本發(fā)明屬于egfp生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于egfp的gpr120基因表達的檢測方法，本發(fā)明還涉及一種基于egfp在gpr120基因表達檢測中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

gpr120(g-proteincoupledreceptor120；又名freefattyacidreceptor4，ffar4)是脂肪酸受體家族一員，屬于g蛋白偶聯(lián)受體(gpcr)，可被長鏈脂肪酸激活，尤以n-3不飽和脂肪酸激活能力最強。gpr120在腦、垂體、肺、舌、胃腸、脂肪組織等許多組織表達，主要分布于胃腸多種內(nèi)分泌細胞、脂肪細胞、巨噬細胞、成骨和破骨細胞以及味蕾細胞。gpr120激活可刺激glp-1、cck、gip等胃腸激素分泌，影響機體的內(nèi)分泌代謝活動，與肥胖等代謝異常密切相關(guān)。

gpr120表達水平高低顯著影響其細胞調(diào)節(jié)作用，gpr120表達調(diào)控的研究將促進對gpr120功能的認識和發(fā)現(xiàn)可能的代謝調(diào)節(jié)靶分子，為gpr120靶點藥物的研發(fā)提供一定的依據(jù)。基因表達研究所常用技術(shù)手段目前有反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(rt-pcr)和northern印跡雜交(northernblot)，這兩種方法雖然技術(shù)成熟，廣泛應(yīng)用于基因表達水平的檢測，但是也存在一定的缺點：一是實驗過程較為繁瑣，二是不能在活細胞水平監(jiān)測基因表達的變化。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于egfp的gpr120基因表達水平的檢測方法及其應(yīng)用，解決了現(xiàn)有g(shù)pr120基因表達水平的檢測中實驗步驟繁瑣、不能在活細胞水平監(jiān)測基因表達的變化的問題，為gpr120基因表達水平的檢測提供了新思路。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，egfp在gpr120基因表達水平的檢測中的應(yīng)用。

本發(fā)明的特征在于，

egfp與gpr120基因表達水平的呈線性關(guān)系，即隨著egfp熒光平均強度值的增加，gpr120基因表達水平增加。

本發(fā)明所采用的另一個技術(shù)方案是，基于egfp的gpr120基因表達水平的檢測方法：

步驟1，首先通過crispr/cas9技術(shù)將egfp片段定點插入到gpr120基因的終止密碼子taa處，使egfp隨gpr120表達而表達，獲得egfp標(biāo)記gpr120陽性細胞的轉(zhuǎn)基因模型小鼠；

步驟2，隨后應(yīng)用熒光分析儀在488nm激光激發(fā)下對小鼠的陽性細胞熒光強度進行測定。

本發(fā)明的特征在于，

步驟2的熒光強度通過單細胞平均熒光強度進行表達。

步驟2的具體步驟：

步驟2.1，使用沒有被egfp標(biāo)定的小鼠細胞進行熒光分析儀的激光強度指標(biāo)校正；

步驟2.2，收取步驟1中轉(zhuǎn)基因模型小鼠的不同組織的egfp陽性細胞，通過經(jīng)步驟2.1校正后的熒光分析儀進行熒光強度測定，獲取egfp與gpr120基因表達水平之間的關(guān)系；同時通過rt-pcr方法檢測egfp陽性細胞中g(shù)pr120的基因表達水平，驗證egfp與gpr120基因表達水平之間的關(guān)系。

本發(fā)明有益效果是：

a)本發(fā)明通過實時監(jiān)測gpr120基因表達，做到自身前后對照，控制組內(nèi)誤差，減少組間誤差，保證測定結(jié)果更為可靠，從而彌補和克服了rt-pcr和northernblot等方法對不同組織細胞進行組間比較而產(chǎn)生的變異性、不能在活細胞水平監(jiān)測基因表達的變化的問題；

b)本發(fā)明收取細胞后即刻確定gpr120基因表達水平，省去了rna提取、rna反轉(zhuǎn)錄和pcr等操作和反應(yīng)過程，使gpr120基因表達檢測更加簡便快捷。

附圖說明

圖1是gpr120-ires-egfp轉(zhuǎn)基因小鼠的組織細胞中egfp熒光陽性細胞，其中，圖1a為gpr120-ires-egfp轉(zhuǎn)基因小鼠組織在488nm激光激發(fā)下egfp熒光陽性細胞圖，圖1b為圖1a的組織的普通光鏡圖，圖1c為野生型小鼠組織在488nm激光激發(fā)下細胞圖，圖1d為圖1c的組織的普通光鏡圖；

圖2是小鼠組織中的擴增曲線圖，其中，圖2a為gpr120-ires-egfp轉(zhuǎn)基因小鼠的組織中g(shù)pr120的rt-pcr小擴增曲線，圖2b為gpr120-ires-egfp轉(zhuǎn)基因小鼠的組織中egfp的rt-pcr小擴增曲線，圖2c為野生型小鼠組織中g(shù)pr120的rt-pcr小擴增曲線，圖2d為野生型小鼠組織中egfp的rt-pcr小擴增曲線；

