在ack基因座處具有arob基因的額外拷貝。

在圖8、9和10所描繪的實驗中，使用兩種不同質(zhì)粒，即pcp32amp和pcp50。質(zhì)粒pcp32amp僅從其原生啟動子表達dahp合酶arog基因，質(zhì)粒pcp50從其原生啟動子表達轉(zhuǎn)酮醇酶基因tkta連同arog基因。用pcp32amp和pcp50質(zhì)粒單獨轉(zhuǎn)化具有aroe缺失和在染色體dna的ack基因座處整合的在p15啟動子控制下的arob基因的額外拷貝的myr170。如圖8所示，與僅表達arog基因的大腸桿菌細胞相比，arog基因連同tkta基因的表達使dhs積累進一步增加。

圖9提供了用質(zhì)粒pcp32amp或pcp50轉(zhuǎn)化的兩種不同菌株即myr34、myr170中的dhs產(chǎn)率的數(shù)據(jù)。具有aroe基因缺失的myr34菌株每消耗1克葡萄糖產(chǎn)生0.1克dhs。當用具有arog基因過表達的pcp32amp質(zhì)粒轉(zhuǎn)化myr34菌株時，該菌株中的dhs產(chǎn)率增至每消耗1克葡萄糖產(chǎn)生0.15克dhs。myr170具有在ack基因座處插入的arob基因的額外拷貝。由于存在arob基因的該額外拷貝，用pcp32amp轉(zhuǎn)化的myr170菌株中的dhs生產(chǎn)的產(chǎn)率稍高于用pcp32amp轉(zhuǎn)化的myr34菌株中所觀察到的dhs產(chǎn)率。因此，myr170中arob的額外拷貝的存在引起增加的經(jīng)由莽草酸通路的碳流。當用表達arog和tkta基因二者的質(zhì)粒pcp50轉(zhuǎn)化myr170菌株時，觀察到dhs產(chǎn)率的進一步提高。因此，tkta的額外拷貝的存在導致經(jīng)由莽草酸通路的碳流的增加。更具體而言，存在額外的arob和tkta基因的作用引起對dhs產(chǎn)率的累加效應。

圖10中描繪的實驗中所使用的myr261被改造為在poxb基因座處將tkta基因的額外拷貝整合到myr170的染色體dna中。myr261菌株中期望的基因取代(poxb::tkta)通過pcr驗證。用pcp32amp(arog過表達)質(zhì)?；騪cp50(arog和tkta過表達)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化myr261。作為對照，用pcp32amp質(zhì)粒轉(zhuǎn)化myr170。如圖10所示的結果所顯示的，與在用相同質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的myr170菌株中所觀察到的dhs生產(chǎn)的滴度相比，myr261的染色體dna中tkta基因的額外拷貝的存在增加了pcp32amp質(zhì)粒的dhs生產(chǎn)滴度。當用過表達轉(zhuǎn)酮醇酶的質(zhì)粒pcp50轉(zhuǎn)化菌株時，myr261中轉(zhuǎn)酮醇酶水平的進一步增加導致dhs生產(chǎn)滴度的進一步提高。由poxb編碼的酶poxb，或丙酮酸氧化酶，產(chǎn)生乙酸鹽作為反應產(chǎn)物。這樣，如本文描述的因tkta插入引起的poxb缺失去除了乙酸鹽生產(chǎn)的潛在活性通路。類似地，同時插入p15arob并刪除編碼acka或乙酸激酶的acka，如在以下實施例12中所描述的，去除了通向乙酸鹽的另一潛在活性通路。乙酸鹽產(chǎn)生在發(fā)酵中通常是不合人意的(jantama等人,2008b)。這樣，這些缺失可以用于減少乙酸鹽生產(chǎn)。

圖11提供了在用質(zhì)粒pcp32amp和pmg37轉(zhuǎn)化后大腸桿菌myr170、myr261和myr305菌株中的黏康酸和乙酸生產(chǎn)的滴度。通過從染色體dna中缺失poxb基因從myr170得到myr305，而myr261是myr170衍生菌，其中poxb基因已經(jīng)通過插入tkta基因的額外拷貝而失活。如上所述，質(zhì)粒pcp32amp表達編碼在莽草酸生物合成通路中起作用的dahp合酶蛋白的arog基因，導致由于大腸桿菌菌株myr170、myr261和myr305中aroe基因的缺失的dhs的積累。由于質(zhì)粒pmg37上黏康酸通路基因即aroz、aroy和catax的表達，dhs被轉(zhuǎn)化成順，順-黏康酸，如圖2所示。在myr261菌株中arob基因和tkta基因的額外拷貝的存在下，黏康酸生產(chǎn)稍有增加，伴隨著乙酸積累的降低。

實施例5

tala或talb的過表達

talb基因編碼大腸桿菌中主要的轉(zhuǎn)醛醇酶，但tala基因也編碼小部分的轉(zhuǎn)醛醇酶。已知轉(zhuǎn)醛醇酶的過表達提高進入芳族通路的流量(lu和liao,1997；sprenger,1995；sprenger等人,1995b)。在現(xiàn)有技術中，這是通過在多拷貝質(zhì)粒上從原生啟動子過表達tal基因(現(xiàn)在稱為talb基因)而實現(xiàn)的(lu等人,1997,sprenger等人,1995b)。然而，這樣的質(zhì)粒并不穩(wěn)定，并且需要抗生素篩選以維持。因此，需要有改進的方法?？梢岳缤ㄟ^用強組成型啟動子例如來自枯草芽孢桿菌噬菌體spo1的p15或p26啟動子(分別為seqidno.1和seqidno.2)，或來自細菌噬菌體λ的pr啟動子(seqidno.3)來替代染色體中的原生talb啟動子來獲得改進的talb表達。這通過如實施例1中描述的兩步而實現(xiàn)，不同在于在第一步驟中使用cam^r,sacb盒來取代原生染色體talb啟動子。在第二步中，通過用線性dna轉(zhuǎn)化并進行蔗糖抗性選擇而置入強組成型啟動子，所述線性dna包含強組成型啟動子，其側翼是在強組成型啟動子下游側的talb編碼區(qū)5’端的至少50個堿基和在強組成型啟動子上游側的就在原生talb啟動子上游的同源的至少50個堿基對。也可以通過相似方法來過表達tala基因，但優(yōu)選過表達talb基因，因為其編碼主要活性(sprenger,1995；sprenger等人,1995b)。對于有關設計為用于過表達的表達盒的構建的更多細節(jié)，參見實施例4。

實施例6

aroz、aroy和catax基因的表達

為證實大腸桿菌所產(chǎn)生的內(nèi)源性dhs轉(zhuǎn)化成黏康酸，將來自不動桿菌屬物種adp1的異源基因catax、來自肺炎克雷伯桿菌的aroy、和來自不動桿菌屬物種adp1的quic克隆到低拷貝質(zhì)粒pcl1921中強組成型啟動子(分別為p15、pr和p26)下(lerner和inouye,1990)，以生成“黏康酸質(zhì)?！眕mg37。攜帶空載體(pcl1921)或pmg37的myr34衍生菌在含有2％葡萄糖的搖瓶培養(yǎng)基(補充有芳族氨基酸和維生素的nbs基本培養(yǎng)基)中在37℃生長17小時。收集上清液并通過hplc分析。與顯示dhs積累的myr34/pcl1921成對比，myr34/pmg37顯示黏康酸的產(chǎn)生(圖12)。從后一菌株中沒有檢測到顯著量的dhs或中間體產(chǎn)物如pca和兒茶酚，提示從pmg37表達的異源基因是有功能并且足夠的。

實施例7

aroz同源物的比較

比較三種不同的aroz同源物和類似物(圖13)將dhs轉(zhuǎn)入黏康酸生產(chǎn)通路的能力。來自不動桿菌屬物種adp1的quic、來自蘇云金芽孢桿菌的asbf和來自粗糙脈孢菌的qa-4被報告為編碼具有aroz樣活性的蛋白(elsemore和ornston,1995；fox等人,1995；rutledge,1984)。這些基因各自經(jīng)密碼子優(yōu)化以用于在大腸桿菌中表達且通過geneart(invitrogen)合成，并克隆到還分別從p15和pr啟動子表達catax和aroy基因的低拷貝“黏康酸質(zhì)粒”中強組成型p26啟動子下。myr34/pcl1921、myr34/pmg37(以quic作為aroz的黏康酸質(zhì)粒)、myr34/pmg47(以asbf作為aroz的黏康酸質(zhì)粒)和myr34/pmg70(以asbf作為aroz的黏康酸質(zhì)粒)在具有含2％葡萄糖、芳族氨基酸和芳族維生素的基本培養(yǎng)基的搖瓶中在37℃生長48小時。收集上清液并通過hplc分析。如所預期的，轉(zhuǎn)化空載體的myr34積累dhs且不產(chǎn)生黏康酸。檢查的兩種aroz同源物和一種類似物在將dhs轉(zhuǎn)向黏康酸生產(chǎn)中是有功能的，但程度不同。表達quic基因的myr34衍生菌最為強烈，顯示近乎100％的dhs向黏康酸的轉(zhuǎn)化和微乎其微的dhs存留量。表達真菌aroz同源物qa-4的myr34衍生菌以約80％的dhs向黏康酸的轉(zhuǎn)化和20％的dhs存留緊接其后。最后，表達asbf基因的myr34衍生菌顯示僅50％的dhs向黏康酸的轉(zhuǎn)化和50％的dhs存留。匯總而言，在我們的搖瓶測定條件下，與其它aroz同源物相比，quic基因的表達和/或活性看起來是最高的。

