本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種動物細胞融合基礎培養(yǎng)基。

背景技術：

細胞培養(yǎng)技術始于20世紀初，是指從體內(nèi)組織取出細胞，在無菌、適當溫度及酸堿度和一定營養(yǎng)條件下，使其生長繁殖，并維持其結構和功能的一種培養(yǎng)技術。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，細胞培養(yǎng)技術現(xiàn)廣泛應用于生物、醫(yī)療技術、藥品等領域，形成了龐大的產(chǎn)業(yè)。同時，為了滿足市場的不同需求，通過細胞培養(yǎng)技術獲得的產(chǎn)品種類也更加多元化。

細胞融合是細胞培養(yǎng)技術的一種應用，其在自發(fā)或人工誘導下，將兩個不同基因型的細胞或原生質(zhì)體融合形成一個雜種細胞。目前，細胞融合技術多用于獲取雜交瘤，并用于單克隆抗體的科研和生產(chǎn)。

培養(yǎng)基是維持體外細胞生存和生長的溶液，分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。其中，合成培養(yǎng)基是根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法合成的。目前，關于細胞融合培養(yǎng)基進行了很多改造和研究，但通常都忽略了細胞培養(yǎng)基組分的改造所帶來的影響，使得細胞融合效率通常偏低。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種動物細胞融合基礎培養(yǎng)基，以解決現(xiàn)有技術中細胞融合培養(yǎng)基的細胞融合效率低的問題，從而通過提高細胞融合效率，達到高效獲取雜交瘤的目的，使得獲取單克隆抗體的機率顯著增加。

本發(fā)明通過下述技術方案實現(xiàn)：一種動物細胞融合基礎培養(yǎng)基，其特征在于，包括丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨、胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、羥脯氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸二鈉、纈氨酸、氯化鈣、硫酸鎂、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、生物素、氯化膽堿、肌醇、尼克酰胺、d-泛酸、吡哆醛、硫胺素、核黃素、抗壞血酸、維生素b-12、對氨基苯甲酸、葉酸、d-葡萄糖、酚紅、丙酮酸鈉、胸苷、還原型谷胱甘肽、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、氯化鈉、4-羥乙基哌嗪乙磺酸?，F(xiàn)有技術中，如hyclone1640培養(yǎng)基，忽略了細胞培養(yǎng)基組分的改造所帶來的影響，導致其細胞融合效率較低，為了解決上述問題，本發(fā)明通過系統(tǒng)組織工程技術(ztso)進行實驗設計和分析，從系統(tǒng)的角度而非理化層面去分析各組分和細胞生長之間的協(xié)同性，相較于傳統(tǒng)的doe設計和分析，僅通過少量的實驗即可確定和細胞培養(yǎng)相關的所有配方組成，并能準確確定每個組分準確的量。經(jīng)過ztso實驗設計和分析，開發(fā)出了上述用于動物細胞融合的基礎培養(yǎng)基。

為了對比本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基與現(xiàn)有的hyclone1640培養(yǎng)基的融合效果，進行免疫小白鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合實驗。在實驗的不同階段，即融合前、進樣補充、融合中使用本發(fā)明的培養(yǎng)基和hyclone1640培養(yǎng)基，通過最后孔板上每12個孔中細胞融合的孔的個數(shù)，判斷細胞融合。實驗發(fā)現(xiàn)，相比于hyclone1640培養(yǎng)基，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基能夠大幅提升細胞融合效率，若在實驗的三個階段全部采用本發(fā)明提供的培養(yǎng)基，細胞融合效率的提升最高，獲得陽性雜交瘤的可能性大大增加，具有廣泛的應用價值。

