本發(fā)明屬于家畜分子生物學
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種多核苷酸序列中的單核苷酸多態(tài)性位點以及檢測所述單核苷酸多態(tài)性位點的方法。
背景技術(shù)：
：豬肉是我國城鄉(xiāng)居民動物性蛋白的主要來源，隨著人們對肉品需要量的增加，對肉質(zhì)的要求也相對提高。而肉質(zhì)主要是由微效多基因控制，并存在主基因效應。分子生物技術(shù)的發(fā)展，尤其是近年來基因組測序技術(shù)的發(fā)展，使得人們可以在dna水平尋找控制肉質(zhì)性狀的主基因或與其緊密連鎖的分子標記，并在育種過程中將其應用于標記輔助選擇，以提高選擇進程，更好地改善豬肉質(zhì)性狀，滿足人們的需要，以獲得更大的經(jīng)濟效益。肉質(zhì)定義最為廣泛接受的是hoffmarm的定義，即肉質(zhì)應該考慮感官屬性、營養(yǎng)價值、技術(shù)質(zhì)量和食品安全。感官屬性指外觀(如色澤)、保水力、硬度，食用品質(zhì)指嫩度、多汁性、風味與滋味、臭味、大理石紋，營養(yǎng)價值指脂肪含量、脂肪酸組成、蛋白質(zhì)含量、其它營養(yǎng)含量，技術(shù)因素指系水力、脂肪硬度、組織分離、氧化穩(wěn)定性，社會質(zhì)量指動物福利、環(huán)境，食品安全指微生物衛(wèi)生(無沙門氏菌、彎曲桿菌)、無殘留(抗生素、重金屬、殺蟲劑)。影響豬肉質(zhì)的因素很多，有遺傳因素和非遺傳因素，從遺傳上對豬肉質(zhì)性狀進行評定和選育是改善豬肉品質(zhì)的關(guān)鍵，肉質(zhì)性狀大多屬于數(shù)量性狀，由微效多基因控制，某些數(shù)量性狀存在主基因效應，大多數(shù)屬于qtl。許多肉質(zhì)性狀只能在動物屠宰后才能測定，所以常規(guī)選育只能寄予同胞或半同胞測驗，這就勢必加大選育成本，且遺傳進展緩慢。肉質(zhì)性狀只能在動物屠宰時才能測定，需昂貴的同胞測驗，因此，利用分子標記進行輔助選擇(mas)控制肉質(zhì)性狀是非常有意義的。分子生物技術(shù)的發(fā)展和豬高密度基因圖譜的構(gòu)建，使育種工作者可在dna水平上尋找影響肉質(zhì)性狀的主基因或與其緊密連鎖的分子標記，理論上這些主基因或分子標記一經(jīng)確認，就可進行標記輔助選擇育種。纖毛的運動是很多單細胞(如衣藻和精子)的馬達，為細胞在水環(huán)境中的定向運動提供動力。它可以撥動表面的液體來發(fā)揮功能。呼吸道上皮細胞纖毛的擺動可以排出呼吸道的灰塵和細菌，如相應基因突變將導致纖毛的運動失活。人的精子鞭毛和輸卵管的纖毛缺陷將導致其生育能力的下降。有研究還表明，纖毛還加強與肉質(zhì)有密切關(guān)系的經(jīng)典wnt信號通路。纖毛軸動力蛋白重鏈2基因(dyneinaxonemalheavychain2，dnah2)位于豬12號染色體，位于人(homosapiens)17p13.1，該基因編碼纖毛軸動力蛋白重鏈2蛋白，由4427個氨基酸組成，其分子量為507698da。該蛋白從n端到c端依次為：動力蛋白莖干，aaa-6，aaa2，aa3，tpr2，aaa4，p-loop-ntpase(此結(jié)構(gòu)中含有三磷酸核苷水解酶，其發(fā)揮作用水解產(chǎn)生能量，帶動微管間相互移動，從而導致纖毛的運動)，stalk，mt(動力蛋白微管結(jié)合莖)，aaa5，重鏈和動力蛋白區(qū)d6等11個區(qū)域。小鼠(musmusculus)11號染色體，大鼠(rattusnorvegicus)10號染色體，豬該基因(genbank收錄號為xm_013981316)預測的cdna長度為7437bp。但是，目前國內(nèi)外關(guān)于豬dnah2基因的相關(guān)研究沒發(fā)現(xiàn)相關(guān)報道。據(jù)此推斷，該基因有可能通過改變豬肌肉中的肌纖維的運動影響失水率，進一步影響肉的品質(zhì)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于尋找dnah2基因的突變位點以及作為豬肉質(zhì)性狀基因多態(tài)性的檢測方法，為標記輔助育種提供一種有用的分子標記。