本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，尤其是涉及一種提高昆蟲細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定表達(dá)蛋白表達(dá)量的方法。
背景技術(shù)：
：：昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)已被用于包括組織因子和抗體等在內(nèi)的許多人類重組蛋白的表達(dá)(kost等，1997)。目前，昆蟲表達(dá)系統(tǒng)主要用于表達(dá)亞單位疫苗，除了獸用疫苗還用于生產(chǎn)部分人類疫苗以及重組病毒(maranga等，2002；ryan和walsh等，2012；yang等，2013；miller等，2012)。果蠅s2(drosophilaschneider2)細(xì)胞和草地貪夜蛾sf9(spodopterafrugiperda)細(xì)胞是常用于異源基因表達(dá)的昆蟲細(xì)胞，可通過構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞池的方法進(jìn)行重組蛋白表達(dá)。近年來昆蟲細(xì)胞已成功用于表達(dá)一些具有生物活性的受體蛋白、離子通道蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、激素和凝血因子等(millar等，1995；millar等1994；tota等1995；towers和sattelle等2002；mennella等，2005；winslow等，1989；change等，2005；zmora等，2007；vatandoost等，2012)。但穩(wěn)定細(xì)胞池每升的產(chǎn)量也只能達(dá)到幾毫克，且尚未有發(fā)現(xiàn)簡單可行的提高產(chǎn)量方法。瞬時轉(zhuǎn)染在哺乳動物中用于重組蛋白的快速表達(dá)的工藝已非常完善，近年來也逐漸應(yīng)用到昆蟲表達(dá)系統(tǒng)中(geisse等，2009；hopkins等，2012；loomis等，2005；shen等2013)。昆蟲細(xì)胞的瞬時轉(zhuǎn)染常用于構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞池之前對表達(dá)載體的檢驗(yàn)(vatandoost等，2012)。近年來，s2、sf9等細(xì)胞的瞬時轉(zhuǎn)染開始采用低成本的陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑，如聚乙烯亞胺，也可在短時間內(nèi)獲得重組蛋白，但其產(chǎn)量也亟待提高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：基于此，有必要提供一種提高昆蟲細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定表達(dá)蛋白表達(dá)量的方法。一種提高昆蟲細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定表達(dá)蛋白表達(dá)量的方法，包括如下步驟：配制轉(zhuǎn)染試劑溶液：將線性聚乙烯亞胺溶于ph3-10的無菌水中，配制成濃度為0.1-10g/ml的轉(zhuǎn)染試劑溶液；配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物：按照線性聚乙烯亞胺與待轉(zhuǎn)染的含目的dna的質(zhì)粒的質(zhì)量比為1-20:1的比例將所述轉(zhuǎn)染試劑溶液與待轉(zhuǎn)染的含目的dna的質(zhì)粒溶液加入無菌水中，震蕩混勻，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物；瞬時轉(zhuǎn)染：將所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入已傳代培養(yǎng)的果蠅s2細(xì)胞或草地貪夜蛾sf9細(xì)胞的細(xì)胞懸液中，搖晃培養(yǎng)，得到已轉(zhuǎn)染含目的dna的質(zhì)粒的昆蟲細(xì)胞，將所述昆蟲細(xì)胞于16-40℃、120-300rpm、2％-10％co2培養(yǎng)箱中搖晃培養(yǎng)，或者于16-40℃、120-300rpm培養(yǎng)箱中以密封蓋封住密封培養(yǎng)；穩(wěn)定細(xì)胞池蛋白表達(dá)：以所述瞬時轉(zhuǎn)染構(gòu)建的所述昆蟲細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞池，以1-8×106個昆蟲細(xì)胞/ml的密度接種后，于16-40℃、120-300rpm、2％-10％co2培養(yǎng)箱中搖晃培養(yǎng)，或者于16-40℃、120-300rpm培養(yǎng)箱中以密封蓋封住密封培養(yǎng)。在其中一個實(shí)施例中，昆蟲細(xì)胞或穩(wěn)定細(xì)胞池的培養(yǎng)溫度優(yōu)選20-32℃，更優(yōu)選25-29℃。在其中一個實(shí)施例中，所述線性聚乙烯亞胺的分子量范圍為2.5-40kd，優(yōu)選25kd。