實施例8

catax、aroy和quic的染色體整合

可以通過含有僅在adhe基因座處染色體整合的從組成型啟動子表達的cata-x、aroy和quic的單拷貝的菌株來生產(chǎn)黏康酸。

高dhs生產(chǎn)菌——myr170(δaroe,δack::p15-arob)，是用于在染色體中adhe基因座處整合黏康酸通路基因的宿主菌(seqidno.41)。對所得的菌株myr352轉(zhuǎn)化質(zhì)粒yep24(中拷貝，空載體)、pcp32amp(中拷貝，arog從原生啟動子表達)或pcp50(中拷貝，arog和tkta從其各自的原生啟動子表達)，以生成衍生菌株。后兩種質(zhì)粒用于增加dhs產(chǎn)量。菌株在37℃在如上所述的含2％葡萄糖的搖瓶培養(yǎng)基中生長72小時。在72小時收集上清液并通過hplc分析。如所預期的，與空載體對照相比，轉(zhuǎn)化有arog和arog/tkta的myr352衍生菌顯示出總產(chǎn)物形成的整體提高(圖14)。所有的myr352轉(zhuǎn)化子生產(chǎn)可測量滴度的黏康酸，首次證明黏康酸可以由僅含有整合的“黏康酸通路”基因的菌株生產(chǎn)且不需要補料基因表達的化學誘導物。

任何這些myr352衍生菌中產(chǎn)生的dhs并非全被轉(zhuǎn)化成終產(chǎn)物黏康酸。相反，有顯著量的兒茶酚積累(圖14)，提示當catax在染色體上從單拷貝表達時，其表達或活性是限制性的。由于主要的積累中間體是兒茶酚，可能在用于黏康酸合成的myr352菌株背景中quic和aroy基因表達和/或活性是充足的。

將myr352衍生菌與類似的myr219衍生菌平行比較。myr219菌株與myr170菌株相同，但含有表達黏康酸通路基因的低拷貝質(zhì)粒pmg37。因此，myr352與myr219菌株的主要區(qū)別涉及到黏康酸通路基因的劑量(分別為1個拷貝vs.約5個拷貝)。與myr352衍生菌相反，myr219衍生菌顯示出極少的兒茶酚或其它中間體的積累，并成功地生產(chǎn)終產(chǎn)物黏康酸。總的來說，這些結果表明需要提高菌株例如myr352中的catax活性。

實施例9

catax的表達

myr352菌株中兒茶酚的積累和不足的黏康酸生產(chǎn)是由于catax基因產(chǎn)物的有限劑量和/或活性。如上所述，myr352含有δaroe,δack::p15-arob和強組成型啟動子下的染色體整合的catax、aroy和quic基因的單拷貝。用中拷貝的空載體對照(yep24)或arog/tkta表達質(zhì)粒(pcp50)轉(zhuǎn)化該菌株以增加進入芳族氨基酸合成通路的碳流并生產(chǎn)大量的dhs。轉(zhuǎn)化的菌株在如上所述的補充有2％葡萄糖的搖瓶培養(yǎng)基中在37℃生長72小時，導致兒茶酚中間體的積累。該結果提示catax活性在myr352中可能不足。為驗證該假設，測試一種或多種從低拷貝質(zhì)粒表達的黏康酸通路基因減弱myr352/pcp50中兒茶酚積累的能力(圖15)。具體而言，還用低拷貝的空載體對照(pcl1921)或表達黏康酸生產(chǎn)通路的所有三種基因、兩種基因或一種基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化myr352/pcp50。在如上所述的搖瓶實驗中測定衍生菌。盡管單獨增加aroy(來自pmg27)或單獨增加quic(來自pmg39)的劑量并未減少兒茶酚積累，但所有的黏康酸通路基因(來自pmg37)的表達或catax和aroy(來自pmg33)共同的表達導致成功地將兒茶酚轉(zhuǎn)化成黏康酸。此外，單獨表達catax(來自pmg31)足以生產(chǎn)黏康酸和防止兒茶酚積累。

實施例10

構建滲漏aroe突變

在用于生產(chǎn)順，順-黏康酸的現(xiàn)有技術方法中，宿主菌株含有名為aroe353的aroe基因突變，其是無效突變。結果，該菌株需要補料從莽草酸通路制備的芳族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)和芳族維生素(對羥基苯甲酸、對氨基苯甲酸，和2,3-二羥基苯甲酸)。在商業(yè)上有吸引力的方法中補料芳族氨基酸太過昂貴。這樣，現(xiàn)有技術方法需要實質(zhì)的改進。這可以通過置入滲漏aroe基因(我們會將其稱為aroe*)而實現(xiàn)。滲漏突變通過首先產(chǎn)生使aroe編碼序列中的一個氨基酸改變引起無效表型的錯義突變而獲得。這可以通過任何形式的誘變和篩選對于以上列出的六種芳族化合物的同時營養(yǎng)缺陷型而實現(xiàn)。優(yōu)選方法是利用taqdna聚合酶，使用野生型大腸桿菌c基因組dna作為模板，并使用與aroe編碼區(qū)上游的約1000個堿基對和下游的1000個堿基對雜交的pcr寡核苷酸引物，通過易錯pcr誘變來產(chǎn)生突變體aroe基因池。所得的線性dna分子池用于轉(zhuǎn)化產(chǎn)生順，順-黏康酸并且含有已經(jīng)取代aroe編碼區(qū)的整合的cam^r,sacb盒(對于相關實例參見實施例4)的大腸桿菌c衍生菌，并進行蔗糖抗性選擇。然后對轉(zhuǎn)化子篩選已經(jīng)失去氯霉素抗性并且需要以上列出的六種芳族化合物的營養(yǎng)缺陷型。挑取數(shù)個獨立的營養(yǎng)缺陷型并通過在沒有六種芳族化合物的基本葡萄糖板上鋪板約10⁷、10⁸、或10⁹細胞(在基本葡萄糖培養(yǎng)基中漂洗)來測試可復原力(revertability)。挑取在板上產(chǎn)生菌落的復原體并進行順，順-黏康酸產(chǎn)生但沒有實質(zhì)性水平的芳族氨基酸產(chǎn)生的測試。在這些復原體中將有這樣的菌株，所述菌株攜帶aroe基因中的一個或多個突變，從而使aroe酶提供充足的芳族氨基酸和維生素用于生長、但又沒有這些芳族化合物的剩余。獲得滲漏aroe突變體的另一方法是向順，順-黏康酸生產(chǎn)菌中置入經(jīng)典的可回復的aroe突變體如aroe353和aroe24(均可從yaleuniversity的coligeneticstockcenter,newhaven,ct,usa得到)之一，并如上所述選擇復原體。

實施例11

通過易化擴散的葡萄糖輸入

芳族通路的第一個關鍵步驟中的底物之一是磷酸烯醇丙酮酸(pep)。pep也是用于通過細菌磷酸轉(zhuǎn)移酶體系(pts)輸入葡萄糖和一些其它糖類的磷酸鹽和能量的來源。因此，當細菌在pts-依賴性的糖上生長時，在pts和芳族通路之間存在對pep的競爭。這樣，可以通過刪除pts并提供可選的糖攝取通路來實現(xiàn)增加芳族通路流量的顯著改進。該問題的一個解決方案是用大腸桿菌galp通透酶，對于葡萄糖攝取起相當好作用的質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運蛋白(us專利6,692,794)取代pts。然而，質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運蛋白仍然耗用能量以維持驅(qū)動通透酶所必需的質(zhì)子梯度。這樣，對于方法的進一步改進存在需求。

一些糖，例如木糖，可以由從atp(三磷酸腺苷)的水解獲得能量的轉(zhuǎn)運蛋白運輸。再一次地，如果可以用需要較少能量的轉(zhuǎn)運蛋白來取代能量依賴性的轉(zhuǎn)運蛋白，那么可以獲得改進，因為atp中固有的能量得以保存用于其它有益用途。

可以通過利用在糖輸入中不耗用能量的易化擴散轉(zhuǎn)運蛋白來獲得顯著改進(parker等人,1995；snoep等人,1994)。例如，由glf基因編碼的來自運動發(fā)酵單孢菌(zymomonasmobilis)的葡萄糖易化蛋白可以用于代替或額外加至3-脫氫莽草酸鹽(dhs)生產(chǎn)菌株中的pts(yi等人,2003)。然而，這些菌株仍然至少部分依賴于galp進行葡萄糖輸入。由于galp需要質(zhì)子梯度形式的能量用于葡萄糖輸入，有需求提高黏康酸生產(chǎn)菌株的葡萄糖輸入效率。

用于glf加上葡糖激酶基因glk(也來自運動發(fā)酵單孢菌)的表達的盒可以與強組成型啟動子如p26組裝。然后可以將該盒在不妨礙期望的化合物(在這種情況下為順，順-黏康酸)的生產(chǎn)的位置處整合到宿主菌株的基因組中。大腸桿菌染色體中這樣的位置的實例是蘇氨酸降解操縱子，tdcabcdefg。如果生長培養(yǎng)基不含蘇氨酸，則不需要操縱子或該操縱子不表達，由此在該操縱子中插入表達盒不會妨礙代謝。

為實現(xiàn)上述的改進，利用與實施例1中所公開內(nèi)容相似的方法將一個或多個編碼pts功能的基因缺失。例如可以缺失ptsh、ptsi、crr或ptsg中的一個或多個。接著缺失galp。然后可以在兩步步驟中置入p26-glf,glk盒，與實施例1中所描述內(nèi)容相似。在第一步中，利用源自pac21(seqidno.15)的線性dna在tdc操縱子處整合cam^r,sacb盒，并進行氯霉素(30mg/l)抗性選擇。在第二步驟中，利用源自pac19(seqidno.15)的線性dna在tdc操縱子處整合p26-glf,glk盒，進行蔗糖抗性選擇并進行氯霉素敏感度篩選，在這種情況下是在基本葡萄糖培養(yǎng)基上的改進生長。