進一步地，各組分的用量為丙氨酸10-50mg/l，精氨酸100-300mg/l，天冬氨酸10-50mg/l，天冬酰氨10-50mg/l，胱氨酸10-50mg/l，谷氨酰胺100-500mg/l，谷氨酸10-50mg/l，甘氨酸10-50mg/l，組氨酸10-50mg/l，羥脯氨酸10-50mg/l，異亮氨酸10-50mg/l，亮氨酸10-50mg/l，賴氨酸10-50mg/l，蛋氨酸10-50mg/l，苯丙氨酸10-50mg/l，脯氨酸10-50mg/l，絲氨酸10-50mg/l，蘇氨酸10-50mg/l，色氨酸1-10mg/l，酪氨酸二鈉10-50mg/l，纈氨酸10-50mg/l，氯化鈣10-50mg/l，硫酸鎂10-50mg/l，氯化鉀200-400mg/l，磷酸二氫鉀10-50mg/l，磷酸氫二鈉500-1000mg/l，生物素0.1-5mg/l，氯化膽堿0.1-5mg/l，肌醇10-50mg/l，尼克酰胺0.1-5mg/l，d-泛酸0.1-5mg/l，吡哆醛0.1-5mg/l，硫胺素0.1-5mg/l，核黃素0.1-5mg/l，抗壞血酸10-50mg/l，維生素b120.001-0.01mg/l，對氨基苯甲酸0.1-5mg/l，葉酸0.1-5mg/l，d-葡萄糖1000-3000mg/l，酚紅1-5mg/l，丙酮酸鈉10-50mg/l，胸苷10-50mg/l，還原型谷胱甘肽0.1-5mg/l，碳酸氫鈉0.1-3g/l，氫氧化鈉0.1-3g/l，氯化鈉5-8g/l，4-羥乙基哌嗪乙磺酸3-8g/l。

進一步地，谷氨酰胺100-300mg/l，谷氨酸40-50mg/l，尼克酰胺0.5mg/l，抗壞血酸25-50mg/l，硫胺素0.5mg/l。

進一步地，碳酸氫鈉0.8-3g/l，氫氧化鈉1.2-3g/l，氯化鈉6.5-8g/l。

進一步地，氯化鈣30-50mg/l，硫酸鎂30-50mg/l，氯化鉀300-400mg/l。

進一步地，d-泛酸3-5mg/l，吡哆醛2.5-5mg/l，硫胺素1.8-5mg/l。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有如下的優(yōu)點和有益效果：

1、本發(fā)明能夠大幅提升細胞融合效率，若在細胞融合的各個階段均采用本發(fā)明提供的培養(yǎng)基，細胞融合效率的提升最高，獲得陽性雜交瘤的可能性大大增加；

2、本發(fā)明組分搭配良好，相比于市面上銷售的培養(yǎng)基，成本更低、融合效率更高。

具體實施方式

為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚明白，下面結合實施例，對本發(fā)明作進一步的詳細說明，本發(fā)明的示意性實施方式及其說明僅用于解釋本發(fā)明，并不作為對本發(fā)明的限定。

實施例1：

丙氨酸50mg/l，精氨酸100mg/l，天冬氨酸50mg/l，天冬酰氨50mg/l，胱氨酸10mg/l，谷氨酰胺100mg/l，谷氨酸40mg/l，甘氨酸50mg/l，組氨酸50mg/l，羥脯氨酸10mg/l，異亮氨酸10mg/l，亮氨酸50mg/l，賴氨酸10mg/l，蛋氨酸10mg/l，苯丙氨酸50mg/l，脯氨酸50mg/l，絲氨酸50mg/l，蘇氨酸50mg/l，色氨酸10mg/l，酪氨酸二鈉10mg/l，纈氨酸10-50mg/l，氯化鈣30mg/l，硫酸鎂30mg/l，氯化鉀300mg/l，磷酸二氫鉀10mg/l，磷酸氫二鈉1000mg/l，生物素0.1mg/l，氯化膽堿0.1mg/l，肌醇10mg/l，尼克酰胺0.5mg/l，d-泛酸3mg/l，吡哆醛2.5mg/l，硫胺素1.8mg/l，核黃素0.1mg/l，抗壞血酸25mg/l，維生素b120.01mg/l，對氨基苯甲酸0.1mg/l，葉酸0.1mg/l，d-葡萄糖1000mg/l，酚紅5mg/l，丙酮酸鈉10mg/l，胸苷50mg/l，還原型谷胱甘肽5mg/l，碳酸氫鈉0.8g/l，氫氧化鈉1.2g/l，氯化鈉6.5g/l，4-羥乙基哌嗪乙磺酸3-8g/l。