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種豬肉質(zhì)性狀相關(guān)基因dnah2及其在豬標記輔助選擇中的應用，為豬標記輔助選擇提供有用的分子標記。為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種豬肉質(zhì)性狀相關(guān)基因dnah2在豬分子標記輔助選擇中的應用，該豬肉質(zhì)性狀相關(guān)基因dnah2基因的dna序列如序列表seqidno:1所示，在第504bp處有一個c/g的堿基突變，導致pcr-rflp-acci多態(tài)性。上述dnah2基因的多態(tài)性是以豬的基因組dna為模板擴增，擴增片段利用sscp技術(shù)和測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)snp，并利用pcr－rflp進行基因分型，再利用sas軟件通用線性模型(generallinearmodel,glm)分析snp與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)。本發(fā)明制備了檢測seqidno:1所示的dnah2基因片段突變的引物對，所述引物對的序列為：正向引物為5′-tgatgctcgtgagtgaaaga-3′。反向引物為5′-aggactgggtggaggaaat-3′。利用上述制備的與豬肉質(zhì)性狀相關(guān)的分子標記對外來豬種和中國地方品種進行了關(guān)聯(lián)分析的應用，從而完成了本發(fā)明。snp發(fā)現(xiàn)與檢測方法建立：申請人設(shè)計了擴增包含該snp引物，dnah2基因引物擴增的pcr產(chǎn)物經(jīng)過限制性內(nèi)切酶acci酶切后產(chǎn)生3個不同長度大小的片段，分別為1033bp、504bp、529bp。經(jīng)過2％瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示。圖中看到的只有一條電泳條帶的是cc基因型，大小為1033bp；兩條帶的是gg基因型，大小分別為504bp和529bp；三條帶的是gc基因型，大小分別是504bp、529bp和1033bp?；蛐停赓|(zhì)性狀間關(guān)聯(lián)：利用sas軟件中的一般線性模型(generallinearmodel,glm)程序?qū)蛐团c性狀進行關(guān)聯(lián)分析，模型如下為yijkn＝μ+hi+lj+gk+εijkn，yijkn為性狀表型值，μ為總體均數(shù)，hi為豬場效應，lj為年代效應，gk為dnah2基因型不同位點的效應，εijkn為隨機誤差效應，服從正態(tài)分布(0,σ2)。分析表明dnah2基因snp位點對肉質(zhì)性狀的失水率有顯著影響(p<0.05)。本發(fā)明將為豬肉質(zhì)性狀的分子標記，為標記輔助選擇(mas)奠定堅實的基礎(chǔ)，進一步闡明肉質(zhì)性狀的分子機制，將為改善豬肉品質(zhì)提供理論依據(jù)，提高養(yǎng)豬生產(chǎn)經(jīng)濟效益，并指導豬的育種實踐。附圖說明圖1是本發(fā)明的dnah2基因c/g位點的acci酶切電泳結(jié)果。注：m為marker道，1、2、3、4、6、8、9、11、12為cc型，5、10為gg型，7為gc。圖2是豬dnah2基因突變位點的測序峰圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步地解釋，但具體實施并不對本發(fā)明做任何限定。實施例1：pcr-rflp技術(shù)檢測dnah2基因的acci多態(tài)性。引物設(shè)計：利用比較基因組學方法根據(jù)豬的dnah2基因(genbank收錄號為xm_013981316)，在genbank作blast序列比對后篩選出dnah2基因候選snps位點，設(shè)計特異性引物，用這些引物來擴增從豬耳組織提取的基因組dna。引物為：f：5′-tgatgctcgtgagtgaaaga-3′，r：5′-aggactgggtggaggaaat-3′。試驗中所采集的豬耳樣品主要來源于正虹原種豬場和中國地方品種豬種豬場。dnah2基因?qū)嶒灢糠謽悠穪碓从?個豬種共298頭，其中正虹原種豬場大白豬91頭，中國地方品種豬寧鄉(xiāng)豬72頭，沙子嶺豬71頭，桃源黑豬64頭。