為測試葡萄糖的易化擴散是否能替代大腸桿菌中常規(guī)的葡萄糖輸入體系，從myr34(δaroe)中缺失ptshi基因和galp基因，然后利用源自pac19(seqidno.14)的線性dna在tdc操縱子處整合p26-glf,glk盒，得到菌株myr217。myr217在補充有所需的三種芳族氨基酸和三種芳族維生素樣化合物的基本葡萄糖培養(yǎng)基上生長相當好(圖16)。然而，含有ptshi和galp缺失但不含有glf,glk盒的菌株myr31并未顯示出任何可測量的生長(圖16)。因此，易化擴散足以取代我們的菌株背景中的兩種常規(guī)葡萄糖輸入體系。

為測試易化擴散是否可用于生產(chǎn)源自芳族通路的化合物，用pcp54(arog,arob)和pcp55(arog,arob,tkta)轉(zhuǎn)化myr34和myr217。對這兩種菌株比較搖瓶中芳族中間體3-脫氫莽草酸鹽(dhs)的生產(chǎn)(圖17)。在pcp54或pcp55的情況下，利用易化擴散的菌株產(chǎn)生與利用常規(guī)葡萄糖輸入體系的菌株相比同樣多或更多的dhs。dhs生產(chǎn)是經(jīng)改造的大腸桿菌菌株中黏康酸生產(chǎn)的良好代表，因此我們可以得出結論，葡萄糖的易化擴散對于黏康酸生產(chǎn)是有用的改進。

實施例12

arob基因的過表達

據(jù)報道arob基因的表達對于順，順-黏康酸生產(chǎn)是限速性的(niu等人,2002)。在現(xiàn)有技術中，據(jù)稱這是通過整合arob基因的第二拷貝與其原生啟動子而解決的。然而，這并不足以緩解arob限制，因為arob基因的原生啟動子和核糖體結合位點還遠不夠理想。這樣，該方法需要實質(zhì)的改進。

可以例如通過用強組成型啟動子例如來自枯草芽孢桿菌噬菌體spo1的p15或p26啟動子(分別為seqidno.1和seqidno.2)，或來自細菌噬菌體λ的pr啟動子(seqidno.3)來替代染色體中的原生arob啟動子來獲得改進的arob過表達。這通過如實施例4中描述的兩步而實現(xiàn)，不同在于在第一步驟中使用cam^r,sacb盒來取代原生染色體arob啟動子和/或核糖體結合位點。在第二步中，通過用線性dna轉(zhuǎn)化并進行蔗糖抗性選擇而置入強組成型啟動子，所述線性dna包含強組成型啟動子，后接核糖體結合位點和在強組成型啟動子的下游側的自arob編碼序列5’端的至少50個堿基(包括atg起始密碼子)，以及在強組成型啟動子上游側的就在原生arob啟動子上游的同源的至少50個堿基對。除了置入更強啟動子外或代替置入更強啟動子，利用相似方法，可以在arob的atg翻譯起始密碼子上游的約4至10個堿基對處置入更強的核糖體結合位點例如aggagg。這樣的合成盒例如p15-arob盒的拷貝可以在不同于原生arob基因座的基因座處例如在ack基因座處整合到染色體中。如實施例4中同時缺失ack基因并缺失poxb基因可幫助減少發(fā)酵過程中不希望的乙酸鹽形成。

實施例13

降低經(jīng)由戊糖磷酸通路的氧化分支的流量

芳族通路中第一關鍵步驟所需的赤蘚糖-4-磷酸來源于戊糖磷酸通路(ppp)的非氧化部分。存在兩種不同的通路可讓碳進入ppp。第一種是從葡萄糖-6-磷酸通過酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(由zwf基因編碼)、6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶(由pgl基因編碼)和6-磷酸葡糖酸脫氫酶(由gnd基因編碼)，得到核酮糖-5-磷酸。在這三個步驟的最后，一個碳作為co2損失。這種進入ppp的通路稱為ppp的氧化分支。核酮糖-5-磷酸然后通過異構酶、差向異構酶、轉(zhuǎn)酮醇酶和轉(zhuǎn)醛醇酶的作用被轉(zhuǎn)化成多種其它糖磷酸鹽。這組起始于核酮糖-5-磷酸的可逆反應被稱為ppp的非氧化分支。第二種碳進入ppp的通路是通過果糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸(二者都來自embden-myerhoff通路，也稱為糖酵解)，它們可經(jīng)轉(zhuǎn)醛醇酶和轉(zhuǎn)酮醇酶組合和重排而得到多種其它糖磷酸鹽，其中之一是赤蘚糖-4-磷酸。如果碳是通過該第二途徑進入ppp，則沒有co2損失。為了提高自葡萄糖的順，順-黏康酸產(chǎn)率，通過阻斷ppp的氧化分支從而使所有進入ppp的碳必須經(jīng)歷自果糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸的非氧化途徑，可以防止co2損失。利用與實施例1所公開的用于缺失tyrr基因的內(nèi)容相似的兩步法，通過缺失zwf基因來完成ppp氧化分支的阻斷。

實施例14

增加通向芳族通路和經(jīng)由pep通向芳族通路的流量

理想的是確保pep不是順，順-黏康酸通路上的限速中間體。這是例如，通過增加丙酮酸通過酶pep合成酶向pep的再循環(huán)而實現(xiàn)的，這是通過如以上在其它實施例中所描述的整合pps基因的過表達盒而實現(xiàn)的。另一方法是限制丙酮酸激酶的pep消耗，丙酮酸激酶在大腸桿菌中由pyka和pykf基因編碼。在這種情況下，方法是降低(一種或多種)酶的活性。這是通過缺失一種或多種編碼丙酮酸激酶的基因(如實施例1中對于tyrr所描述的)，或降低這些基因中的一種或多種的表達強度，如通過突變啟動子、核糖體結合位點或編碼序列從而使丙酮酸激酶活性的水平降低而實現(xiàn)的。例如，大腸桿菌pyka基因之前的rbs是5’cggagtattacatg。atg翻譯起始密碼子加下劃線。該序列可以突變成cagagtattacatg、caaagtattacatg、caatgtattacatg、caatatattacatg等等，從而通過一次一個堿基變化使rbs序列變得與aggagg的共有rbs更加不同。然后將各個突變的形式引入到染色體中pyka基因座處，取代野生型，并測量黏康酸生產(chǎn)水平的改進。

實施例15

賦予蔗糖上的生長

源自大腸桿菌c的菌株不能以蔗糖作為唯一碳源生長。然而，如pct專利申請pct/us11/064598中(在此整體地并入本文以作參考)所公開的，它們可經(jīng)基因改造而如此生長。這樣，可以改造順，順-黏康酸生產(chǎn)菌株使其在蔗糖上生長，如以上提及的申請中所公開的那樣。

實施例16

改進的順，順-黏康酸生產(chǎn)者

可以通過一個接一個地安置特征將實施例1-15中所描述的所有特征組合到一株大腸桿菌菌株中。所得的菌株包含改進的順，順-黏康酸生產(chǎn)者。隨后可通過在與第一拷貝的位置隔開的位置，一次一個地整合各個上述過表達盒的第二拷貝，對所得菌株進行再進一步的改進。方便且安全的位置的實例是在就在rrff(其編碼核糖體rna)的終止子下游的bsrb1限制性位點。期望的盒作為平端線性dna連接到質(zhì)粒pmh17f(seqidno.17)中唯一的bsrb1位點。實例是catax表達盒連接以得到名為pcatax的質(zhì)粒。平行地，cam^r,sacb盒作為平端片段連接到pmh17f中以得到pmh28f(seqidno.19)。使用通過pcr或通過限制性酶切從pmh28得到的線性dna在rrff位點處保存cam^r,sacb盒。接著，利用在蔗糖上選擇，使用通過pcr或通過限制性酶切從pcatax得到的線性dna在rrff基因座處安置catax盒的第二拷貝。然后將所得的菌株與祖代親本菌株比較順，順-黏康酸生產(chǎn)，以確定catax是限制性步驟。通過相似的方法，對來自實施例2-15的各個盒測試限速步驟。如果發(fā)現(xiàn)步驟是限速性的，則在染色體的另外其它合適位置處整合相關盒的一個或多個額外的拷貝，引起順，順-黏康酸生產(chǎn)的更進一步改善，而不需要質(zhì)?；蚩烧T導的啟動子。

實施例17

通過發(fā)酵生產(chǎn)順，順-黏康酸

可以通過以上實施例1-15中所公開的經(jīng)基因改造的微生物來生產(chǎn)順，順-黏康酸。生長培養(yǎng)基可以廣泛地不同，并且可以是任何支持微生物充分生長的培養(yǎng)基。優(yōu)選的培養(yǎng)基是含有礦物鹽和非芳族碳源例如葡萄糖、木糖、乳糖、甘油、乙酸、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、麥芽糖或蔗糖的基本培養(yǎng)基(關于優(yōu)選基本生長培養(yǎng)基的實例參見上文)。對于經(jīng)改造的微生物和生長培養(yǎng)基的各個組合，通過常規(guī)實驗來確定生產(chǎn)順，順-黏康酸的合適條件，在所述常規(guī)實驗中，發(fā)酵參數(shù)系統(tǒng)性地變化，例如溫度、ph、通氣速率和用于維持ph的化合物。隨著順，順-黏康酸產(chǎn)生，必須向發(fā)酵罐中補料一種或多種化合物以防止ph變得太低。用來中和酸的優(yōu)選化合物包括堿性鹽，如銨、鈉、鉀、鈣、鎂的氧化物、氫氧化物、碳酸鹽和碳酸氫鹽，或者兩種或更多種的這類堿鹽的組合。