圖3是gpr120-ires-egfp轉(zhuǎn)基因小鼠不同組織細胞中egfp熒光強度和gpr120基因表達水平之間的關(guān)系；

圖4是gpr120-ires-egfp轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔巨噬細胞在體外經(jīng)脂多糖處理后egfp熒光強度和gpr120基因表達水平之間的關(guān)系圖，其中，圖4a是gpr120基因表達水平在對照組和經(jīng)脂多糖處理組的關(guān)系圖，圖4b是egfp熒光強度均值在對照組和經(jīng)脂多糖處理組的關(guān)系圖，圖4c是gpr120基因表達水平與細胞egfp熒光強度均值的關(guān)系圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明進行詳細說明。

本發(fā)明以egfp標(biāo)記gpr120陽性細胞的模型小鼠為對象，利用熒光顯微鏡技術(shù)測定小鼠egfp陽性細胞的熒光強度，與egfp陽性細胞的gpr120基因表達水平進行相關(guān)性分析，確定egfp陽性細胞的熒光強度與gpr120基因表達水平之間的線性關(guān)系，使egfp熒光強度作為gpr120基因表達水平的一個可靠的檢測指標(biāo)提供了依據(jù)。

基于egfp的gpr120基因表達水平的檢測方法：

步驟1，首先通過crispr/cas9技術(shù)將egfp片段定點插入到gpr120基因的終止密碼子taa處，使egfp隨gpr120表達而表達，獲得egfp標(biāo)記gpr120陽性細胞的轉(zhuǎn)基因模型小鼠，這樣egfp隨gpr120表達而表達，并且在mrna水平，egfp和gpr120相互分離，保證了gpr120蛋白的功能和代謝過程不受影響；

步驟2，隨后應(yīng)用熒光分析儀在488nm激光激發(fā)下對小鼠的陽性細胞熒光強度進行測定，并通過單細胞平均熒光強度表達，

步驟2.1，使用沒有被egfp標(biāo)定的小鼠細胞進行熒光分析儀的激光強度指標(biāo)校正；

步驟2.2，收取步驟1中轉(zhuǎn)基因模型小鼠的不同組織的egfp陽性細胞，通過經(jīng)步驟2.1校正后的熒光分析儀進行熒光強度測定，獲取egfp與gpr120基因表達水平之間的關(guān)系；同時通過rt-pcr方法檢測egfp陽性細胞中g(shù)pr120的基因表達水平，驗證egfp與gpr120基因表達水平之間的關(guān)系。

1.實驗對象

制備的egfp標(biāo)記gpr120的模型小鼠，細胞組織中能見egfp陽性細胞，在488nm激光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，具體如圖1所示：圖1a為gpr120-ires-egfp轉(zhuǎn)基因小鼠組織的熒光陽性細胞圖，可見陽性細胞，圖1b為圖1a的組織的普通光鏡圖，圖1c為野生型小鼠組織的細胞圖，未見熒光陽性細胞，圖1d為圖1c的組織的普通光鏡圖。

2.細胞內(nèi)rna提取和反轉(zhuǎn)錄

在egfp標(biāo)記gpr120的模型小鼠和野生型小鼠，分別提取小鼠的胃粘膜、十二指腸粘膜、空腸粘膜、結(jié)腸粘膜、脂肪組織、垂體、肺臟等組織器官的rna提取并進行反轉(zhuǎn)錄，具體如下：取上述組織各1-2mg，每樣加入350μl裂解液rl，使用組織破裂儀破裂組織，再將所有溶液轉(zhuǎn)移至過濾柱cs中以12000rpm速度離心2min，收集濾液；再向濾液中加入350μl70％的乙醇溶液，混勻后轉(zhuǎn)入吸附柱cr3中以12000rpm速度離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中；向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，以12000rpm速度離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中；向吸附柱cr3中加入80μldnasei工作液，室溫放置15min；向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，以12000rpm速度離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中；向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw，室溫靜置2min，以12000rpm速度離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中；重復(fù)向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw，室溫靜置2min，以12000rpm速度離心2min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3置于室溫放置5min以徹底晾干殘余的漂洗液；將吸附柱cr3轉(zhuǎn)入rnase-free離心管中，加入50μlrnase-freeddh2o，室溫放置2min，以12000rpm速度離心2min，得到rna溶液。