用剪耳鉗剪取試驗豬小塊耳樣組織裝入滅菌消毒后的1.5mleppendorf管中，加入適量70％的酒精，放于-20℃保存，備用于提取dna。pcr條件：pcr反應體系(總體積20μl)：10×buffer2μl，2mmol/ldntps1.6μl，20mmol/lmgcl21.6μl，taqdna聚合酶(5u/μl)0.4μl，dna模板(100ng/μl)1μl，上下游引物(10pmol/μl)各0.4μl，ddh2o12.6μl。反應程序：94℃預變性5min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃后延伸10min，最后4℃保存。取10μlpcr擴增產(chǎn)物，加2μl溴酚藍上樣緩沖液混勻后，點樣于2％的瓊脂糖凝膠(含0.05％eb)上，然后點6μl100bpdnamarkers作為參照。5v/cm電泳0.5～1.0h。電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察擴增結(jié)果并拍照。將純化后的pcr產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)公司測序。pcr產(chǎn)物的acci酶切：在10μlpcr產(chǎn)物中加入8μl10×內(nèi)切酶緩沖液、0.2μl限制性內(nèi)切酶和2μl雙蒸水，總體積為20.2μl，37℃消化10h。c/g位點用1％瓊脂糖凝膠電泳分析，5v/cm電壓電泳0.5h，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照，酶切結(jié)果如圖1，圖1是本發(fā)明中dnah2基因pcr-rflp的3種基因的cc、cg和gg電泳結(jié)果。圖中m：dna分子量標準(dl100bpladder)。圖2是突變位點的測序峰圖。本發(fā)明以豬dnah2基因作為豬肉質(zhì)性狀的候選基因，以3個地方豬種(寧鄉(xiāng)豬、桃源黑豬和沙子嶺豬)和大白豬為實驗材料，采用pcr-rflp方法對dnah2基因c/g位點的基因頻率、基因型頻率進行檢測，并分析其遺傳結(jié)構(gòu)，分析該基因與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性。實施例2：dnah2基因多態(tài)性在不同豬種中的分布統(tǒng)計dnah2基因g/c突變位點在不同品種豬的基因頻率、基因型頻率，并對其結(jié)果進行適合性卡方檢驗。結(jié)果如表1所示，從表中可看出4個品種豬均存在多態(tài)性，且c基因的等位基因頻率均高于g等位基因頻率，二者相差大小分別為0.2112、0.7746、0.6666、0.0626。由此得知，在大白豬、寧鄉(xiāng)豬、桃源黑豬中，c基因為優(yōu)勢基因，cc基因型為優(yōu)勢基因型。適合性卡方檢驗發(fā)現(xiàn)桃源黑豬的χ2<χ20.05，p>0.05，表明二者處于hardy-weinberg平衡狀態(tài)。大白豬和寧鄉(xiāng)豬的檢驗值χ2>χ20.001，p<0.001，則二者群體處于連鎖不平衡狀態(tài)，且差異極顯著(p<0.01)。表1dnah2基因突變位點基因型頻率和基因頻率注：1.標有*號的數(shù)值顯著差異水平為0.05；標有**號的數(shù)值顯著差異水平為0.001(下同)通過計算統(tǒng)計對于dnah2基因g/c突變位點，各品種豬的遺傳純合度、有效等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量，結(jié)果如下表2。結(jié)果表明，在所選的4個品種豬中，遺傳純合度均高于0.5，其中沙子嶺豬遺傳純合度最高，為0.8，桃源黑豬對低，為0.502。地方品種豬除桃源黑豬外的遺傳純合度均高于外來豬種大白豬。有效等位基因數(shù)是遺傳純合度的倒數(shù)，則沙子嶺豬有效等位基因最低，桃源黑豬反而最高。從多態(tài)信息含量數(shù)據(jù)來看，各品種豬均處于0.5以下，大白豬和桃源黑豬的多態(tài)信息含量在0.25-0.5之間，屬于中度多態(tài)性，該位點遺傳多態(tài)性豐富。而沙子嶺豬和寧鄉(xiāng)豬多態(tài)信息含量均處于0.25以下，表現(xiàn)為低多態(tài)性。