大腸桿菌myr428菌株在7升發(fā)酵罐中的黏康酸生產(chǎn)示于圖18。對具有基因型δaroeδacka::p15-arobδpoxb::tkta的大腸桿菌myr261菌株轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pcp32amp和pmg37以產(chǎn)生myr428。myr428在如上所述的7升發(fā)酵罐中以葡萄糖補料生長48小時。最終黏康酸滴度為16g/l(參見圖18)。

在發(fā)酵完成后，通過絮凝、離心和/或過濾來移除細胞，然后通過一個或多個后續(xù)步驟例如沉淀、結晶、電滲析、層析(離子交換型、疏水親和性、和/或基于尺寸的)、微濾、納濾、反滲透和蒸發(fā)的組合從澄清發(fā)酵液中純化順，順-黏康酸。

本發(fā)明公開了如下實施方案：

1.從非芳族碳源開始生產(chǎn)順，順-黏康酸的經(jīng)基因改造的微生物，其中將所有編碼在黏康酸通路中起作用的蛋白質(zhì)的基因整合到所述微生物的染色體dna中。

2.實施方案1的經(jīng)基因改造的微生物，其中所述編碼在黏康酸通路中起作用的蛋白質(zhì)的基因選自由aroz、qa-4、asbf、quic、aroy、和catax組成的組。

3.實施方案1的經(jīng)基因改造的微生物生物體，其包含編碼不動桿菌屬(acinetobacter)細菌的quic酶或所述quic酶的同源物的基因。

4.實施方案1的經(jīng)基因改造的微生物，其包含一種或多種編碼在莽草酸通路中起作用的蛋白質(zhì)的外源基因。

5.實施方案4的經(jīng)基因改造的微生物，其中將所述編碼在莽草酸通路中起作用的蛋白質(zhì)的外源基因中的一種或多種整合到所述生物體的染色體dna中。

6.實施方案4的經(jīng)基因改造的微生物，其中所述編碼在莽草酸通路中起作用的蛋白質(zhì)的外源基因選自由arob、arod、arof、arog、aroh、tkta、talb、rpe和rpi組成的組。

7.實施方案4的經(jīng)基因改造的生物體，其中所述編碼在黏康酸通路或莽草酸通路中起作用的蛋白質(zhì)的基因無一從需要補料化學品用于誘導的啟動子表達。

8.實施方案1的經(jīng)基因改造的宿主細菌，其中芳族氨基酸生物合成的負調(diào)節(jié)蛋白的活性實質(zhì)上降低或消除。

9.實施方案8的經(jīng)基因改造的微生物，其中芳族氨基酸生物合成的負調(diào)節(jié)蛋白是tyrr蛋白或tyrr蛋白的同源物。

10.實施方案8的經(jīng)基因改造的微生物，其中編碼芳族氨基酸生物合成的負調(diào)節(jié)蛋白的基因已被突變。

11.實施方案1的經(jīng)基因改造的生物體，其包含編碼滲漏aroe酶的aroe基因。

12.實施方案1的經(jīng)基因改造的微生物生物體，其中至少一種在莽草酸通路中有活性的酶實質(zhì)上抵抗所述微生物的代謝物的抑制。

13.實施方案12的經(jīng)基因改造的生物體，其包含arog*基因，所述arog*基因編碼實質(zhì)上抵抗苯丙氨酸抑制的dahp合酶。

14.實施方案12的經(jīng)基因改造的生物體，其包含編碼dahp合酶的arog*基因，所述arog*基因選自由arog*20-893、arog*20-897、arog*20-899、arog*20-901、arog*111、arog*211、arog*212、arog*311、arog*312、arog*411、arog*412和arog*511組成的組。

15.實施方案1的經(jīng)基因改造的微生物，其中所述微生物是細菌。

16.實施方案1的經(jīng)基因改造的微生物，其中所述微生物衍生自大腸桿菌(escherichiacoli)c。

17.經(jīng)基因改造的細菌，其在pep依賴性磷酸轉(zhuǎn)移酶體系中有缺陷、在用于葡萄糖輸入的基于galp蛋白的體系中有缺陷，且包含編碼功能性的葡萄糖易化擴散蛋白的外源基因。

18.如實施方案17中的經(jīng)基因改造的細菌，其中功能性的葡萄糖易化擴散蛋白是由glf基因編碼的glf蛋白。

19.如實施方案17中的經(jīng)基因改造的細菌，還包含編碼葡糖激酶的外源基因。

20.如實施方案17中的經(jīng)基因改造的細菌，還包含一種或多種外源基因，所述外源基因編碼在從非芳族碳源開始生產(chǎn)順，順-黏康酸的黏康酸通路中起作用的蛋白質(zhì)。

21.實施方案20的經(jīng)基因改造的細菌，其中所述編碼在黏康酸通路中起作用的蛋白質(zhì)的基因選自由aroz、qa-4、asbf、quic、aroy和catax組成的組。

22.如實施方案17中的經(jīng)基因改造的細菌，還包含一種或多種在染色體上整合的外源基因，所述外源基因編碼在莽草酸通路中起作用的蛋白質(zhì)。

23.如實施方案22中的經(jīng)基因改造的細菌，其中所述編碼在莽草酸通路中起作用的蛋白質(zhì)的外源基因選自由arob、arod、arof、arog、aroh、tkta、talb、rpe和rpi組成的組。

24.實施方案17的經(jīng)基因改造的細菌，其中芳族氨基酸生物合成的負調(diào)節(jié)蛋白的活性被實質(zhì)上降低或消除。

25.實施方案17的經(jīng)基因改造的細菌，其中芳族氨基酸生物合成的負調(diào)節(jié)蛋白是tyrr蛋白或tyrr蛋白的同源物。

26.實施方案17的經(jīng)基因改造的細菌，其中編碼芳族氨基酸生物合成的負調(diào)節(jié)蛋白的基因已被缺失或突變。

27.實施方案17的經(jīng)基因改造的細菌，其中至少一種在莽草酸通路中有活性的酶實質(zhì)上抵抗所述微生物的代謝物的抑制。

28.實施方案17的經(jīng)基因改造的細菌，其中所述微生物衍生自大腸桿菌c。

29.從非芳族碳源開始生產(chǎn)順，順-黏康酸的經(jīng)基因改造的微生物，其中編碼在黏康酸通路和莽草酸通路中起作用的蛋白質(zhì)的外源基因不從需要補料化學品用于誘導的啟動子表達。

30.如實施方案29中的經(jīng)基因改造的微生物，其中所述微生物是細菌。

31.如實施方案29中的經(jīng)基因改造的微生物，其中所述微生物是大腸桿菌。

32.從非芳族碳源開始產(chǎn)生順，順-黏康酸的經(jīng)基因改造的微生物，所述微生物包含編碼滲漏aroe酶的aroe基因。

33.如實施方案32中的經(jīng)基因改造的微生物，其中所述微生物是細菌。

34.如實施方案32中的經(jīng)基因改造的微生物，其中所述微生物是大腸桿菌。

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序列表

<110>麥蘭特公司

<120>從經(jīng)基因改造的微生物生產(chǎn)黏康酸

<130>mc2013-01pct

<150>us61/632,777

<151>2012-01-30

<160>41

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>195

<212>dna

<213>p15啟動子;

<400>1

gctattgacgacagctatggttcactgtccaccaaccaaaactgtgctcagtaccgccaa60

tatttctcccttgaggggtacaaagaggtgtccctagaagagatccacgctgtgtaaaaa120

ttttacaaaaaggtattgactttccctacagggtgtgtaataatttaattacaggcgggg180

gcaaccccgcctgtt195

<210>2

<211>164

<212>dna

<213>p26啟動子;

<400>2

gcctacctagcttccaagaaagatatcctaacagcacaagagcggaaagatgttttgttc60

tacatccagaacaacctctgctaaaattcctgaaaaattttgcaaaaagttgttgacttt120

atctacaaggtgtggtataataatcttaacaacagcaggacgct164

<210>3

<211>91

<212>dna

<213>pr啟動子;

<400>3

acgttaaatctatcaccgcaagggataaatatctaacaccgtgcgtgttgactattttac60

ctctggcggtgataatggttgcatgtacaag91

<210>4

<211>359

<212>prt

<213>由qa-4基因編碼的3-脫氫莽草酸脫水酶;

<400>4

metproserlysleualailesersermetserleuglyargcysphe

151015

alaglyhisserleuaspserlysleuaspalaalaglnargtyrgly

202530

tyrleuglyilegluleuphetyrgluaspleuvalaspvalalaglu

354045

hisleuserasngluargproserprogluglyprophevalgluala

505560

glnilealaalaalaarghisileleuglnmetcysglnalaarggly

65707580

leugluvalvalcysleuglnprophemethistyraspglyleuasn

859095

aspargalagluhisgluargargleuglulysleualaleutrpile

100105110

gluleualahisgluleuhisthraspileileglnileproalaasn

115120125

pheleuproalaasnglnvalseraspasnleuaspleuilevalser

130135140

aspleucyslysvalalaaspileglyalaglnalaleuproproile

145150155160

argphealatyrgluserleucystrpserthrargvalaspleutrp

165170175

gluargcystrpaspilevalglnargvalaspargproasnphegly

180185190

ilecysleuaspthrpheasnileleuglyargiletyralaasppro

195200205

thrserproserglyargthrproasnalalysglualavalarglys

210215220

serilealaasnleuvalserargvalaspvalserlysvalphetyr

225230235240

valglnvalvalaspalagluargleuserlysproleuleuprogly

245250255

hisprotyrtyrasnprogluglnproalaargmetsertrpserarg

260265270

asncysargleuphetyrglygluthrglutyrglyalatyrleupro

275280285

vallysgluvalalaargalaleuphehisglyileglypheglugly

290295300

trpvalserleugluleupheasnargargmetserglugluglypro

305310315320

gluvalproglugluleualametargglyalailesertrpalalys

325330335

leuvalglnaspleuargileprovalgluglyproleuvalthrmet

340345350

proargvalseralaserleu

355

<210>5

<211>2160

<212>dna

<213>來自粗糙脈孢菌的qa-4基因加周圍序列;

