本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種來源于歐洲花楸的植保素糖基轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物通過次生代謝產(chǎn)生大量非生長發(fā)育所必需的小分子有機(jī)化合物，種類繁多，化學(xué)結(jié)構(gòu)迥異?，F(xiàn)在已知大約有10萬種次生代謝物，包括糖苷、萜類、酚類、黃酮類、香豆素、木脂素、生物堿、甾類、皂苷、多炔類、有機(jī)酸等，許多次生代謝產(chǎn)物都具有重要的藥理活性和經(jīng)濟(jì)價值。次生代謝產(chǎn)物是在結(jié)構(gòu)的基本骨架形成之后，再經(jīng)過羥基化、甲基化、?；蛘呓Y(jié)合小分子等修飾，最終生成各種終產(chǎn)物。糖基化即是一種廣泛存在的化合物修飾方式，也是生物體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)化反應(yīng)——許多代謝產(chǎn)物合成的最后一步，也是非常重要的一步，往往都發(fā)生糖基化反應(yīng)。催化糖基化反應(yīng)的酶即為糖基轉(zhuǎn)移酶，其催化形成的糖苷類化合物結(jié)構(gòu)類型多樣，并具有多種生物活性，是藥物先導(dǎo)的重要來源。

在植物的次生代謝中，有多種類型的糖基轉(zhuǎn)移酶參與其中，目前研究較多的糖基轉(zhuǎn)移酶有植物激素類糖基轉(zhuǎn)移酶、黃酮類糖基轉(zhuǎn)移酶以及萜類糖基轉(zhuǎn)移酶等，而植保素類的糖基轉(zhuǎn)移酶尚未有報道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種來源于歐洲花楸的植保素糖基轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因與應(yīng)用。

本發(fā)明首先要求保護(hù)如下(a)或(b)或(c)所示蛋白質(zhì)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且來源于歐洲花楸并且具有植保素糖基轉(zhuǎn)移酶活性的由序列1衍生的蛋白質(zhì)；

(c)與(a)或(b)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且來源于歐洲花楸并且具有植保素糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。

為了便于所述蛋白質(zhì)的純化，可在所述蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如下表所示的標(biāo)簽。

表：標(biāo)簽的序列

編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna、hnrna或trna等。

在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述核酸分子具體為編碼所述蛋白質(zhì)的基因，所述基因具體可為如下任一所示的dna分子：

1)序列表中序列2所示的dna分子；

2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的dna分子雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的dna分子；

3)與1)或2)限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且編碼所述蛋白質(zhì)的dna分子。

上述嚴(yán)格條件可為用6×ssc，0.5％sds的溶液，在65℃下雜交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。

含上述核酸分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述重組載體可為重組表達(dá)載體，也可為重組克隆載體。

所述重組表達(dá)載體可用現(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建。所述表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mrna加工或基因表達(dá)的dna片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mrna前體的3’端。使用所述基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動子，它們可單獨(dú)使用或與其它的啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是atg起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。

在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述重組載體為在pet-28a(+)載體的多克隆位點(diǎn)(如bamhi和noti)間插入所述基因得到的重組質(zhì)粒。

所述表達(dá)盒由能夠啟動所述基因表達(dá)的啟動子，所述基因，以及轉(zhuǎn)錄終止序列組成。

在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述重組菌為含有所述重組載體的大腸桿菌；所述大腸桿菌具體如transetta(de3)。

所述蛋白質(zhì)在作為糖基轉(zhuǎn)移酶中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述蛋白質(zhì)或所述核酸分子或所述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在制備具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

在上述兩種應(yīng)用中，具體可以植保素作為糖基化的受體底物；更加具體的，所述植保素為聯(lián)苯植保素。

在本發(fā)明中，所述聯(lián)苯植保素具體為如下式i、式ii或式iii所示化合物：

進(jìn)一步，所述蛋白質(zhì)作為糖基轉(zhuǎn)移酶催化式i所示化合物生成式i’所示糖基化產(chǎn)物；所述蛋白質(zhì)作為糖基轉(zhuǎn)移酶催化式ii所示化合物生成式ii’所示糖基化產(chǎn)物；所述蛋白質(zhì)作為糖基轉(zhuǎn)移酶催化式iii所示化合物生成式iii’所示糖基化產(chǎn)物。