實施例2

丙氨酸10-50mg/l，精氨酸300mg/l，天冬氨酸50mg/l，天冬酰氨50mg/l，胱氨酸10mg/l，谷氨酰胺100mg/l，谷氨酸50mg/l，甘氨酸10mg/l，組氨酸10mg/l，羥脯氨酸10mg/l，異亮氨酸50mg/l，亮氨酸10mg/l，賴氨酸50mg/l，蛋氨酸50mg/l，苯丙氨酸10mg/l，脯氨酸10mg/l，絲氨酸50mg/l，蘇氨酸50mg/l，色氨酸1mg/l，酪氨酸二鈉10mg/l，纈氨酸50mg/l，氯化鈣50mg/l，硫酸鎂10mg/l，氯化鉀200mg/l，磷酸二氫鉀10mg/l，磷酸氫二鈉1000mg/l，生物素0.1mg/l，氯化膽堿0.1mg/l，肌醇10mg/l，尼克酰胺5mg/l，d-泛酸5mg/l，吡哆醛0.1mg/l，硫胺素0.1mg/l，核黃素5mg/l，抗壞血酸50mg/l，維生素b120.001mg/l，對氨基苯甲酸5mg/l，葉酸5mg/l，d-葡萄糖1000mg/l，酚紅5mg/l，丙酮酸鈉50mg/l，胸苷50mg/l，還原型谷胱甘肽5mg/l，碳酸氫鈉3g/l，氫氧化鈉3g/l，氯化鈉5g/l，4-羥乙基哌嗪乙磺酸8g/l。

實施例3

丙氨酸50mg/l，精氨酸100mg/l，天冬氨酸50mg/l，天冬酰氨10mg/l，胱氨酸10mg/l，谷氨酰胺500mg/l，谷氨酸10mg/l，甘氨酸50mg/l，組氨酸10mg/l，羥脯氨酸50mg/l，異亮氨酸10mg/l，亮氨酸10mg/l，賴氨酸10mg/l，蛋氨酸10mg/l，苯丙氨酸10mg/l，脯氨酸10mg/l，絲氨酸10mg/l，蘇氨酸10mg/l，色氨酸10mg/l，酪氨酸二鈉50mg/l，纈氨酸50mg/l，氯化鈣10mg/l，硫酸鎂10mg/l，氯化鉀400mg/l，磷酸二氫鉀50mg/l，磷酸氫二鈉500mg/l，生物素0.1mg/l，氯化膽堿0.1mg/l，肌醇10mg/l，尼克酰胺0.1mg/l，d-泛酸0.1mg/l，吡哆醛0.1mg/l，硫胺素0.1mg/l，核黃素0.1mg/l，抗壞血酸10mg/l，維生素b120.01mg/l，對氨基苯甲酸0.1mg/l，葉酸0.1mg/l，d-葡萄糖3000mg/l，酚紅5mg/l，丙酮酸鈉10mg/l，胸苷10mg/l，還原型谷胱甘肽5mg/l，碳酸氫鈉3g/l，氫氧化鈉3g/l，氯化鈉5g/l，4-羥乙基哌嗪乙磺酸3g/l。

實施例4

丙氨酸50mg/l，精氨酸300mg/l，天冬氨酸10mg/l，天冬酰氨10mg/l，胱氨酸10mg/l，谷氨酰胺100mg/l，谷氨酸10mg/l，甘氨酸10mg/l，組氨酸10mg/l，羥脯氨酸10mg/l，異亮氨酸50mg/l，亮氨酸50mg/l，賴氨酸50mg/l，蛋氨酸50mg/l，苯丙氨酸10mg/l，脯氨酸50mg/l，絲氨酸50mg/l，蘇氨酸50mg/l，色氨酸1mg/l，酪氨酸二鈉50mg/l，纈氨酸10mg/l，氯化鈣10mg/l，硫酸鎂10mg/l，氯化鉀400mg/l，磷酸二氫鉀50mg/l，磷酸氫二鈉500mg/l，生物素0.1mg/l，氯化膽堿5mg/l，肌醇50mg/l，尼克酰胺0.1mg/l，d-泛酸0.1mg/l，吡哆醛0.1mg/l，硫胺素0.1mg/l，核黃素5mg/l，抗壞血酸50mg/l，維生素b120.001mg/l，對氨基苯甲酸0.1mg/l，葉酸0.1mg/l，d-葡萄糖3000mg/l，酚紅5mg/l，丙酮酸鈉10mg/l，胸苷50mg/l，還原型谷胱甘肽0.1mg/l，碳酸氫鈉3g/l，氫氧化鈉3g/l，氯化鈉8g/l，4-羥乙基哌嗪乙磺酸3g/l。