<400>5

gaattcgggaaatggaatcttacctgggaaccgaaatcacagtccgggtaggttatagag60

catatagtgaactgtcaaagttctagacctggaccagccacttggagtcgttgttttagt120

tatacctacattcactcactgttgactttcaatcatacttacttagacggagcaacgcgc180

cagaatccaaattgttgcatagttgcggtatcaccaagtggcttcccataatagtttgcc240

attcgatgagacagctaactggaagaccggtactcgcaggttgcacgattacacggaagg300

attcggtattccgtgtttcatctgtcaaagtccctttccatatgaatccgaggtactatg360

actggatctcgatacaagctggccagcgaggtgcctgccttgacaggctgtcaactgcgg420

gacggccggctaagtgtttaacacgcaagggtggaagatgtctcgtcccgtcatccaaga480

ccgtcaacattcgaggccatctgatcgttgaagagatgctaaatcttgtgaaacgctcat540

aggtcgcttaccttcggcccacccgttaatgctttattccgctgagcaaacttcggcttc600

catcccgcggttcaccgtttacatcacttatcgttgcggttattggccgattcttcgcaa660

accgaaacgatgacatcccgaatatctgcaatacaccgccacggccggcgtctttatcac720

acctcctatgggagacgaaagtgccttgatacccctagtcatttgaagattcaggatggg780

agacggctggccgcttgcggagttacgttcgagtcttggtcgcaggaacgcttgccgtat840

tgaatgagaccccgagaaggtcaaatcaaatcttggaagaccccaactgcttcctcattg900

ccttcactccccatatcaatggggcacatcctgtgactaccttggtgctttatttcctca960

ccatttggcgatacaagctcaaggacaccgaggtgatatacagttcttcaaggacactat1020

ctcacctcaatatcaagaaccagtctcatcatctcttatttctccaggatccccccacca1080

acaacatcggcttttttttttcccctattctcaagacccatcaagacgctcacttcgctg1140

agcctttcgccatgccgtcaaagctagccattagttccatgtccctagggcgctgctttg1200

ccggccactctctggacagcaagcttgatgccgctcaacgatacggctatcttggtatcg1260

agcttttttatgaggatctggtcgacgttgcagagcatttgtcgaacgagcgtccctctc1320

ccgaaggcccttttgtcgaagctcagatagccgccgctcgtcatattctccagatgtgtc1380

aagccagggggcttgaggtcgtctgcctccagcctttcatgcactacgacggccttaacg1440

acagggcagaacatgagcgtcgtctggagaagctagcactatggattgagctcgctcatg1500

agcttcacaccgacatcattcagatcccagccaacttcctccctgccaaccaagtcagtg1560

acaacctcgacctgattgtctcagatctttgcaaggtggccgatattggagctcaagctt1620

tgccccctatccgctttgcctacgagagtctttgctggagcacccgtgtcgacctctggg1680

agcgctgctgggacatcgtacaacgcgttgaccgccccaactttggcatttgccttgaca1740

ccttcaacatcctcggccgcatctatgccgaccctacatctcctagcggtaggacaccca1800

acgcaaaagaggcagtcaggaagtccatcgccaacttggtctcgcgcgtggatgtctcca1860

aagtcttctacgtccaggtggttgacgccgagaggctgagcaagccactactgcccggtc1920

acccgtattacaatccagagcagccggcgaggatgagctggtcgcgcaattgtagactgt1980

tctacggcgaaacagaatatggtgcgtatcttcccgtgaaggaggttgctcgagcccttt2040

tccacggcattggtttcgagggctgggtcagtttggagcttttcaaccgcagaatgtctg2100

aggagggacctgaagtgccggaggaacttgccatgagaggcgctatctcgtgggccaagt2160

<210>6

<211>348

<212>prt

<213>由qutc基因編碼的來自構巢曲霉的qutc;

<400>6

metproalaasnleulysileglyileprothrvalserleuserlys

151015

proglyleuhisserleuasphislysleuargseralaalahisgly

202530

phealaglyilegluleupheileaspaspleuserhisphealaser

354045

serserpheasnglyserleuthrglnalaalalystyrileserser

505560

leualalysglnleuasnleuthrpheilecysleuglnprophegly

65707580

phetyrgluglyleuvalaspthrasnglnserthrtyrleuleuthr

859095

glulysleuproleutrpphealailealaargileileglythrasp

100105110

leuileglnileproalaasnpheleuglnasnaspprovalthrgly

115120125

alaalaargthrserglyaspileargleuilevalseraspleugln

130135140

thrilealaaspileglyvallysglnglypheargphevaltyrglu

145150155160

alaleucystrpserthrhisvalaspthrtrpglualaalatrpasn

165170175

valvallysleuvalasparggluasnpheglyilecysleuaspser

180185190

pheasnthrargthrproleuproserleuglyargargargmetleu

195200205

serlysprotrpproserprotrpargargservalleuserserpro

210215220

valgluasntrpthrserglylysserserthrserserleusermet

225230235240

alaserglycysargargargtrpthrargserthrprophemettrp

245250255

argalaasnproargargmetsertrpserargasnalaargleuphe

260265270

procysgluglugluargglyglytyrleuprovalleugluileala

275280285

argalaphephegluileglyphegluglytrpvalserleugluleu

290295300

pheserargthrcysasnaspproaspvalasnthrvalglygluhis

305310315320

alaargargglymetaspargargargargvalvalalaalaleugly

325330335

leuaspvalgluvalproalaargasncysglucys

340345

<210>7

<211>3298

<212>dna

<213>來自構巢曲霉的qutc基因的加周圍序列;

<400>7

aagcttggtttcaagtgatgatatatagttatgaggatataatatgaaccgaaagacgat60

gtttcttgtgaatatttacgtgatagttgtctgtctaatatggtacagcagtagaacaac120

tacatacggtcactacttacagccctagtcattccctccctcgattgcctaccatttata180

cactttgaacatccacaggcttgcctccctccatactctccctaacagcttgaacaactc240

tgagcgccctcaccccatcttcaacgccacagccaactcctcgctcgccatcctcaccct300

ttccactaacaacatcaacaaaatatccccactgcgcatcaaacggcctcacatcagcat360

ccttcactgaaatctgctgcatcgccaactccgtattccagcctttctctttcccctgtc420

cacaagaaacatggtcatagctccagcgcgtcatatcaggcacactgagactcgctctgg480

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tctcgcccgttcctgtttcaaagttcaacggcgaaggcgtcgcgtcgcagatgagaaatg600

tgcctactatcccagacgcaaagcgcagcgtcacagcacagccttcctcggcggtatgtt660

ccgggttctggcgcatgcgctgcaggagtgtaccctccgcgtagaccctactgacgggcc720

caaacagaaactgcagcacgtcgatatcgtggataagattaatccccagcacgccgccct780

tcttcttatctgcgcgccaagaaccgagcggcggcgcgaagtaagaggccggcttcagaa840

gtgtccagaggccgttcactgcaacgacggtgccgagtgagtctgtctctaacaaagact900

ttgtggtttggatgtacggattgaagcggcggtggtggccgatctggatgttgatcttcg960

catccttgcctctcttctcatctttacatttctgttccttgacggtagcgaggaggtgct1020

cggccgactccagatcgtcactgatcggtttctcaaggaggatattgcggattccgttct1080

ccagcagctggagcgtgacgtccacgtgcgtgtgattgggcgtgctcacgatcgccgcgt1140

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gaacgccaaatgattctgcgaccgggattgcagagggtgaagggtcaacaaaagcgatca1260

gctgggttcgtgggtgtcgttgcacggattgtgcgtgacggggcccaataagtccggcac1320

cgacgatgacaatgaggatattcttgtccttttccttgctgcagggcaccattgtgcatg1380

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gaccggctacttgatgtaggacgacagtcgcgatctaccgagagcgtgagattcactgtg1500

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ggatgcatttgcggggtatggagtacagagtgcatacagctgtgtatatggagttcctta1620

cggagagggtgacctggtatggggagaacgggcaaaatgctcacccggcaacctctcaaa1680

gcgtttacccggtatactcctctgatatcaatatttccaatcagcacctatatcatcacg1740

acgctctcctgaggattccgtagctaaccgccctggatcctacattaataaataagccat1800

ttgctttttctgctgcgagtgtgattctcaatacgattacgtatcacatgcagattgcct1860

ttacttcagctgcatttgatcagccacagctctaagagcaaacataccctacctacctac1920

ctacttcgcctagggtacataatcaccgccatctcctcctcgatcagtcttcaactcaat1980

cagctcattcattctattcttaatataatatatacctttagatctccagcagagacccga2040

agagtcggcaattcaaaatgcccgcaaacctcaaaatcggtatcccaaccgtgtccctgt2100

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atggcctcatgcacgctgttgaacacgctgtacaacatcactgttgaagatgatacct3298