其次，本發(fā)明還要求保護(hù)如下(a)或(b)或(c)所示的方法。

(a)制備前文式i’所示糖基化產(chǎn)物的方法，包括如下步驟：以所述蛋白質(zhì)為糖基轉(zhuǎn)移酶，以前文式i所示化合物為糖基化的受體底物，以udp-葡萄糖作為糖基供體，進(jìn)行酶促反應(yīng)。

(b)制備前文中式ii’所示糖基化產(chǎn)物的方法，包括如下步驟：以所述蛋白質(zhì)為糖基轉(zhuǎn)移酶，以前文式ii所示化合物為糖基化的受體底物，以udp-葡萄糖作為糖基供體，進(jìn)行酶促反應(yīng)。

(c)制備前文式iii’所示糖基化產(chǎn)物的方法，包括如下步驟：以所述蛋白質(zhì)為糖基轉(zhuǎn)移酶，以前文式iii所示化合物為糖基化的受體底物，以udp-葡萄糖作為糖基供體，進(jìn)行酶促反應(yīng)。

進(jìn)一步，所述方法中，所述受體底物和所述供體的摩爾比可為1：2；作為糖基轉(zhuǎn)移酶的所述蛋白質(zhì)足量。

在所述方法中，進(jìn)行所述酶促反應(yīng)的溫度為30℃；反應(yīng)時間為16h。

實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的來源于歐洲花楸的序列1所示的蛋白質(zhì)具有植保素糖基轉(zhuǎn)移酶活性，能夠?qū)⑹絠、式ii和式iii所示的三種聯(lián)苯植保素的不同位置的羥基糖基化，進(jìn)而可獲取多樣化的糖苷類化合物。本發(fā)明提供了一種合成聯(lián)苯苷類植保素的方法，對于蘋果亞科植物的抗病害研究以及抗性品種的選育具有重要意義。

附圖說明

圖1為以化合物1和udp-葡萄糖分別作為糖基受體和糖基供體時，saugt5催化糖基化反應(yīng)產(chǎn)物的uplc-uv檢測圖譜。

圖2為以化合物2和udp-葡萄糖分別作為糖基受體和糖基供體時，saugt5催化糖基化反應(yīng)產(chǎn)物的uplc-uv檢測圖譜。

圖3為以化合物3和udp-葡萄糖分別作為糖基受體和糖基供體時，saugt5催化糖基化反應(yīng)產(chǎn)物的uplc-uv檢測圖譜。

圖4為uplc-uv/esi-ms檢測重組糖基轉(zhuǎn)移酶saugt5催化化合物1進(jìn)行糖基化反應(yīng)。(a)saugt5催化化合物1糖基化反應(yīng)，化合物1和產(chǎn)物1a、1b的uplc譜圖與化合物1uv吸收譜圖；(b)產(chǎn)物1a的uv吸收譜圖以及在負(fù)離子模式下ms譜圖，其分子離子峰為m/z407.1289[m-h]^-；(c)產(chǎn)物1b的uv吸收譜圖以及在負(fù)離子模式下ms譜圖，其分子離子峰為m/z407.1288[m-h]^-。

圖5為uplc-uv/esi-ms檢測重組糖基轉(zhuǎn)移酶saugt5催化化合物2進(jìn)行糖基化反應(yīng)。(a)saugt5催化化合物2糖基化反應(yīng)，化合物2和產(chǎn)物2a、2b的uplc譜圖與化合物2uv吸收譜圖；(b)產(chǎn)物2a的uv吸收譜圖以及在負(fù)離子模式下ms譜圖，其分子離子峰為m/z453.1360[m+hcoo]^-；(c)產(chǎn)物2b的uv吸收譜圖以及在負(fù)離子模式下ms譜圖，其分子離子峰為m/z453.1357[m+hcoo]^-。

