本發(fā)明涉及微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)的絕對(duì)豐度測(cè)定方法。

背景技術(shù)：

微生物是生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)中重要的組成部分，在地球物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，因其豐富的物種多樣性，基因多樣性及生態(tài)系統(tǒng)多樣性，具有較大的挖掘潛質(zhì)，一直備受研究者關(guān)注。據(jù)估計(jì)，地球中微生物數(shù)量約為4-6×10³⁰個(gè)細(xì)胞，種類多達(dá)10⁶種。

對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的研究是環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)的研究基礎(chǔ)，在過去的百年中，科學(xué)家對(duì)于環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了廣泛的研究，研發(fā)了例如平板計(jì)數(shù)、顯微鏡觀察、磷脂脂肪酸分析、變性梯度凝膠電泳等多種方法。這些方法都有其優(yōu)勢(shì)，例如平板計(jì)數(shù)，可以非常直觀的觀察到環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)中不同的微生物以及其數(shù)量。但是由于環(huán)境中可培養(yǎng)的微生物僅有1％-15％，極大的限制了平板計(jì)數(shù)的觀察能力。

近些年來隨著第二代高通量測(cè)序技術(shù)，如illumina測(cè)序平臺(tái)等的發(fā)明，使得基因測(cè)序的通量極大的提高，最高一天可達(dá)1.5gb數(shù)據(jù)量。這也讓應(yīng)用第二代高通量測(cè)序技術(shù)研究微生物群落結(jié)構(gòu)的方法替代了先前的研究方法，成為了研究環(huán)境細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)最新的研究方法。然而，第二代高通量測(cè)序技術(shù)只能獲取dna樣品序列數(shù)量，從而算出環(huán)境細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的百分比信息，換而言之，只能獲取環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)相對(duì)豐度信息。

描述生態(tài)學(xué)研究主要有三個(gè)要素分別為物種絕對(duì)豐度、相對(duì)豐度以及物種種類數(shù)。三者之間相互關(guān)聯(lián)，但又彼此獨(dú)立。主要體現(xiàn)在相對(duì)豐度可以通過單個(gè)物種的絕對(duì)豐度除以整個(gè)群體總量來換算成單個(gè)物種的相對(duì)豐度。但是兩者對(duì)于描述單個(gè)物種的功能不同，絕對(duì)豐度可以用于描述單個(gè)物種的絕對(duì)含量，表征其在不同或相同的環(huán)境群落里數(shù)量的增減；相對(duì)豐度主要用于描述單個(gè)物種占整個(gè)環(huán)境群落的百分比，描述單個(gè)物種的優(yōu)勢(shì)程度，而無法用于跨樣本間的比較。例如，物種x在樣本a和樣本b中分別占有10％和3％的比例，當(dāng)樣本a、b微生物總量一致時(shí)，a樣本中的物種x絕對(duì)豐度多于b樣本；若a樣本(10⁸cellsg^-1)中微生物總量少于b樣本(10⁹cellsg^-1)時(shí)，a樣本中的物種x絕對(duì)豐度則少于b樣本。

由于受到技術(shù)等方面的限制，研究者只能借助高通量測(cè)序手段獲得群落結(jié)構(gòu)的相對(duì)豐度信息，以此來表征環(huán)境微生物的增減變化，為更為精確和快速的表征環(huán)境微生物的群落結(jié)構(gòu)變化，亟待開發(fā)一種既能快速獲得微生物群落結(jié)構(gòu)信息，同時(shí)能準(zhǔn)確了解微生物群落結(jié)構(gòu)絕對(duì)豐度信息的技術(shù)，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)方法的不足，對(duì)于更為全面研究與了解環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)及其生態(tài)學(xué)具有十分重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)的絕對(duì)豐度測(cè)定方法，有利于完善環(huán)境細(xì)菌絕對(duì)豐度、群落結(jié)構(gòu)及數(shù)量生態(tài)學(xué)的研究，從而進(jìn)一步研究利用環(huán)境細(xì)菌。

本發(fā)明提供一種環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)的絕對(duì)豐度測(cè)定方法，包括如下步驟：