<210>8

<211>502

<212>prt

<213>來自肺炎克雷伯桿菌atcc25597的aroy;

<400>8

metthralaproileglnaspleuargaspalailealaleuleugln

151015

glnhisaspasnglntyrleugluthrasphisprovalaspproasn

202530

alagluleualaglyvaltyrarghisileglyalaglyglythrval

354045

lysargprothrargileglyproalametmetpheasnasnilelys

505560

glytyrprohisserargileleuvalglymethisalaserarggln

65707580

argalaalaleuleuleuglycysglualaserglnleualaleuglu

859095

valglylysalavallyslysprovalalaprovalvalvalproala

100105110

serseralaprocysglngluglnilepheleualaaspaspproasp

115120125

pheaspleuargthrleuleuproalahisthrasnthrproileasp

130135140

alaglyprophephecysleuglyleualaleualaseraspproval

145150155160

aspalaserleuthraspvalthrilehisargleucysvalglngly

165170175

argaspgluleusermetpheleualaalaglyarghisilegluval

180185190

pheargglnlysalaglualaalaglylysproleuproilethrile

195200205

asnmetglyleuaspproalailetyrileglyalacysphegluala

210215220

prothrthrpropheglytyrasngluleuglyvalalaglyalaleu

225230235240

argglnargprovalgluleuvalglnglyvalservalproglulys

245250255

alailealaargalagluilevalilegluglygluleuleuprogly

260265270

valargvalarggluaspglnhisthrasnserglyhisalametpro

275280285

glupheproglytyrcysglyglyalaasnproserleuprovalile

290295300

lysvallysalavalthrmetargasnasnalaileleuglnthrleu

305310315320

valglyproglyglugluhisthrthrleualaglyleuprothrglu

325330335

alaseriletrpasnalavalglualaalaileproglypheleugln

340345350

asnvaltyralahisthralaglyglyglylyspheleuglyileleu

355360365

glnvallyslysargglnproalaaspgluglyargglnglyglnala

370375380

alaleuleualaleualathrtyrsergluleulysasnileileleu

385390395400

valaspgluaspvalaspilepheaspseraspaspileleutrpala

405410415

metthrthrargmetglnglyaspvalserilethrthrileprogly

420425430

ileargglyhisglnleuaspproserglnthrproglutyrserpro

435440445

serileargglyasnglyilesercyslysthrilepheaspcysthr

450455460

valprotrpalaleulysserhisphegluargalaprophealaasp

465470475480

valaspproargprophealaproglutyrphealaargleuglulys

485490495

asnglnglyseralalys

500

<210>9

<211>5502

<212>dna

<213>肺炎克雷伯桿菌342的aroy基因加兩千堿基的周圍dna序列;

<400>9

gcgacgccgactgggcgatccgtgaactgctggcgcgtatgacccagcgtctgcagggct60

gtgaaaccatagaggatgtgattaaggtggcggagctgttcgcgccgaacatcgccccga120

cgatccccggtaaactgtatattctggataccgatccatggcagatgcgctgcgtggcgc180

agtggctgtcgcccgccggggagacgacgtcctttgctcccgacgactgctgggcgatac240

ggcggggactcagccatccgccggtgcagggtgagcccgatatcacctgctatcatctgc300

cggaggcgcacgccggccagtcgctctgcgtaccgctcatcgcccagggcgaagcgatcg360

gtctgctgagctttcagaacgtcaccgccagtgacgccccttcccgggcttacctggagc420

tgatggccgaagcgctggggctggcgctcgccaatcagcgtttacgcagcgccctgctgg480

aaaaagcgttgttcgattcgctgaccggcctgcgtaaccgccatcatcttgatgaagcgc540

tgcactcgcagatggcgctggcggtccatacccacaccccgctgagctgcctgatgatcg600

acatcgatcacttcaaagccatcaatgaccgctacggccatgaagccggggatctggtga660

ttaagagcgtcgcgaccattgtgcagcgcgcggtgcgcgatatcggcatggctttccgct720

acggcggcgaggagtttttagtgctgctccccgggattgacgaagccggggcgcaccagt780

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gcctgctgcgcgcagcggacgccgcgctgtaccgggcgaaagagctgggccgttcaagga960

ttgtcagctttggccgcctgaagacccgctaagcgggattattgctcagcggcattaagc1020

agcgagataactttccgcaccaccgccgaacggaaatggcggtggtaaaccatgctcagc1080

tcactctccgccagccgatcctgaagatcgatatacaccacgttatcaaggcgtaaggcc1140

ctcgccgagaccggcaccagcgccacccccaccccggcggagaccaggctaatcatcgag1200

gtgacatcgttaattcgctgcaccacctgcggcgtaaaacccgcgacgcgacaggcgtca1260

ataaatacctgctccagtccggtgccctgcggatcgtcaagcgagatccagttgtcagtg1320

cgcaacgaggccagattgagcgcccccacgcctgccagcggatgctgttgataaagcgcc1380

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ggcgcgcggatgatggcgatatccagacgcagatccagcagcgcttcgtagagcatttgc1500

acatccccctgcaccagcgacagctcaatccccggccagtcagcgcgcagctcgcgcagg1560

agccccggcagtttgctgtcatacatcgcactggagacatagcccagatgcaatcgcccc1620

tgctcgcctcgtgcggtgcgctgggcgtccaggaccgcctgatcggccatctccagcgcc1680

agccgcgtcttctgcaagaaggcctcgcccgcggcggtgagggtcaggcgccggttagcg1740

cgggagaagagcaccacgcccaggcgctgctcgagttgtttaatctgctggctgagggcg1800

ggctgggcgatatgtaaccgctctgccgcccgatgcatatgtagttcttcagcaacgacc1860

acaaaatggcgtaacgctcgcaaggacatggccggactccgcggagtaaattgataataa1920

aaatgttatcaataaagcatgaatgatgcaattgataaccattagcctgcgagcatactg1980

tgcgcatcgacacgctaaggagaacatcatgaccgcaccgattcaggatctgcgcgacgc2040

tatcgcgctgctgcaacagcatgacaatcagtacctcgaaaccgatcatccggttgaccc2100

taacgctgagctggccggcgtctatcgccacatcggcgcgggcggcaccgtgaagcgccc2160

cacgcgcatcggcccggcgatgatgtttaacaatattaagggctatccgcactcgcgcat2220

tctggtgggcatgcacgccagccgccagcgggccgcgctgctgctgggctgcgaagcctc2280

acagctggcgctggaggtaggcaaagcggtgaaaaaaccggtcgcgccggtggtcgttcc2340

ggccagcagcgccccctgtcaggaacaggtctttctggccgacgatccggattttgattt2400

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cttgtgcgtccagggccgggatgagctgtcgatgtttctcgccgctggccgccatatcga2580

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actcgatccggctatctatatcggcgcctgctttgaagcgccgaccacacgtttggctat2700