表2dnah2基因突變位點在不同品種豬中的遺傳多態(tài)性分析品種遺傳純合度遺傳雜合度有效等位基因數(shù)多態(tài)信息含量大白豬0.52230.47771.91460.3636沙子嶺豬0.80000.20001.25000.1800寧鄉(xiāng)豬0.72220.27781.38470.2392桃源黑豬0.50200.49801.99200.3740實施例3：dnah2基因多態(tài)性與肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析對正虹種豬場72頭大白豬進行屠宰，測定其屠宰率、背膘厚、眼肌面積、肉色等級、大理石紋、ph值、失水率和熟肉率8個肉質(zhì)性狀指標，并對dnah2基因突變位點不同基因型與這些肉質(zhì)性狀指標進行多重比較及顯著性分析，結(jié)果如下表3所示。從表中可看出，屠宰率、肉色等級、大理石紋、ph值和熟肉率不同基因型間不存在差異性(p>0.05)。由背膘厚和眼肌面積來看，cc型與gc型、gg型差異性不顯著(p>0.05)，而gc型與gg型呈顯著性差異(p<0.05)。在失水率方面，gg型均顯著高于cc型和gc型(p<0.05)，而cc型和gc型之間差異不顯著(p>0.05)。表3dnah2基因多態(tài)性與肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析注:同行中不同字母表示差異顯著(p<0.05)。<110>湖南農(nóng)業(yè)大學<120>豬dnah2基因分子標記在肉質(zhì)檢測中的應用<130><160>1<170>patentinversion3.1210>1<211>1033<212>dna<213>豬（susscrofa）<220><221>mutation<400>1tgatgctcgtgagtgaaagagctgcgattggaatggccgttgtcggcctctcaagccagt60gctcttttgctgtgtcctgagggccactggcgaccccgagggaggtggcggacctctgtc120accatgtgcacgtgccaggggtttaactccaaccagttgacttgctgaatcgtttctgtg180gaaaacaagccctaattttcagaagctcctggatgatccagggagctccagttccttgct240gcaaagggactcttgctccaaagactgaagggagatggagttacattaatggggtcatgt300gtgacataatgtgccccatagtgtttcatgaacatgtaatagtgaattaatgaggggggt360gggagagcatgactgagtggctggggacacgtctctgcttcccaaaaccatatggcagcc420ggtctcccaacgttcgaaagctggcagagtgcgtgtagttggaggctccagctctgctca480gggcggtggtaaaagggccaccas(c/g)ctgtcatcccggttcttcctcccaggcctcctggac540acattggtggagatgaatacggtcctggaagacatccagaagtctctggatatgtacttg600gagaccaagcggcagatcttcccccgcttctacttcttgtccaatgacgacctcctggag660attctgggccagtcccgcagcccagaggctgtgcagccacacctcaaaaaatgcttcgac720aacatcaaactgctgcggatgcagaaggtcaacagaggtggccgcgatgggggagggggt780gaagccaaggtgtccagggcctcggaggggaccagggcctcccagcgggagtggctgttg840ggcttcccgactgcctgggacagagtcgcggcgaactggtgctgaggagggagggcgagg900gagcgggaatcacccgccgccgagggctcaggagcctcctgcctccgcaggtcggggggc960ccagcagcaagtgggaagccgcggggatgttctcgggcgacggcgagtatgtcgatttcc1020tccacccagtcct1033當前第1頁12