(1)提取環(huán)境樣品中的dna，獲取dna樣品；

(2)通過實(shí)時(shí)熒光定量pcr(qpcr)方法測(cè)定dna樣品中的分類基因總濃度；

(3)通過第二代高通量測(cè)序方法對(duì)dna樣品進(jìn)行分類基因擴(kuò)增子高通量測(cè)序，獲得環(huán)境樣品中微生物不同分類單元(界、門、綱、目、科、屬、種)的分類基因相對(duì)豐度；

(4)將步驟(2)的dna樣品中的分類基因總濃度與步驟(3)的微生物不同界門綱目科屬種的分類基因的相對(duì)豐度相乘，計(jì)算得到微生物不同界門綱目科屬種的分類基因的絕對(duì)豐度，從而獲得環(huán)境中微生物群落的絕對(duì)豐度。

所述的步驟(1)中，采取的環(huán)境樣品采用mobiodna提取試劑盒進(jìn)行dna的提取，操作步驟按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程。

所述的步驟(2)中，所測(cè)微生物為細(xì)菌或古菌時(shí)，分類基因?yàn)?6srrna基因；所測(cè)微生物為真菌時(shí)，分類基因?yàn)閕ts基因。

所述的步驟(2)中，包括如下步驟：

(2-1)制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品；

(2-2)計(jì)算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)；

(2-3)樣品分類基因濃度qpcr測(cè)定。

所述的制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品包括如下步驟：

(2-1-1)選用相應(yīng)的引物對(duì)分類基因進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲取目的基因片段；

(2-1-2)采用ta克隆試劑盒將(2-1-1)中目的基因片段與質(zhì)粒載體相連，并將該質(zhì)粒載體導(dǎo)入dh5α感受態(tài)細(xì)胞中；

(2-1-3)將(2-1-2)中50μl含有質(zhì)粒的dh5α感受態(tài)細(xì)胞置于300μl液體lb培養(yǎng)基中，在37℃、250rpm條件下培養(yǎng)1h；

(2-1-4)吸取200μl(2-1-3)中培養(yǎng)液，涂布于含有終濃度為100μgml^-1氨芐青霉素的lb固體培養(yǎng)基上，37℃靜置過夜培養(yǎng)；

(2-1-5)隨機(jī)挑選6-8個(gè)重組單克隆菌落分別渦旋于10μl無菌水中；

(2-1-6)分別吸取1μl(2-1-5)中菌懸液作為模板采用m13引物(正向引物：5’-tgtaaaacgacggccagt-3’；反向引物：5’-caggaaacagctatgacc-3’)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，并對(duì)所得的pcr產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，剩余9μl菌懸液加于含有氨芐青霉素濃度為100μgml^-1液體lb培養(yǎng)基中，37℃、250rpm條件下培養(yǎng)12-18h后，吸取500μl菌液保存于-80℃環(huán)境中；

(2-1-7)將測(cè)定序列結(jié)果與nbci數(shù)據(jù)中序列進(jìn)行blast比對(duì)，選擇1株成功導(dǎo)入分類基因序列的重組單克隆菌株；

(2-1-8)吸取200μl(2-1-7)中所選取的重組單克隆菌株，加入20ml含有氨芐青霉素濃度為100μgml^-1液體lb培養(yǎng)基中37℃、250rpm條件下培養(yǎng)12-18h；

(2-1-9)吸取4ml(2-1-8)中菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，獲得質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

所述的步驟(2-1-1)中，當(dāng)所測(cè)微生物為細(xì)菌，選用正向引物520f(5’-aytgggydtaaagng-3’)和反向引物802r(5’-tacnvgggtatctaatcc-3’)對(duì)16srrna基因的v4可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增；當(dāng)所測(cè)微生物為古菌，選用正向引物arc915fmc(5’-aggaattggcgggrgrgcac-3’)和反向引物arc1059r(5’-gccatgcaccwcctct-3’)對(duì)16srrna基因進(jìn)行擴(kuò)增；當(dāng)所測(cè)微生物為真菌，選用正向引物its1f(5’-gcatcgatgaagaacgcagc-3’)和反向引物its1r(5’-tcctccgcttattgatatgc-3’)對(duì)its1基因進(jìn)行擴(kuò)增。