aacgaactgggcgtcgccggtgcgctgcgtcagcgtccggtagagctggtacagggcgtc2760

agcgtcccggagaaagccatcgctcgcgccgagatcgttatcgaaggggaactgctgccg2820

ggggtacgcgtcagagaagatcagcacacaacagcggccatgcgatgccggaatttcctg2880

gttactgcggcggcgccaatccgtcgctgccggtcattaaagtcaaagcggtgaccatgc2940

gaaacaatgcgattctgcagacgctggtagggccgggcgaagagcataccaccctcgccg3000

gattgccaacggaagccagtatctggaatgctgtcgaggctgctatcccgggctttttac3060

aaaatgtctacgcccacaccgcgggcggcggtaaattcctcgggatcctgcaggtgaaaa3120

aacgccagcccgccgacgaagggcgtcaggggcaggccgcgttgctggcgctggcgacct3180

attccgagctgaaaaatatcattctggtcgatgaagatgtcgatatctttgacagcgacg3240

atatcctgtgggccatgaccacccgcatgcagggggatgtcagcatcacgacgatcccag3300

gcattcgtggtcaccagctggatccttcccagaccccggcctacagcccgtcgatccgcg3360

gagagggtatcagttgcaagacgattttcgattgcacggtgccgtgggcgctaaaatcac3420

acttcgagcgcgcaccgtttgccgatgtcgatccgcgtccgtttgcgccggagtattttg3480

cccggctggaaaaaaaccacggtcagtaaaatcaggtgatagccgccggagcacggcggc3540

atcttccgggccagcatcacctgcagcgggtggctgacgcagggttagttgatcgcggcg3600

gagaggtcttttttcacctgctcacgctgctcgggggtcaacacctggctcacgtcgaag3660

tagtatttcacacgataataccgcacctgctggtccagctggccaaaggcggccagctgc3720

tgtttgaccttagcgtcatcccatttcccggagtgaataacgtctgccagggcaccatcc3780

tgatagccgctgatttaatctggcttacattgttttcgaatccctgacgcagcgcctgga3840

ttttggcgacctgctcttcactcagcttcaggtgctggacgaccggatcctgcgagacag3900

acggtatatcggcggaggtcgacgcctggctggctgccgtaaagcaggtggtcagcgcaa3960

tggcgagcagggtgttacgcaagcgagtattcacagtgaatgatccttcaaaaaagaaaa4020

tgagaggcgattatcactgcgctaataaagactatctgtaacaaagggttaatttaaaac4080

tggataaaaaaaggatggtaagaaacagaaatcagatcccgggtcagcagcacagaaaga4140

tatattcatccttccagtaacggccctgtccaatgatatccccggcggcgctgattaact4200

gtttttgcttttggtttcaatcccctcaacgatcacatggctggtcagggtatgaataga4260

ttgcaacagcccgggaaaagcggggtcgttttctttatcccagaagtaatctttatccac4320

tttgacgcaatcgaagcggaagcgctccagcagcgggaaggacgtcgtccgcggccaaaa4380

tcatccagccagaccgggcaaagcgccgccagcgtgctcagcgccgtcagctcacgtccg4440

gcgataaactcgtgaaagttctcatttatttccagagcaatgtgtttacaggagcgcagg4500

aaatcacagagatagcgatccgtcagaataaagtggcttaataaatcatcaatattcagc4560

gatatcggtttattatcgacccgggcgaaatcaaatacagaaagtaactcgatttgccga4620

ataaatagagcaagcttatcgcgttcggtaagcgtggagaaagaaaacgtcgacgcagag4680

gtggtattttgtgcgggtgctataatatctttagtaagcaactcccacgagtggtagctg4740

ccgtcatcgctaatagcgggctccagaacgaagcgataagaggtatttttcacgttttct4800

tcaaccatttaaaaaataccaaaaataagaaagggttaagcatgtcatatattttccgcc4860

aacaaaaatagtttaaagtgatcgataataatcattcgatagttaaaaactatcaagata4920

taatttattgatcggtaaattgaattaatataaattagccactgccgtaactccctctga4980

aaagtcaattaaaatattgtttcaaaccagccagttaccagagtattctgcgtaaagcct5040

ggtcgtctcacgctttgtgctgccaggtaaaaaaagagaggggtaataaaaatgaaaaat5100

acaagccgccagttttagtcatatcattatgccgaatatgaataacgctgcgctgaggcg5160

ccgcttcgcctggcatgccatgagtcctcaacaaaaaagtgtgactcagtcgacaaaacg5220

tcatattttcccgctatcctgcagcgaagaagagtgaagtggatgacaggcagtgaaaaa5280

aataaacgtgattccgctggggctgatgctattcatgctcatcgccagcgcatggctggg5340

ccctgcgccgcggcacaccggcagcatgcagtgcgtttggtttgacggggcaatggtgag5400

ctgcctgccgaagcaacgactgggcgaaggctcgccgcatcatttactggtcagacgata5460

aaccggtactcgccgggtggtgttgaacagattatcgctggc5502

<210>10

<211>4629

<212>dna

<213>來自貝氏不動桿菌adp1的cata基因的dna序列，包括410堿基的上游序列和兩個下游開放閱讀框;

<400>10

atctgctcgaccatagtaatgatcacattatgagctaaatttactttttaaaatttaaat60

atattatatatatttgaattttattgttttattttaatttttagcttagaagtttttatt120

aagatttatttttaaattagatgtcgaaaaaattagtataccaaaaaagcatgaaaacat180

actctcttaggaattggagtcgccatgagtttcagatacagttgatcagtatggaaggta240

tagaaacgactatcgaaataaataagtttgtggtgtgtgaagcaaggtaaagctcaaggc300

tgaggcaaaccaagcaaaggttaattgaaccgatatgcacaacacattcaacgatagcgt360

cgacagataagtttatcaaatgatgttttggcgatttcaaggagaaagccatggaagtta420

aaatattcaatactcaggatgtgcaagattttttacgtgttgcaagcggacttgagcaag480

aaggtggcaatccgcgtgtaaagcagatcatccatcgtgtgctttcagatttatataaag540

ccattgaagatttgaatatcacttcagatgaatactgggcaggtgtggcatatttaaatc600

agctaggtgccaatcaagaagctggtttactctcgccaggcttgggttttgaccattacc660

tcgatatgcgtatggatgccgaagatgccgcactaggtattgaaaatgcgacaccacgta720

ccattgaaggcccgctatacgtggcaggtgcgcctgaatcggtaggttatgcgcgcatgg780

atgacggaagtgatccaaatggtcataccctgattctacatggcacgatctttgatgcag840

atggaaaacctttacccaatgccaaagttgaaatctggcatgccaataccaaaggctttt900

attcacacttcgacccaacaggcgagcagcaggcgttcaatatgcgccgtagtattatta960

ccgatgaaaacggtcagtatcgcgttcgtaccattttgcctgcgggttatggttgcccac1020

cagaaggtccaacgcaacagttgctgaatcagttgggccgtcatggtaaccgccctgcgc1080

acattcactattttgtttctgccgatggacaccgcaaactaactacgcaaattaatgtgg1140

ctggcgatccgtacacctatgacgactttgcttatgcaacccgtgaaggcttggtggttg1200

atgcagtggaacacaccgatcctgaagccattaaggccaatgatgttgaaggcccattcg1260

ctgaaatggttttcgatctaaaattgacgcgtttggttgatggtgtagataaccaagttg1320

ttgatcgtccacgtctagcggtgtaatacaccaaaatggttcaaaattatcaggcgagtg1380

atcatgatcactggcctgtttttatttcagggaagggtggagacaattacgtggacaatc1440

aaatcattcaggaaaccgtagataaaattttaagcgtattgccgaatcaggctgggcaat1500

tggcacgcttggttcgtctgatgcagtttgcttgtgaccccaccattaccgtcattggta1560

aatataatcatggtaaaagccgactactcaatgagctgatcgggacagatattttttctg1620

ttgccgataaacgagagacgattcaactggccgaacataaacaagatcaggtgcgttggt1680

tggatgcacccggactcgatgcagatgttgcggcagtggatgatcgtcatgcttttgaag1740

cagtctggacacaggcagatattcgcctttttgtgcattcagtccgagaaggcgaactcg1800

atgcaactgagcatcatcttttacaacaacttattgaagatgcagaccatagccggcgcc1860

aaaccatactggtcttgacccagatagatcagataccggatcagacaattttaacccaga1920

ttaaaacctcaattgcacagcaggtacccaaactcgatatttgggctgtttcggccactc1980

gccaccgtcagggtattgaaaatggaaaaaccttgctgatcgaaaaaagtggaatcggcg2040

cgttacgacatacacttgagcaggcacttgctcaggttccatctgcacgaacgtatgaaa2100

agaatagattgctgtctgacttgcatcatcaacttaagcagttattactcgatcaaaaac2160

atgtacttcagcaactacaacagacacagcagcagcaattgcatgactttgatacaggac2220

tcatcaacatactcgataagattcgagtagatcttgagcccattgtaaatatagatggtc2280

aagaccaagcactcaatccagattcatttgccacgatgtttaaaaatacagcagccaagc2340

agcaacgtgccaaagtgcagattgcttactcacgtgcctgtatcgagatcaatagccatc2400

tcatacgtcacggtgtggtgggtttacccgcagagcaacaaaccacgataaaaagtattg2460

atacggtcattgttgcggtttttggaatttcagtgaaatttcgcgatcagctacgtgcat2520

tgttttataccgataccgaacgacaacgcttgcaaagagagtttcgattttattttgaaa2580

agtcagcaggccgaatgattttagctgccaagattgagcagacaatgcggcagcaagggt2640

gtattcaaaatgcaatgatggcgttgcaacagatggagagtgcagcatgaccagcggcgg2700

acacattcaattgtttatcgaacacacccggcagattgcgactgcccaaggggatataca2760

gttggcattgcaatcgatgcagcaatggcgcgaagcatttgctacagcattaaaacaaaa2820

tacctttgatttaacgggctggtcaccgcagacaaagatcgccaatcaactcaagcaatt2880

taaccataagcttacaacgcatgtatcgaattgggataccgaatggcatacttttagtgc2940

tgctcaatcggttgcagaagtatttcatgatcgggtgatgttgcttgtattcggtaagtt3000

taatgccggaaagagttcattgtgtaacttactggccgaatgctttcgttctcacgaaca3060

aaccgtgcaatattttcatgttcaaaatgaacagatattttataccgaatctcacttacg3120

cgaaggtgcaaccgagacgacagcgcaactacagggcgtatgtctgggtgaaaaacttat3180

tttgctagatacaccaggtttgcattctggtactcagaaaaatgcagcgctcacacaaaa3240

atttatcgacagtgcagatggtgtgctgtggctcagtagcgcaacttcaccgggtcaggt3300

gcaagagctagatgcactggggcgcgagttaaagcgtcataaacctttatttcctgttat3360

tacccgaagcgattttgtcgaagaagatgaaattgatggtgagctatgtacagtgctttg3420

caataaaaattcagaacaacgtgcgttgcaagagtctgatgtattgatgcgtgcgaaaga3480

aaaactgcacatatgcaagtggatgtgagtttattaaagccgcccgtgtccgtttcaact3540

caaatggcgcgtgaagcagatatgaacccacaagccatgaacgaggctggttttgagcga3600

ttatttgcagcacttttggctcttattgagcctgctttgcgctataagcagcgtaaacct3660

gccgaagtattgttgcattttttgcaagaacatatcattgaaggtttaaggttttacctg3720

caacccgatctagagcaaatacaacaggacctcaaacaggctcaagatgatttacgacag3780

ctacacaccgatttagccgaggcagtctggcgtagcgtattgcctgagctaccacaactt3840

cttgagcaacatgcaagtacacaaaatattgatgccgtagtgaacagtttgaacgagtgg3900

ataaacgtcgcattcgaacaacagcttgcaattcagcttgatgcttatggtttaaatttg3960

gattcgcttagcaagatcgaaaaaaccgaaaaaatgcagtatgaacgcattgcgggaatg4020

gtggtgcatgatggcttgtacacgactctcacgcagcagattcaacaagctgtcaaagct4080

tctacgagtgaattgattgatcagtgtcaggctcaacttgagcagtcaatcaaacatgtt4140

caaacactcgatgaaaccttcatcgattacagcgcagcactcgatcaactcagccaagcg4200

ctacgcattgaataaagagcagtaaatttttcagacatattttattcgatgagtggcctg4260

atatggtgcgttgcaaacacctcctgtacacaggcgagaattttaggaatgtaattactg4320

tggtccatatttcgcaccgcgagtgaaattgggctataggcatcatcatctaaaattgga4380

atataaagtagattcttcaccccaatatccatggcagacgccggtacgatgcagacgcct4440

tcacctgctgccaccaagccgagtgccagttgaatttctcgaatttcggtgagtttggat4500

ggtactaggcctagttcggtaaagagtgactgaataaaggtcgcaaaattgggcttttga4560

gagactgggtacagcagcatcggttcatcaataatttgagagagatgaacccctgttgct4620

gcaaactga4629

<210>11

<211>311

<212>prt

<213>來自貝氏不動桿菌adp1的cata;