實施例5

丙氨酸10mg/l，精氨酸100mg/l，天冬氨酸10mg/l，天冬酰氨10mg/l，胱氨酸10mg/l，谷氨酰胺100mg/l，谷氨酸10mg/l，甘氨酸10mg/l，組氨酸10mg/l，羥脯氨酸10mg/l，異亮氨酸10mg/l，亮氨酸10mg/l，賴氨酸10mg/l，蛋氨酸10mg/l，苯丙氨酸10mg/l，脯氨酸10mg/l，絲氨酸10mg/l，蘇氨酸10mg/l，色氨酸1mg/l，酪氨酸二鈉10mg/l，纈氨酸10mg/l，氯化鈣10mg/l，硫酸鎂10mg/l，氯化鉀200mg/l，磷酸二氫鉀10mg/l，磷酸氫二鈉500mg/l，生物素0.1mg/l，氯化膽堿0.1mg/l，肌醇10mg/l，尼克酰胺0.1mg/l，d-泛酸0.1mg/l，吡哆醛0.1mg/l，硫胺素0.1mg/l，核黃素0.1mg/l，抗壞血酸10mg/l，維生素b120.001mg/l，對氨基苯甲酸0.1mg/l，葉酸0.1mg/l，d-葡萄糖1000mg/l，酚紅1mg/l，丙酮酸鈉10mg/l，胸苷10mg/l，還原型谷胱甘肽0.1mg/l，碳酸氫鈉0.1g/l，氫氧化鈉0.1g/l，氯化鈉5g/l，4-羥乙基哌嗪乙磺酸3g/l。

免疫小白鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合實驗：

操作步驟：

準備階段：小鼠骨髓瘤細胞，免疫小白鼠脾細胞，按照實施例1中的配方制成的基礎培養(yǎng)基，hyclone1640培養(yǎng)基，滅菌后4℃保存的聚乙二醇4000，加樣槍。準備完畢后，之后飼養(yǎng)細胞4個孔板，每個孔板上有96個孔，每孔的體積為100μl。飼養(yǎng)的細胞來自于bablc小鼠腹腔，無菌收集，與培養(yǎng)基混合后，均勻加入孔板的孔中，每孔100μl。優(yōu)選地，小鼠骨髓瘤細胞與免疫小白鼠脾細胞數(shù)量比為1：20。

融合階段：首先用培養(yǎng)基吹洗小鼠骨髓瘤細胞后，將其加入50ml離心管中，并同時加入復蘇的免疫小白鼠脾細胞，混勻后離心4分鐘；之后重復離心步驟；離心完成后除去離心管中的上清液，將細胞沉淀輕輕混勻后，沿著管壁在60秒內(nèi)加入緩慢加入800μl的peg4000，加完后靜置90秒。之后再加入50ml培養(yǎng)基后離心；離心完成后，除去上清液，加入培養(yǎng)基混勻后，用加樣槍將其轉入孔板中；然后放入5％co2的孵箱培養(yǎng)；七天后，全換液。

通過在不同階段添加按實施例1中的配方制成的基礎培養(yǎng)基，得到的細胞融合率如表1所示：

表1

如表1所示，在各個階段添加按實施例1的配方制成的基礎培養(yǎng)基均能提高細胞融合率，其中，在三個階段均使用按實施例1的配方制成的基礎培養(yǎng)基能達到83.3％的融合率。相比于現(xiàn)有技術，大幅地提高了細胞融合效率，達到高效獲取雜交瘤的目的，使得獲取單克隆抗體的機率顯著增加，具有廣泛地應用價值。

以上所述的具體實施方式，對本發(fā)明的目的、技術方案和有益效果進行了進一步詳細說明，所應理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實施方式而已，并不用于限定本發(fā)明的保護范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。