圖6為uplc-uv/esi-ms檢測重組糖基轉(zhuǎn)移酶saugt5催化化合物3進(jìn)行糖基化反應(yīng)。(a)saugt5催化化合物3糖基化反應(yīng)，化合物3和產(chǎn)物3a和3b的uplc譜圖與(3)uv吸收譜圖；(b)產(chǎn)物3a的uv吸收譜圖以及在負(fù)離子模式下ms譜圖，其分子離子峰為m/z377.1170[m-h]^-；(c)產(chǎn)物3b的uv吸收譜圖以及在負(fù)離子模式下ms譜圖，其分子離子峰為m/z377.1169[m-h]^-。

圖7為重組糖基轉(zhuǎn)移酶saugt5催化底物結(jié)構(gòu)以及對應(yīng)產(chǎn)物的糖基化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

歐洲花楸懸浮細(xì)胞：記載于“黃蕾,肖文娟,楊光等.酵母提取物誘導(dǎo)歐洲花楸懸浮細(xì)胞合成次生代謝產(chǎn)物的機(jī)制探究.中國中藥雜志,2014,39(11):2019-2023”一文，公眾可從申請人處獲得，僅可用于重復(fù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)使用。

實(shí)施例1、歐洲花楸植保素糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆

從歐洲花楸懸浮細(xì)胞中提取總rna，并反轉(zhuǎn)錄得到cdna。以所得cdna為模板，采用引物1和引物2進(jìn)行pcr反應(yīng)。

引物1：5’-gagggatccatgggagacgtaatagtgct-3’；

引物2：5’-gaggcggccgcttatgtaaagctattgacaaagtta-3’。

pcr反應(yīng)體系如下：kod-plus-neo2μl；2mmdntps10μl；25mmmgso46μl；10×pcrbufferforkod-plus-neo10μl；引物1和引物2各3μl；cdna模板2μl；ddh2o補(bǔ)足至100μl。

pcr反應(yīng)條件：94℃10min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，35個循環(huán)；72℃10min；4℃維持。

pcr結(jié)束后對所得pcr產(chǎn)物進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測及測序。測序結(jié)果顯示，pcr產(chǎn)物的序列為“5’-gagggatcc+序列2+gcggccgcctc”。將序列2所示基因命名為saugt5。序列2編碼序列表中序列1所示的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)命名為saugt5。

實(shí)施例2、歐洲花楸植保素糖基轉(zhuǎn)移酶的外源表達(dá)

1、重組表達(dá)載體的構(gòu)建

將實(shí)施例1的pcr產(chǎn)物“5’-gagggatcc+序列2+gcggccgcctc”純化回收后，用限制性內(nèi)切酶bamhi和noti進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物回收后與經(jīng)過同樣雙酶切的pet-28a(+)質(zhì)粒的骨架大片段相連，得到重組質(zhì)粒。

將經(jīng)測序表明，在pet-28a(+)質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)bamhi和noti之間插入序列2所示dna片段后的重組質(zhì)粒命名為pet-28a-ugt5。

2、表達(dá)宿主系統(tǒng)構(gòu)建

將步驟1構(gòu)建好的重組表達(dá)載體pet-28a-ugt5轉(zhuǎn)化到大腸桿菌transetta(de3)感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆進(jìn)行pcr驗(yàn)證后，送測序驗(yàn)證表達(dá)系統(tǒng)的正確性。

3、誘導(dǎo)表達(dá)及目的蛋白saugt5的提取

(a)吸取步驟2經(jīng)測序驗(yàn)證正確的表達(dá)菌株轉(zhuǎn)到含50mg/lkan的200mllb液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至od600到0.6-1.0；

(b)加入適量iptg誘導(dǎo)劑(終濃度約為0.4mm)，30℃，200rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)5h；

(c)200ml菌液，4℃，5000g離心10min，棄菌液，收集菌體；

(d)用預(yù)冷的純水清洗菌液2次，4℃，5000g離心10min，棄菌液，收集菌體；

(e)用預(yù)冷的緩沖液a【配方：tris-hcl(ph7.4，1m)2.5ml；edta(0.5m)100μl；甘油(50％v/v)10μl；pmsf(100mm)500μl；ddh2o36.9ml】重懸(8ml)，用槍頭吸打使菌體溶解；

(f)用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)超聲破碎(30％功率，超聲5s，間隔5s，持續(xù)5min)；