所述的步驟(2-1-2)中ta克隆試劑盒采用tsingkepclone007simplevectorkit(貨號(hào)：tsv-007s)試劑盒，操作步驟按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程。

所述的步驟(2-1-6)中對(duì)所得的pcr產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序送于生物技術(shù)公司進(jìn)行。

所述的計(jì)算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)包括如下步驟：

(2-2-1)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品dna濃度采用nd1000確定其濃度c(ngμl^-1)；

(2-2-2)將插入片段與質(zhì)粒載體長(zhǎng)度相加，得到質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品長(zhǎng)度l；

(2-2-3)根據(jù)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定濃度c，計(jì)算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)(copiesμl^-1)，計(jì)算公式為(c×6.02×10²³)/(l×660×10³)。

所述的樣品分類基因濃度qpcr測(cè)定包括如下步驟：

(2-3-1)將已知濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品通過10倍梯度稀釋，構(gòu)建濃度為10⁹，10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²copiesμl^-1標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)樣；

(2-3-2)將dna樣品與10倍梯度稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣一同進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr測(cè)定，獲得ct值；

(2-3-3)利用統(tǒng)計(jì)學(xué)中的線性回歸方法將10倍梯度稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣的ct值與拷貝數(shù)對(duì)數(shù)進(jìn)行方程擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(2-3-4)將dna樣品ct值代入(2-3-3)中標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算dna樣品分類基因濃度。

所述的實(shí)時(shí)熒光定量pcr測(cè)定采用試劑盒thermofishergreenqpcrsupermix-udgw/rox(貨號(hào)：11744-500)，加樣體系及反應(yīng)條件按說明書操作，測(cè)定儀器為480。

所述步驟(3)中獲取環(huán)境樣品中微生物相對(duì)豐度包括如下步驟：

(3-1)通過第二代高通量測(cè)序技術(shù)的illuminamiseq測(cè)序平臺(tái)測(cè)定dna樣品中的分類基因的種類和測(cè)序條數(shù)；

(3-2)將不同分類基因種類與silva數(shù)據(jù)庫比對(duì)，獲取分類基因的分類學(xué)信息，包括其界門綱目科屬種的信息，并通過測(cè)序條數(shù)計(jì)算獲得不同界門綱目科屬種的分類基因的相對(duì)百分比豐度。

所述的步驟(3-1)中高通量測(cè)序送于公司進(jìn)行。

所述的步驟(3-2)中將不同分類基因種類與silva數(shù)據(jù)庫比對(duì)運(yùn)用qiime(quantitativeinsightsintomicrobialecology，版本：1.9.1)。

本發(fā)明提供了一種以高通量測(cè)序平臺(tái)為基礎(chǔ)，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量pcr法對(duì)環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)的測(cè)定方法。在高通量測(cè)序技術(shù)僅能獲得相對(duì)豐度的基礎(chǔ)上，加以環(huán)境dna微生物分類基因總濃度的獲取，實(shí)現(xiàn)了微生物群落結(jié)構(gòu)絕對(duì)豐度的高通量快速測(cè)定，使得跨樣本比較更為可靠，實(shí)質(zhì)反映物種的增長(zhǎng)與減少，為進(jìn)一步探究微生物群落結(jié)構(gòu)提供技術(shù)支撐。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒qpcr測(cè)量得到的擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例中土壤中細(xì)菌門水平相對(duì)豐度圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例中土壤中細(xì)菌門水平絕對(duì)豐度圖。

具體實(shí)施方式

為了更為具體地描述本發(fā)明，下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。

實(shí)施例1

環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)的測(cè)定方法應(yīng)用于疊氮化鈉處理土壤樣品，依次進(jìn)行如下步驟：

1)在土壤中添加0.1％(wt重量比)的疊氮化鈉，于28℃下培養(yǎng)28天，分別取培養(yǎng)到0天和28天的土壤樣品10g，待用。

2)提取土壤dna樣品：

稱取0.25g土壤樣品，本實(shí)施例采用的是mobiodna提取試劑盒，操作步驟按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程。