在其中一個實(shí)施例中，在所述配制轉(zhuǎn)染試劑溶液過程中，所述無菌水的ph為5.0-7.0，優(yōu)選ph為6.1。在其中一個實(shí)施例中，在所述配制轉(zhuǎn)染試劑溶液過程中，配制的轉(zhuǎn)染試劑溶液中線性聚乙烯亞胺的濃度為0.1-2g/ml，優(yōu)選1g/ml。在其中一個實(shí)施例中，在所述配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物過程中，對于果蠅s2細(xì)胞是按照線性聚乙烯亞胺與待轉(zhuǎn)染的含目的dna的質(zhì)粒的質(zhì)量比為2:1的比例配制；對于草地貪夜蛾sf9細(xì)胞是按照線性聚乙烯亞胺與待轉(zhuǎn)染的含目的dna的質(zhì)粒的質(zhì)量比為3:1的比例配制。在其中一個實(shí)施例中，在所述瞬時轉(zhuǎn)染過程中，將所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入已傳代培養(yǎng)的果蠅s2細(xì)胞或草地貪夜蛾sf9細(xì)胞的細(xì)胞懸液中是按照每106個細(xì)胞轉(zhuǎn)染0.1-3μg含目的dna的質(zhì)粒的比例添加。在其中一個實(shí)施例中，在所述瞬時轉(zhuǎn)染過程中，對于果蠅s2細(xì)胞是按照每106個果蠅s2細(xì)胞轉(zhuǎn)染0.6μg含目的dna的質(zhì)粒的比例添加，并于28℃、180rpm、5％co2培養(yǎng)箱中搖晃培養(yǎng)，或者于28℃、180rpm培養(yǎng)箱中以密封蓋封住密封培養(yǎng)，并在12-72小時，優(yōu)選48小時后更換為透氣蓋子；對于草地貪夜蛾sf9細(xì)胞是按照每106個草地貪夜蛾sf9細(xì)胞轉(zhuǎn)染1.5μg含目的dna的質(zhì)粒的比例添加，并于28℃、180rpm、5％co2培養(yǎng)箱中搖晃培養(yǎng)，或者于28℃、180rpm培養(yǎng)箱中以密封蓋封住密封培養(yǎng)，并在12-72小時，優(yōu)選48小時后更換為透氣蓋子。在其中一個實(shí)施例中，在果蠅s2細(xì)胞或草地貪夜蛾sf9細(xì)胞傳代培養(yǎng)時，傳代細(xì)胞的密度為0.1-2×106個細(xì)胞/ml，優(yōu)選1×106個細(xì)胞/ml。在其中一個實(shí)施例中，在所述瞬時轉(zhuǎn)染過程中，當(dāng)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞密度達(dá)到2-50×106個細(xì)胞/ml時，進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染，優(yōu)選是達(dá)到5×106個細(xì)胞/ml時，進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。在其中一個實(shí)施例中，在所述穩(wěn)定細(xì)胞池蛋白表達(dá)過程中，以4×106個昆蟲細(xì)胞/ml的密度接種，于28℃、180rpm、5％co2培養(yǎng)箱中搖晃培養(yǎng)，或者于28℃、180rpm培養(yǎng)箱中以密封蓋封住密封培養(yǎng)，并在12-72小時，優(yōu)選48小時后更換為透氣蓋子。傳統(tǒng)的在昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)時多采用的是磷酸鹽緩沖系統(tǒng)，不同于哺乳動物細(xì)胞的碳酸鹽緩沖體系，其培養(yǎng)過程中無需添加co2來調(diào)節(jié)緩沖體系的ph，然而，目的蛋白的表達(dá)量比較低。本發(fā)明創(chuàng)造性的發(fā)現(xiàn)在昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)時，無論是在瞬時轉(zhuǎn)染還是在穩(wěn)定細(xì)胞池的蛋白表達(dá)生產(chǎn)過程中，在培養(yǎng)箱中添加co2或通過轉(zhuǎn)染后將透氣蓋子換成密封蓋以通過昆蟲細(xì)胞自身呼吸作用增加瓶中co2濃度的方法都可以提高蛋白的表達(dá)量，并且提升效果顯著。并且通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，co2濃度對蛋白的表達(dá)量也是有一定影響的，co2濃度太低對蛋白表達(dá)量的提升幫助不大，但濃度過高也會影響蛋白的表達(dá)，因此，本發(fā)明選用濃度為2％-10％co2培養(yǎng)環(huán)境，或者在培養(yǎng)開始后就用密封蓋密封，一段時間后再打開或換用透氣蓋子，以保證培養(yǎng)環(huán)境中的co2的濃度滿足最大化促進(jìn)蛋白表達(dá)的要求。本發(fā)明的在昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)過程中在培養(yǎng)箱中添加co2或?qū)⑴囵B(yǎng)瓶蓋子換成密封蓋簡單易行，成本低，是可以廣泛使用的并可顯著提高昆蟲細(xì)胞蛋白表達(dá)量的方法。附圖說明圖1為本發(fā)明一實(shí)施方式的工藝流程圖。