(g)4℃，13000rpm離心15min；

(h)取上清分裝(200μl/管)放置-80℃冰箱備用。

實(shí)驗(yàn)同時設(shè)置了以pet-28a(+)質(zhì)粒替代pet-28a-ugt5的對照，得到空載對照上清。

實(shí)施例3、歐洲花楸植保素糖基轉(zhuǎn)移酶的活性驗(yàn)證

一、實(shí)驗(yàn)方法

1、外源表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性的篩選

在糖基轉(zhuǎn)移酶活性初步篩選中，以saugt5的粗酶液進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)。分別以rhaphiolepsin(化合物1，如式i所示)、2'-hydroxyaucuparin(化合物2，如式ii所示)和noraucuparin(化合物3，如式iii所示)這三種聯(lián)苯植保素為糖基化的受體底物，以udp-葡萄糖作為供體進(jìn)行酶促反應(yīng)。

糖基轉(zhuǎn)移酶活性篩選反應(yīng)體系為：saugt5粗酶液(即實(shí)施例2步驟3(h)中的上清)194μl；udp-葡萄糖(40mm)4μl；受體底物(40mm)2μl。

實(shí)驗(yàn)同時以實(shí)施例2制備的空載對照上清作為對照。

糖基轉(zhuǎn)移酶活性篩選反應(yīng)條件為：在30℃條件下，反應(yīng)16h，加入400μl甲醇終止反應(yīng)，振搖混勻，1,4000g離心20min，取上清過0.22μm濾膜，待測。

2、酶促產(chǎn)物uplc檢測

色譜條件：色譜柱為watersacquityuplcbehc18超高效液相柱(waterscorporation,milford,ma,usa,2.1×100mm,1.7μm)，柱溫35℃。流動相為0.1％甲酸-水溶液(a)-0.1％甲酸-乙腈(b)(％表示體積百分含量)，梯度洗脫程序?yàn)?0-4)min，10％-40％b；(4.0-5.0)min，40％-52％b；(5.0-8.0)min，52％-72％b；(8.0-8.2)min，72％-95％b(％表示體積百分含量)。流速0.5ml/min。進(jìn)樣量：1μl。

3、saugt5催化糖基化放大反應(yīng)以及產(chǎn)物的制備與分離

將saugt5的粗酶液進(jìn)行放大酶促反應(yīng)并制備糖基化產(chǎn)物。反應(yīng)體系為30ml，包括saugt5粗酶液(即實(shí)施例2步驟3(h)中的上清)，udp-葡萄糖(40mm)0.5ml，受體底物(80mm)0.125ml，在30℃水浴鍋中反應(yīng)過夜，用2倍體積乙酸乙酯萃取5次，有機(jī)相加壓蒸干后用約2ml甲醇溶解，過0.22μm濾膜，使用乙腈-水作為流動相進(jìn)行半制備。液相系統(tǒng)：島津制備液相色譜儀lc-20ar；制備柱為：ymc-packods-a(20×250mm,5.0μm)。將分離得到的各產(chǎn)物進(jìn)行高分辨質(zhì)譜以及¹h-nmr，¹³c-nmr，h-hcosy，hsqc和hmbc分析鑒定。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、外源表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性的篩選

在對糖基轉(zhuǎn)移酶活性進(jìn)行初步篩選中，以市場購得的udp-葡萄糖作為糖供體，3種聯(lián)苯植保素(式i、式ii和式iii)作為受體進(jìn)行活性篩選實(shí)驗(yàn)。通過uplc-uv檢測極性變大的糖基化產(chǎn)物，檢測結(jié)果顯示相對于空載，外源表達(dá)saugt5的粗酶液能催化3種聯(lián)苯底物各形成兩種新的產(chǎn)物，如圖1、圖2和圖3所示。

2、重組糖基轉(zhuǎn)移酶saugt5催化糖基化產(chǎn)物的研究

圖4顯示，圖1中的產(chǎn)物1a和1b與受體底物1的uv吸收譜圖基本一致，且1a和1b分子離子峰分別為m/z407.1289[m-h]^-和m/z407.1288[m-h]^-，較受體底物1分子量大162。因此，產(chǎn)物1a和1b分別為在受體底物1的不同羥基位上加上了1分子葡萄糖。