3)土壤dna樣品細(xì)菌總16srrna基因濃度的qpcr測(cè)定：

(1)選用正向引物520f(5’-aytgggydtaaagng-3’)和反向引物802r(5’-tacnvgggtatctaatcc-3’)對(duì)16srrna基因v4可變區(qū)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲取目的基因片段。

(2)采用tsingkepclone007simplevectorkit(貨號(hào)：tsv-007s)試劑盒將(1)中目的基因片段與質(zhì)粒載體相連，并將該質(zhì)粒載體導(dǎo)入dh5α感受態(tài)細(xì)胞中，操作步驟按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程。

(3)將(2)中含有質(zhì)粒的dh5α感受態(tài)細(xì)胞50μl置于300μl液體lb培養(yǎng)基中，在37℃、250rpm條件下培養(yǎng)1h。

(4)吸取200μl(3)中培養(yǎng)液，涂布于含有氨芐青霉素(終濃度為100μgml^-1)的lb固體培養(yǎng)基上。37℃靜置過夜培養(yǎng)。

(5)隨機(jī)挑選6-8個(gè)重組單克隆菌落分別渦旋于10μl無菌水中。

(6)分別吸取1μl(5)中菌懸液作為模板采用m13引物(正向引物：5’-tgtaaaacgacggccagt-3’；反向引物：5’-caggaaacagctatgacc-3’)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，并將pcr產(chǎn)物送于杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司使用sanger測(cè)序儀測(cè)定序列。剩余9μl菌懸液加于含有氨芐青霉素濃度為100μgml^-1液體lb培養(yǎng)基中，37℃、250rpm條件下培養(yǎng)12-18h后，吸取500μl菌液保存于-80℃環(huán)境中。

(7)將測(cè)定序列結(jié)果與nbci數(shù)據(jù)中序列進(jìn)行blast比對(duì)，選擇1株成功導(dǎo)入細(xì)菌16srrna基因序列的重組單克隆菌株。

(8)吸取200μl(7)中所選取的重組單克隆菌株，加入20ml含有氨芐青霉素濃度為100μgml^-1液體lb培養(yǎng)基中37℃、250rpm條件下培養(yǎng)12-18h。

(9)吸取4ml(8)中菌液，采用試劑盒thermofishergenejetplasmidminiprepkit(貨號(hào)：k0502)進(jìn)行質(zhì)粒提取，獲得細(xì)菌16srrna基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，操作步驟按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程。

(10)細(xì)菌16srrna基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品dna濃度采用nd1000確定其濃度c(ngμl^-1)。

(11)將插入片段與質(zhì)粒載體長(zhǎng)度相加，得到質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品長(zhǎng)度l。

(12)根據(jù)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定濃度c，計(jì)算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)(copiesμl^-1)，計(jì)算公式為(c×6.02×10²³)/(l×660×10³)。

所述的樣品細(xì)菌16srrna基因濃度qpcr測(cè)定包括如下步驟：

(1)將已知濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品通過10倍梯度稀釋，構(gòu)建濃度為10⁹，10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²copiesμl^-1標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)樣；

(2)將土壤樣品dna與10倍梯度稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品一同進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr測(cè)定，獲得ct值。采用的試劑盒為thermofishergreenqpcrsupermix-udgw/rox(貨號(hào)：11744-500)，加樣體系及反應(yīng)條件按說明書操作，測(cè)定儀器為480。

(3)利用統(tǒng)計(jì)學(xué)中的線性回歸方法將10倍梯度稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣的ct值與細(xì)菌16srrna基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)常用對(duì)數(shù)進(jìn)行方程擬合，得到如圖1所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線，所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝41.61-3.40x，該標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為r²＝1.00，其中y為實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)的ct值，x為細(xì)菌16srrna基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的常用對(duì)數(shù)值。

(4)將土壤dna樣品ct值代入(3)中標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算土壤dna樣品16srrna基因濃度。