圖2為在sf9的瞬時轉(zhuǎn)染中，與對照組轉(zhuǎn)染后在不含co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)相比，轉(zhuǎn)染后在5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的egfp陽性細(xì)胞比例在轉(zhuǎn)染后1-5天都更高。圖3為在sf9的瞬時轉(zhuǎn)染中，與對照組轉(zhuǎn)染后在不含co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)相比，轉(zhuǎn)染后在5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的sf9細(xì)胞tnfr-fc蛋白的單位產(chǎn)量在轉(zhuǎn)染后1-5天都更高。圖4為在s2細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染中，在培養(yǎng)箱不添加co2的情況下，轉(zhuǎn)染后用密封蓋封住培養(yǎng)瓶可通過細(xì)胞自身的呼吸作用在培養(yǎng)瓶中積累更多co2，在轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)箱不添加co2的情況下，與對照組轉(zhuǎn)染后使用透氣蓋子相比，轉(zhuǎn)染后分別封閉蓋子至24h、48h、72h后再換成透氣蓋子，s2細(xì)胞的蛋白1單位產(chǎn)量都更高，其中封閉蓋子至48h的最高。圖5為在s2細(xì)胞穩(wěn)定細(xì)胞池的培養(yǎng)過程中，與對照組在不含co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)相比，在5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)和封閉蓋子培養(yǎng)s2細(xì)胞在第1天、3天、5天的蛋白1單位產(chǎn)量都更高，其中在第5天在5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的蛋白1單位產(chǎn)量顯著高于對照組和用密封蓋密封培養(yǎng)組。圖6為在s2細(xì)胞穩(wěn)定細(xì)胞池的培養(yǎng)過程中，與對照組在不含co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)相比，在5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)和用密封蓋密封培養(yǎng)s2細(xì)胞在第1天、3天、5天的蛋白2單位產(chǎn)量都更高。具體實(shí)施方式為了便于理解本發(fā)明，下面將參照相關(guān)附圖對本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述。附圖中給出了本發(fā)明的較佳實(shí)施例。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來實(shí)現(xiàn)，并不限于本文所描述的實(shí)施例。相反地，提供這些實(shí)施例的目的是使對本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。如圖1所示，一實(shí)施方式的提高昆蟲細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定表達(dá)蛋白表達(dá)量的方法，包括如下步驟：配制轉(zhuǎn)染試劑溶液：將線性聚乙烯亞胺溶于ph3-10的無菌水中，配制成濃度為0.1-10g/ml的轉(zhuǎn)染試劑溶液；配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物：按照線性聚乙烯亞胺與待轉(zhuǎn)染的含目的dna的質(zhì)粒的質(zhì)量比為1-20:1的比例將轉(zhuǎn)染試劑溶液與待轉(zhuǎn)染的含目的dna的質(zhì)粒溶液加入無菌水中，震蕩混勻，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物；瞬時轉(zhuǎn)染：將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入已傳代培養(yǎng)的果蠅s2細(xì)胞或草地貪夜蛾sf9細(xì)胞的細(xì)胞懸液中，搖晃培養(yǎng)，得到已轉(zhuǎn)染含目的dna的質(zhì)粒的昆蟲細(xì)胞，將昆蟲細(xì)胞于16-40℃、120-300rpm、2％-10％co2培養(yǎng)箱中搖晃培養(yǎng)，或者于16-40℃、120-300rpm培養(yǎng)箱中以密封蓋封住密封培養(yǎng)；穩(wěn)定細(xì)胞池蛋白表達(dá)：以瞬時轉(zhuǎn)染構(gòu)建的昆蟲細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞池，以1-8×106個昆蟲細(xì)胞/ml的密度接種后，于16-40℃、120-300rpm、2％-10％co2培養(yǎng)箱中搖晃培養(yǎng)，或者于16-40℃、120-300rpm培養(yǎng)箱中以密封蓋封住密封培養(yǎng)。在其中一個實(shí)施方式中，線性聚乙烯亞胺的分子量范圍為2.5-40kd，優(yōu)選25kd。