酶標(biāo)儀檢測rna濃度與純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測rna質(zhì)量。在八連管中依次加入2μl5xgdnaeraserbuffer，再分別加入1μlgdnaeraser，再分別加入1μgtotalrna，最后用rnasefreedh2o補足至10μl，混勻，室溫反應(yīng)5min。在各管中分別加入以下試劑，4μl5xprimescriptbuffer2、4μlrnasefreedh2o、1μlprimescriptrtenzymemixi和1μlrtprimermix，總反應(yīng)體系為20μl，混勻。反應(yīng)條件為37℃、15min，85℃、5s。反應(yīng)完成后將cdna存于4℃?zhèn)溆茫L期保存時轉(zhuǎn)入-20℃。

3.gpr120和egfp基因表達水平的檢測

采用定量pcr方法對gpr120和egfp的基因表達進行檢測。在八連管中依次加入6μldh2o，2μl模板cdna，2μlfas引物，10μlsybrpremixextaqii(2x)，總反應(yīng)體系為20μl，混勻。

反應(yīng)條件是：第一步是94℃、5min，第二步是94℃、30s，56℃、30s，72℃、1min循環(huán)進行40次，第三步是加溫溶解擴增產(chǎn)物，獲得溶解曲線。

其中，總反應(yīng)體系中小鼠gpr120引物序列是：

上游引物：5’-gtgccgggactggtcattgtg-3’；

下游引物：5’-ttgttgggacactcggatctgg-3’。

總反應(yīng)體系中egfp引物序列是：

上游引物：5’-tcttcttcaaggacgacggcaact-3’；

下游引物：5’-ccttgatgccgttcttctgcttgt-3’。

以beta-actin基因表達為內(nèi)對照，總反應(yīng)體系中beta-actin引物序列是：

上游引物：5’-cgttggcatccacgaaacta-3’；

下游引物：5’-ggtgctgggaggtacaggg-3’。

對實驗結(jié)果表達水平分析得到如圖2所示的擴增曲線。如圖2a表示轉(zhuǎn)基因小鼠的組織中g(shù)pr120的rt-pcr小擴增曲線，如圖2b表示轉(zhuǎn)基因小鼠的組織中egfp的rt-pcr小擴增曲線，在一定階段內(nèi)兩者均隨著擴增循環(huán)次數(shù)的增大而升高。如圖2c表示野生型小鼠組織中g(shù)pr120的rt-pcr小擴增曲線，在一定階段內(nèi)兩者均隨著擴增循環(huán)次數(shù)的增大而升高，如圖2d表示野生型小鼠組織中egfp的rt-pcr小擴增曲線，曲線結(jié)果無表達。

以beta-actin基因表達為內(nèi)對照，對各個不同組織中的gpr120基因表達水平進行分析，并應(yīng)用熒光顯微鏡對各個組織中egfp標(biāo)記的細胞的綠色熒光強度進行測量。結(jié)果表明，組織中g(shù)pr120表達水平與組織中綠色熒光細胞的熒光強度之間呈顯著正相關(guān)，結(jié)果如圖3所示。

實施例

培養(yǎng)egfp標(biāo)記的gpr120的模型小鼠的肺泡巨噬細胞，具體方法如下：體外培養(yǎng)采用頸部脫臼法處死egfp標(biāo)記gpr120的模型小鼠，用75％的酒精對小鼠進行消毒處理；用10ml注射器吸取pbs緩沖液6ml左右，除去氣泡備用；用眼科剪剪開頸部至胸腔外表皮，分離頸部氣管穿線備用，剪開胸腔使肺部暴露，用鑷子夾住氣管前端，剪短氣管將注射器針尖插入氣管并用線扎緊；緩慢注入pbs緩沖液2-3ml使肺部充滿，吸出肺內(nèi)溶液再緩慢注入，循環(huán)3-5次，吸取肺內(nèi)pbs緩沖液注入離心管，所得為含肺巨噬細胞的溶液；將離心管配平于低溫水平離心機離心6min，轉(zhuǎn)速為1200rpm；吸去上清液，底物即為肺巨噬細胞。

向肺巨噬細胞中加入細胞培養(yǎng)液，充分混勻，種于培養(yǎng)皿，使每組培養(yǎng)皿內(nèi)細胞數(shù)均勻，標(biāo)上日期及名稱，置37℃的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)8小時后，細胞分組，一組加入200ng/ml的脂多糖(lps)處理24小時，另外一組為對照組。

隨后，應(yīng)用熒光顯微鏡對各個組織中egfp標(biāo)記的細胞的熒光強度進行測量，測量熒光強度之后，收集細胞的rna，反轉(zhuǎn)錄之后應(yīng)用定量pcr方法觀察gpr120基因表達水平。結(jié)果顯示，如圖4a所示，肺泡巨噬細胞的gpr120基因表達與lps處理組比較，對照組顯著升高；如圖4b所示，同時肺泡巨噬細胞的egfp熒光強度均值與lps處理組比較，對照組也顯著升高；如圖4c所示，gpr120基因表達與細胞egfp熒光強度均值之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系，隨著egfp熒光強度均值的增大，gpr120基因表達水平升高。