4)高通量測(cè)序：

(4-1)通過第二代高通量測(cè)序技術(shù)illuminamiseq測(cè)序平臺(tái)測(cè)定土壤dna樣品中的細(xì)菌16srrna基因的種類和測(cè)序條數(shù)。樣品送浙江天科高新技術(shù)發(fā)展有限公司按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行。

(4-2)運(yùn)用qiime(quantitativeinsightsintomicrobialecology，版本：1.9.1)將不同細(xì)菌16srrna基因種類與silva等數(shù)據(jù)庫比對(duì)，獲取細(xì)菌16srrna基因細(xì)菌分類學(xué)信息，包括其界門綱目科屬種的信息，并通過測(cè)序條數(shù)計(jì)算獲得如圖2所示的不同界門綱目科屬種的細(xì)菌16srrna基因的相對(duì)百分比豐度。

5)將步驟3)中細(xì)菌總16srrna基因與步驟4)細(xì)菌群落各分類水平相對(duì)豐度相乘，獲取疊氮化鈉處理土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)絕對(duì)豐度及不同分類水平上細(xì)菌的絕對(duì)豐度。

所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，圖中s0為培養(yǎng)0天的土壤樣品中細(xì)菌門水平絕對(duì)豐度，s28為培養(yǎng)28天的土壤樣品中細(xì)菌門水平絕對(duì)豐度。根據(jù)土壤細(xì)菌高通量絕對(duì)定量方法可得知，土壤樣品經(jīng)過疊氮化鈉處理28天后，土壤細(xì)菌總量由3.01×10⁹cellsg^-1顯著降低至6.62×10⁸cellsg^-1。門水平上，疊氮化鈉對(duì)多數(shù)門水平下的細(xì)菌具有較好的抑制效應(yīng)，均表現(xiàn)為絕對(duì)豐度下降，如圖中所示的酸桿菌門、放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門等。

對(duì)比實(shí)驗(yàn)1

實(shí)驗(yàn)設(shè)置與實(shí)施例1保持一致，具體實(shí)施步驟僅開展實(shí)施例1中的步驟1)、2)、4)，具體操作步驟如下：

1)在土壤中添加0.1％(wt重量比)的疊氮化鈉，于28℃下培養(yǎng)28天，分別取培養(yǎng)到0天和28天的土壤樣品10g，待用；

2)提取土壤dna樣品：

稱取0.25g土壤樣品，本實(shí)例采用的是mobiopowersoil1絕對(duì)定量提取試劑盒，操作步驟如按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程；

3)高通量測(cè)序：

將土壤dna樣品進(jìn)行細(xì)菌16srrna基因擴(kuò)增子高通量測(cè)序(illuminamiseq平臺(tái))，獲得土壤樣品細(xì)菌群落各分類水平(門、綱、目、科、屬)的相對(duì)豐度。本實(shí)例土壤dna樣品送浙江天科高新技術(shù)發(fā)展有限公司進(jìn)行，按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行。

所得結(jié)果為：因?yàn)闆]有通過測(cè)定土壤dna樣品中的細(xì)菌總16srrna基因濃度，因此無法計(jì)算出如實(shí)施例1中的絕對(duì)豐度結(jié)果。如圖2中所示，s0為培養(yǎng)0天的土壤樣品中細(xì)菌門水平相對(duì)豐度，s28為培養(yǎng)28天的土壤樣品中細(xì)菌門水平相對(duì)豐度。相對(duì)豐度結(jié)果表明土壤經(jīng)過疊氮化鈉28天處理后，細(xì)菌門如厚壁菌門、擬桿菌門的相對(duì)豐度明顯增加，與實(shí)施例1中其實(shí)際絕對(duì)豐度的下降明顯不符(圖3)。因此，相對(duì)豐度的表征不能真實(shí)反映出細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)豐度的真實(shí)變化，其結(jié)果可能會(huì)導(dǎo)致得出誤導(dǎo)性結(jié)論。

最后還需注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例。顯然不局限于以上實(shí)施例，根據(jù)環(huán)境以及樣品來源的不同，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。