在其中一個實(shí)施方式中，在配制轉(zhuǎn)染試劑溶液過程中，無菌水的ph為5.0-7.0，優(yōu)選ph為6.1。在其中一個實(shí)施方式中，在配制轉(zhuǎn)染試劑溶液過程中，配制的轉(zhuǎn)染試劑溶液中線性聚乙烯亞胺的濃度為0.1-2g/ml，優(yōu)選1g/ml。在其中一個實(shí)施方式中，在配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物過程中，對于果蠅s2細(xì)胞是按照線性聚乙烯亞胺與待轉(zhuǎn)染的含目的dna的質(zhì)粒的質(zhì)量比為2:1的比例配制；對于草地貪夜蛾sf9細(xì)胞是按照線性聚乙烯亞胺與待轉(zhuǎn)染的含目的dna的質(zhì)粒的質(zhì)量比為3:1的比例配制。在其中一個實(shí)施方式中，在瞬時轉(zhuǎn)染過程中，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入已傳代培養(yǎng)的果蠅s2細(xì)胞或草地貪夜蛾sf9細(xì)胞的細(xì)胞懸液中是按照每106個細(xì)胞轉(zhuǎn)染0.1-3μg含目的dna的質(zhì)粒的比例添加。在其中一個實(shí)施方式中，在瞬時轉(zhuǎn)染過程中，對于果蠅s2細(xì)胞是按照每106個果蠅s2細(xì)胞轉(zhuǎn)染0.6μg含目的dna的質(zhì)粒的比例添加，并于28℃、180rpm、5％co2培養(yǎng)箱中搖晃培養(yǎng)，或者于28℃、180rpm培養(yǎng)箱中以密封蓋封住密封培養(yǎng)，并在12-72小時，優(yōu)選48小時后更換為透氣蓋子；對于草地貪夜蛾sf9細(xì)胞是按照每106個草地貪夜蛾sf9細(xì)胞轉(zhuǎn)染1.5μg含目的dna的質(zhì)粒的比例添加，并于28℃、180rpm、5％co2培養(yǎng)箱中搖晃培養(yǎng)，或者于28℃、180rpm培養(yǎng)箱中以密封蓋封住密封培養(yǎng)，并在12-72小時，優(yōu)選48小時后更換為透氣蓋子。在其中一個實(shí)施方式中，在果蠅s2細(xì)胞或草地貪夜蛾sf9細(xì)胞傳代培養(yǎng)時，傳代細(xì)胞的密度為0.1-2×106個細(xì)胞/ml，優(yōu)選1×106個細(xì)胞/ml。在其中一個實(shí)施方式中，在瞬時轉(zhuǎn)染過程中，當(dāng)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞密度達(dá)到2-50×106個細(xì)胞/ml時，進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染，優(yōu)選是達(dá)到5×106個細(xì)胞/ml時，進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。在其中一個實(shí)施方式中，在穩(wěn)定細(xì)胞池蛋白表達(dá)過程中，以4×106個昆蟲細(xì)胞/ml的密度接種，于28℃、180rpm、5％co2培養(yǎng)箱中搖晃培養(yǎng)，或者于28℃、180rpm培養(yǎng)箱中以密封蓋封住密封培養(yǎng)，并在12-72小時，優(yōu)選48小時后更換為透氣蓋子。傳統(tǒng)的在昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)時多采用的是磷酸鹽緩沖系統(tǒng)，其培養(yǎng)過程中無需添加co2，目的蛋白的表達(dá)量比較低。本發(fā)明創(chuàng)造性的發(fā)現(xiàn)在昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)時，無論是在瞬時轉(zhuǎn)染還是在穩(wěn)定細(xì)胞池的蛋白表達(dá)生產(chǎn)過程中，在培養(yǎng)箱中添加co2或通過轉(zhuǎn)染后將透氣蓋子換成密封蓋以通過昆蟲細(xì)胞自身呼吸作用增加瓶中co2濃度的方法都可以提高蛋白的表達(dá)量，并且提升效果顯著。在昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)過程中在培養(yǎng)箱中添加co2或?qū)⑴囵B(yǎng)瓶蓋子換成密封蓋簡單易行，成本低，是可以廣泛使用的并可顯著提高昆蟲細(xì)胞蛋白表達(dá)量的方法。以下結(jié)合具體實(shí)施例對提高昆蟲細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定表達(dá)蛋白表達(dá)量的方法作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。以下實(shí)施例所用的濃度等數(shù)值均為優(yōu)選的數(shù)值，可理解，在其他實(shí)施例中，不限于此，如可以以前面所述的數(shù)據(jù)范圍中的任意數(shù)據(jù)。1.果蠅s2細(xì)胞來源及傳代果蠅s2細(xì)胞從tcmetrix公司(epalinges，瑞士)獲得，來自果蠅的drosophilaschneider2細(xì)胞系，并在sf900iisfm培養(yǎng)基中(lifetechnologies公司，巴塞爾，瑞士)進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。