<400>11

metgluvallysilepheasnthrglnaspvalglnasppheleuarg

151015

valalaserglyleugluglngluglyglyasnproargvallysgln

202530

ileilehisargvalleuseraspleutyrlysalailegluaspleu

354045

asnilethrseraspglutyrtrpalaglyvalalatyrleuasngln

505560

leuglyalaasnglnglualaglyleuleuserproglyleuglyphe

65707580

asphistyrleuaspmetargmetaspalagluaspalaalaleugly

859095

ilegluasnalathrproargthrilegluglyproleutyrvalala

100105110

glyalaprogluservalglytyralaargmetaspaspglyserasp

115120125

proasnglyhisthrleuileleuhisglythrilepheaspalaasp

130135140

glylysproleuproasnalalysvalgluiletrphisalaasnthr

145150155160

lysglyphetyrserhispheaspprothrglygluglnglnalaphe

165170175

asnmetargargserileilethraspgluasnglyglntyrargval

180185190

argthrileleuproalaglytyrglycysproprogluglyprothr

195200205

glnglnleuleuasnglnleuglyarghisglyasnargproalahis

210215220

ilehistyrphevalseralaaspglyhisarglysleuthrthrgln

225230235240

ileasnvalalaglyaspprotyrthrtyraspaspphealatyrala

245250255

thrarggluglyleuvalvalaspalavalgluhisthraspproglu

260265270

alailelysalaasnaspvalgluglyprophealaglumetvalphe

275280285

aspleulysleuthrargleuvalaspglyvalaspasnglnvalval

290295300

aspargproargleualaval

305310

<210>12

<211>1461

<212>dna

<213>來自不動桿菌屬物種adp1的quic;

<400>12

atgaaattaacttctttacgcgtatctttattggcgctgggcttggtaacatcaggtttt60

gctgcggcagaaacttatactgtagatcgttatcaggatgatagtgaaaaaggctctttg120

cgttgggcaattgaacaatctaatgcaaatagcgcacaagagaatcagattctgattcag180

gctgttggtaaggcaccttatgtgatcaaggtggataaaccgttaccaccgattaaatca240

tctgtaaaaattattggtacagaatgggataaaacgggcgaatttattgcgattgatggt300

tcaaactatatcaagggcgaaggcgaaaaagcatgtccaggtgcaaatccaggacaatat360

ggtaccaatgttcgtaccatgactttaccaggtttggttctacaagatgtcaatggtgtg420

accctgaaaggtcttgatgttcatcgcttctgtattggtgtactggtaaatcgttcaagc480

aataatttgattcagcataaccgtatttcaaataattacggtggcgctggtgtcatgatc540

acgggtgatgatggtaaaggtaacccaacgtctaccaccaccaataacaacaaagtattg600

gataatgtgtttattgacaatggcgatggtcttgaactgacgcgtggagcagcattcaac660

ctgattgctaacaatctgtttacatcgaccaaagccaatccagagccgtctcaaggcatt720

gaaattctttgggggaatgacaatgcagtggtgggtaacaaatttgaaaactattcagat780

ggtctacaaatcaactggggtaaacgtaattacatcgcttataacgaattgaccaataac840

tctttgggtttcaatcttacaggtgatggaaacatcttcgatagtaacaaagtgcatggc900

aatcgtattggtatcgcaattcgttctgaaaaagatgcaaatgcacgtatcacacttacc960

aaaaatcagatttgggataatggtaaagatatcaaacgctgtgaggctggtggttcatgt1020

gttccaaaccaacgtttaggtgcaattgtatttggtgttcctgcgcttgagcatgaaggt1080

tttgtaggctctcgtggtggcggtgtagtcattgaacctgcaaaattacaaaaaacatgt1140

acacagccaaatcaacaaaactgtaatgccattccgaaccaaggtattcaggcacctaaa1200

ctgactgtcagtaaaaaacaacttacagttgaagttaaaggaacaccaaaccagcgttac1260

aacgtagaattttttggaaatcgtaatgcatcttcttccgaagctgagcaatatttaggt1320

tcaattgttgtagtgacagatcatcaaggtcttgcaaaagcaaactgggcaccaaaagtc1380

agcatgccatctgttactgcgaatgtaactgatcacttgggcgccacttcagagttaagt1440

tctgcagtgaaaatgagataa1461

<210>13

<211>1461

<212>dna

<213>來自不動桿菌屬物種adp1的經(jīng)密碼子優(yōu)化的quic基因;

<400>13

atgaaactgaccagcctgcgtgttagcctgctggcactgggtctggttaccagcggtttt60

gcagcagcagaaacctataccgttgatcgttatcaggatgatagcgaaaaaggtagcctg120

cgttgggcaattgaacagagcaatgcaaatagcgcacaagaaaaccagattctgattcag180

gcagttggtaaagcaccgtatgttatcaaagttgataaaccgctgcctccgattaaaagc240

agcgttaaaatcattggcaccgagtgggataaaaccggtgaatttattgcaattgatggc300

agcaactatatcaaaggcgaaggtgaaaaagcatgtccgggtgcaaatccgggtcagtat360

ggcaccaatgttcgtaccatgaccctgcctggtctggttctgcaagatgttaatggtgtt420

accctgaaaggtctggatgttcatcgtttttgtattggtgttctggttaatcgcagcagc480

aataacctgattcagcataatcgtatcagcaacaattatggtggtgccggtgttatgatt540

accggtgatgatggtaaaggtaatccgaccagcaccaccaccaataataacaaagttctg600

gataacgtgttcatcgataatggtgatggtctggaactgacccgtggtgcagcatttaat660

ctgattgcaaataacctgtttaccagcacaaaagccaatccggaaccgagccagggtatt720

gaaattctgtggggtaatgataatgccgtggtgggtaacaaattcgaaaactattcagat780

ggcctgcaaatcaattggggtaaacgtaactatatcgcctataacgaactgaccaataac840

agcctgggtttcaatctgacaggtgatggtaacattttcgacagcaataaagtgcatggt900

aaccgtattggtattgccattcgtagtgaaaaagatgccaatgcacgtattaccctgacc960

aaaaatcagatttgggataacggcaaagatatcaaacgttgtgaagccggtggtagctgt1020

gttccgaatcagcgtctgggtgcaattgtttttggtgttccggcactggaacatgaaggt1080

tttgttggtagccgtggcggtggtgttgttattgaaccggcaaaactgcaaaaaacctgc1140

acccagccgaaccagcagaattgtaatgcaattcctaatcagggtattcaggcaccgaaa1200

ctgacagttagcaaaaaacagctgaccgttgaagttaaaggcacccctaatcagcgttat1260

aatgtggaattttttggcaatcgtaatgccagcagcagcgaagcagaacagtatctgggt1320

agcattgttgttgttaccgatcatcagggtctggcaaaagcaaattgggctccgaaagtt1380

agcatgccgagcgttaccgcaaatgtgacagatcatctgggtgcgaccagcgaactgagc1440

agcgcagttaaaatgcgttaa1461

<210>14

<211>486

<212>prt

<213>來自不動桿菌屬物種adp1的quic;

<400>14

metlysleuthrserleuargvalserleuleualaleuglyleuval

151015

thrserglyphealaalaalagluthrtyrthrvalaspargtyrgln

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<210>34

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<212>dna

<213>缺失的aroe區(qū)的序列;

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<212>dna

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<213>缺失的poxb區(qū)的序列;

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cggtcagccggaactgattttcatcgctaccggttcagaagttgaactggctgttgctgc2400

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gttggggacgacgtttacggagacgaccctaccgttaatgctctgcaggactacgccgca3060

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<212>dna

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tatttaagcaccgcattgtttgccgatctcttcactgagaaagaattgcaacagtaatgc120

cagcttgttaaaaatgcgtaaaaaagcacctttttaggtgcttttttgtggcctgcttca180

aactttcgcccctcctggcattgattcagcctgtcggaactggtatttaaccagactaat240

tattttgatgcgcgaaattaatcgttacaggaaaagccaaagctgaatcgattttatgat300

ttggttcaattcttcctttagcggcataatgtttaatgacgtacgaaacgtcagcggtca360

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aaactgaaatctctggtttccgacgacaagaaggataccggaactattgagatcattgct660

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gaaatcaaagaactgatcaaactgt1045

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<212>dna

<213>在缺失的tdc基因座處整合的glf-glk盒;

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aacatcgtatacaaactgttttaatccgtaactcaggatgagaaaagagatgaatgaatt840

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cagcgactgtgaagtattaatgtcaggtattgccgacggtattaactcggaaaatgcatt960

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tgcaaaagtggctgtgactgtaaaaagaaatcgaaaaagaccgttttgtgtgaaaacggt1140

ctttttgtttccttttaaccaactgccataactcgaggcctacctagcttccaagaaaga1200

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tcttaacaacagcaggacgctctagagggagaggaatcgccatgagttctgaaagtagtc1380

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