圖5顯示，圖2中的產(chǎn)物2a和2b與受體底物2的uv吸收譜圖基本一致，且2a和2b分子離子峰分別為m/z453.1360[m+hcoo]^-和m/z453.1357[m+hcoo]-，較受體底物2分子量大162。因此，產(chǎn)物2a和2b分別為在受體底物2的不同羥基位上加上了1分子葡萄糖。

圖6顯示，圖3中的產(chǎn)物3a和3b與受體底物3的uv吸收譜圖基本一致，且3a和3b分子離子峰分別為m/z377.1170[m-h]^-和m/z377.1169[m-h]^-，較受體底物3分子量大162。因此，產(chǎn)物3a和3b分別為在受體底物3的不同羥基位上加上了1分子葡萄糖。

3、利用重組糖基轉(zhuǎn)移酶saugt5制備糖基化修飾產(chǎn)物

為了進(jìn)一步確定重組糖基轉(zhuǎn)移酶saugt5催化形成不同化合物的糖基化位置，進(jìn)而系統(tǒng)性評價saugt5的催化功能，本發(fā)明對具有生物活性的saugt5的糖基化產(chǎn)物進(jìn)行了酶促放大反應(yīng)的制備。各催化受體底物的糖基化產(chǎn)物制備條件見表1。所有制備出的化合物均利用ms、¹h-nmr，¹³c-nmr，h-hcosy，hsqc和hmbc進(jìn)行糖基化位置的確認(rèn)，其結(jié)構(gòu)見圖7。

表1糖基化產(chǎn)物制備

糖基化產(chǎn)物的ms，¹h-nmr，¹³c-nmr數(shù)據(jù)具體如下：

rhaphiolepsin5-o-β-d-glucopyranoside(1a)

hr-esi-ms(neg)m/z407.1289[m-h]^-(calcd.forc20h23o9,407.1342),esi-ms(neg)m/z407[m-h]^-,245[m-h-162]^-.¹h-nmr(600mhz,cd3od)δ7.42(2h,dd,j＝8.6,2.0hz,h-2′,6′),7.02(1h,d,j＝1.9hz,h-2),6.85(2h,d,j＝8.6,2.0hz,h-3′,5′),6.80(1h,d,j＝1.9hz,h-2),4.74(1h,d,j＝7.8hz,glc-h-l),3.25-3.83(6h,m,glc-h-2,3,4,5,6),3.81(3h,s,3-och3),3.71(3h,s,4′-och3)；¹³c-nmr(150mhz,cd3od)δ132.2(c-1),105.2(c-2),145.9(c-3),135.3(c-4),148.5(c-5),108.5(c-6),133.4(c-1′),127.7(c-2′,6′),113.7(c-3′,5′),159.0(c-4′),55.5(3-och3),54.3(4′-och3),101.9(glc-c-1),73.6(glc-c-2),77.1(glc-c-3),70.1(glc-c-4),76.3(glc-c-5),61.2(glc-c-6).

2'-hydroxyaucuparin2'-o-β-d-glucopyranoside(2b)

hr-esi-ms(negative)m/z407.1288[m-h]^-(calcd.forc20h23o9,407.1342),esi-ms(neg)m/z407[m-h]^-,245[m-h-162]^-.¹h-nmr(600mhz,cd3od):7.27-7.30(2h,m,h-4′,6′),7.04-7.05(2h,m,h-3′,5′),6.78(2h,s,h-2,6),4.83(1h,d,j＝7.8hz,glc-h-l),3.32-3.94(6h,m,glc-h-2,3,4,5,6),3.78(6h,s,3,5-och3)；¹³c-nmr(150mhz,cdcl3):δ130.7(c-1),107.3(c-2,6),152.4(c-3,5),135.5(c-4),130.7(c-1′),153.9(c-2′),115.7(c-3′),128.6(c-4′),119.5(c-5′),130.2(c-6′),55.7(3,5-och3),101.8(glc-c-1),73.7(glc-c-2),77.0(glc-c-3),69.9(glc-c-4),76.1(glc-c-5),63.0(glc-c-6).

noraucuparin5-o-β-d-glucopyranoside(3a)

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<110>中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所

<120>來源于歐洲花楸的植保素糖基轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因與應(yīng)用

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