細(xì)胞在tubespin生物反應(yīng)器50(ts50)或在tubespin生物反應(yīng)器600(ts600)(tpp，trasadingen，瑞士)中培養(yǎng)，其各自培養(yǎng)基的量分別為5-10ml或300ml。細(xì)胞每周傳代2次，傳代細(xì)胞密度為1×106個細(xì)胞/ml。所有培養(yǎng)物在isf1-x振蕩培養(yǎng)器(kühnerag，birsfelden，瑞士)中保持在28℃溫度下，搖晃速度為180rpm，搖動直徑5cm。細(xì)胞密度和活性通過臺盼藍(lán)排除法使用血細(xì)胞計數(shù)器測定。2.草地貪夜蛾細(xì)胞sf9的來源及傳代sf9細(xì)胞購買至invitrogen公司(巴塞爾，瑞士)，并在sf900iisfm培養(yǎng)基中(lifetechnologies公司，巴塞爾，瑞士)進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。細(xì)胞在tubespin生物反應(yīng)器50(ts50)或在tubespin生物反應(yīng)器600(ts600)(tpp，trasadingen，瑞士)中培養(yǎng)，其各自培養(yǎng)基的量分別為5-10ml或300ml。細(xì)胞每周傳代2次，傳代細(xì)胞密度為1×106個細(xì)胞/ml。所有培養(yǎng)物在isf1-x振蕩培養(yǎng)器(kühnerag，birsfelden，瑞士)中保持在28℃溫度下，搖晃速度為180rpm，搖動直徑5cm。細(xì)胞密度和活性通過臺盼藍(lán)排除法使用血細(xì)胞計數(shù)器測定。3.瞬時轉(zhuǎn)染配置轉(zhuǎn)染試劑溶液：將分子量為25kd的線性聚乙烯亞胺(polyscienceseuropegmbh,eppelheim，germany)溶于ph6.1的無菌水中，配置成濃度為1mg/ml的轉(zhuǎn)染試劑溶液。在轉(zhuǎn)染兩天前將細(xì)胞離心后按照1×106個細(xì)胞/ml的密度傳代，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到5×106個細(xì)胞/ml時轉(zhuǎn)染。果蠅s2細(xì)胞按照每106個細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)量為0.6μg含目的dna的質(zhì)粒比例準(zhǔn)備質(zhì)粒，將聚乙烯亞胺與含目的dna的質(zhì)粒按照質(zhì)量比為2:1的比例加入無菌水中震蕩混勻，以形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。草地貪夜蛾sf9細(xì)胞按照每106個細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)量為1.5μg含目的dna的質(zhì)粒比例準(zhǔn)備質(zhì)粒，將聚乙烯亞胺與含目的dna的質(zhì)粒按照質(zhì)量比為3:1的比例加入無菌水中震蕩混勻，以形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。對于小規(guī)模轉(zhuǎn)染，將細(xì)胞離心并重懸于含培養(yǎng)基的ts50管中，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入培養(yǎng)基中。對于300ml的轉(zhuǎn)染，將細(xì)胞離心并重懸于含培養(yǎng)基的ts600管中，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入培養(yǎng)基中。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入已傳代培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞s2或sf9細(xì)胞懸液中，得到已轉(zhuǎn)染含目的dna的質(zhì)粒的細(xì)胞，于28℃、180rpm，5％co2培養(yǎng)箱中搖晃培養(yǎng)，或于轉(zhuǎn)染后在28℃、180rpm，無co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)但將瓶蓋換成不透氣密封蓋以增加瓶中co2含量，48h后換回透氣蓋子。4.穩(wěn)定細(xì)胞池生產(chǎn)穩(wěn)定細(xì)胞池的構(gòu)建方法可參考現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)(matascim,baldil,hackerdl,wurmfm.2011a.thepiggybactransposonenhancesthefrequencyofchostablecelllinegenerationandyieldsrecombinantlineswithsuperiorproductivityandstability.biotechnolbioeng108(9):2141-50)。構(gòu)建好的s2或sf9細(xì)胞穩(wěn)定細(xì)胞池以1-8×106個細(xì)胞/ml的密度接種后，，于28℃、180rpm，5％co2培養(yǎng)箱中搖晃培養(yǎng)，或于轉(zhuǎn)染后在28℃、180rpm，無co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)但將瓶蓋換成不透氣密封蓋以增加瓶中co2含量，48h后換回透氣蓋子。5.蛋白質(zhì)定量含目的dna的質(zhì)粒包括導(dǎo)入有egfp(綠色熒光蛋白)基因、tnfr-fc基因、蛋白1基因和蛋白2基因的質(zhì)粒，從而表達(dá)出egfp、tnfr-fc、蛋白1和蛋白2的蛋白。piex-xegfp、piex-tnfr-fc、piex-protein1和piex-protein2分別攜帶egfp基因、人tnfr-fc基因、蛋白1基因和蛋白2基因，并且受autographacalifornicamulticapsidnucleopolyhedrovirus(acmnpv)同源區(qū)5(hr5)增強(qiáng)子以及極早期基因1(ie1)啟動子的控制，質(zhì)粒的構(gòu)建參考申請?zhí)枮閏n201510708368.8的中國專利申請。egfp陽性細(xì)胞的百分比通過guavaeasycyte流式細(xì)胞儀(guavatechnologies,hayward,美國)測定。激發(fā)光和發(fā)射光分別為488nm和532nm。tnfr-fc、蛋白1和蛋白2的濃度通過elisa方法確定。分別使用羊抗人fcγ抗體、蛋白1鼠源抗體和蛋白2鼠源抗體進(jìn)行包被，并通過堿性磷酸酶共聚羊抗人iggγ鏈來檢測tnf-fc，堿性磷酸酶羊抗鼠抗體來檢測蛋白1和蛋白2。加入底物后，在405nm和490nm下用讀板器檢測吸收值。6.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2-圖6所示，圖2sf9的瞬時轉(zhuǎn)染中，與對照組轉(zhuǎn)染后在不含co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)相比，轉(zhuǎn)染后在5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的egfp陽性細(xì)胞比例在轉(zhuǎn)染后1-5天都更高。圖3在sf9的瞬時轉(zhuǎn)染中，與對照組轉(zhuǎn)染后在不含co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)相比，轉(zhuǎn)染后在5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的sf9細(xì)胞tnfr-fc蛋白的單位產(chǎn)量在轉(zhuǎn)染后1-5天都更高。圖4在s2細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染中，在培養(yǎng)箱不添加co2的情況下，轉(zhuǎn)染后用密封蓋封住培養(yǎng)瓶可通過細(xì)胞自身的呼吸作用在培養(yǎng)瓶中積累更多co2，在轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)箱不添加co2的情況下，與對照組轉(zhuǎn)染后使用透氣蓋子相比，轉(zhuǎn)染后分別封閉蓋子至24h、48h、72h后再換成透氣蓋子，s2細(xì)胞的蛋白1單位產(chǎn)量都更高，其中封閉蓋子至48h的最高。圖5在s2細(xì)胞穩(wěn)定細(xì)胞池的培養(yǎng)過程中，與對照組在不含co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)相比，在5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)和封閉蓋子培養(yǎng)s2細(xì)胞在第1天、3天、5天的蛋白1單位產(chǎn)量都更高，其中在第5天在5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的蛋白1單位產(chǎn)量顯著高于對照組和用密封蓋密封培養(yǎng)組。圖6在s2細(xì)胞穩(wěn)定細(xì)胞池的培養(yǎng)過程中，與對照組在不含co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)相比，在5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)和用密封蓋密封培養(yǎng)s2細(xì)胞在第1天、3天、5天的蛋白2單位產(chǎn)量都更高。本實(shí)施例研究發(fā)現(xiàn)在昆蟲細(xì)胞的瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定細(xì)胞池生產(chǎn)中，通過在培養(yǎng)箱中添加co2或通過封閉蓋子增加培養(yǎng)瓶中co2濃度的方法來提高蛋白產(chǎn)量，此操作方法簡單易行且效果顯著，可應(yīng)用于昆蟲細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定細(xì)胞池的蛋白生產(chǎn)中。以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實(shí)施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12