本發(fā)明涉及一種o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖及制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

殼寡糖是安全無毒、可生物降解、并具有良好生物相容性的天然陽離子多糖，是聚合度低的殼聚糖，擁有殼聚糖的性質(zhì)，并且相對于殼聚糖有更好的生物降解性、良好的水溶性等，在生物醫(yī)用材料方面有廣闊的應(yīng)用前景。

納米控釋系統(tǒng)包括納米粒子和納米膠囊。它們是直徑在10～500nm之間的固態(tài)膠態(tài)粒子，活性組成(藥物、生物活性材料等)通過溶解、包裹作用位于粒子內(nèi)部，或者通過吸附、附著作用于粒子表面。納米級聚合物粒子作為藥物傳遞和控釋的載體，是一種新的藥物控釋系統(tǒng)。它與微米顆粒載體的主要區(qū)別是體積小，并且能夠直接作用于細(xì)胞，因而作為新的藥物載運系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用。正是由于納米控釋系統(tǒng)特有的性質(zhì)，使其在藥物輸送方面具有許多優(yōu)越性。

囊泡是由雙親分子自組裝形成的一種超分子聚集體，它們是由密閉雙分子層所形成的球形的單腔室或多腔室的締合結(jié)構(gòu)，類似于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。根據(jù)囊泡結(jié)構(gòu)的不同，可以分為單腔室囊泡、多腔室囊泡、多層囊泡。由于其結(jié)構(gòu)的特殊性，經(jīng)過多年發(fā)展，囊泡在醫(yī)療領(lǐng)域已經(jīng)有了廣泛的應(yīng)用?，F(xiàn)在囊泡已成為很多科學(xué)領(lǐng)域一種非常有用的研究工具，它在數(shù)學(xué)、理論物理，生物物理、化學(xué)、膠體科學(xué)、生物化學(xué)、生物學(xué)等學(xué)科中也得到了普遍的關(guān)注。卵磷脂等天然囊泡由小分子量的磷脂構(gòu)成，穩(wěn)定性較差，其應(yīng)用受到一定限制。為了獲得穩(wěn)定性好、滲透性可控的囊泡，研究者越來越受到重視對聚合物囊泡的研究。聚合物囊泡由合成或天然改性的雙親性聚合物自組裝構(gòu)成。天然高分子具有獨特的生物相容性等優(yōu)點，由改性的雙親性天然高分子如殼聚糖來自組裝囊泡在藥物載體方面有是有良好的應(yīng)用前景的，聚合物囊泡因為具有穩(wěn)定性好、滲透性可控等優(yōu)點而越來越受到重視，特別是在藥物釋放方面因此在這方面的研究已成為近來的研究熱點。

傳統(tǒng)的自組裝納米泡囊都是以殼聚糖為原料，制備殼聚糖衍生物，但殼聚糖的分子量大，制備的納米泡囊體積大、個數(shù)少、產(chǎn)量低。殼寡糖是由殼聚糖解聚制成，其具有：分子量低、水溶性好、功能作用大、易被人體吸收、生物活性高等優(yōu)勢。殼聚糖的水溶性由脫乙酰度決定，容易將殼聚糖改性成為適于作為制備泡囊的雙親分子，而殼寡糖具有良好的水溶性，因而將殼寡糖作為制備泡囊的雙親分子的研究較少，所以需要提供適于制備泡囊的改性殼寡糖。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一是提供一種o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖，該殼寡糖既具有羧甲基，又具有疏水的長烷基側(cè)鏈，使殼寡糖具備雙親性。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖，其結(jié)構(gòu)式為，

由殼寡糖經(jīng)過改性獲得，所述殼寡糖的數(shù)均分子量為200～3000。

本發(fā)明的目的之二是提供一種o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖的制備方法，能夠使殼寡糖中的羥基羧甲基化，且具有疏水的長烷基側(cè)鏈，使殼寡糖具備雙親性，該方法制備的殼寡糖不但具有抗菌性和保濕性，而且保持了殼寡糖原有良好的成膜性、生物相容性和生物降解等性能。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖的制備方法，采用小分子醛類化合物對殼寡糖的氨基進(jìn)行保護(hù)，再采用氯乙酸將氨基保護(hù)后的殼寡糖的c6位羥基進(jìn)行羧甲基化反應(yīng)，然后將保護(hù)氨基的保護(hù)基脫除得到o-羧甲基殼寡糖，最后采用長鏈脂肪醛將o-羧甲基殼寡糖上氨基的兩個h進(jìn)行烷基化反應(yīng)即得o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖。

通過本發(fā)明的制備路徑能夠制備出o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖，首先，不但具有抗菌性和保濕性，而且保持了殼寡糖原有良好的成膜性、生物相容性和生物降解等性能。其次，該殼寡糖不僅具有羧甲基，還具有長烷基側(cè)鏈，使其具有兩親性，從而為制備性能優(yōu)良的泡囊提供基礎(chǔ)。

本發(fā)明的目的之三是提供一種上述o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖在制備泡囊或藥物緩釋材料中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的之四是提供一種泡囊，采用上述o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖自組織形成。該泡囊體積小于傳統(tǒng)納米泡囊，能穿過組織間隙并被細(xì)胞吸收。

本發(fā)明的目的之五是提供一種上述泡囊的制備方法，將上述o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖溶解于有機溶劑形成有機相，將藥物溶解于水形成水相，將有機相與水相混合，在冰浴調(diào)節(jié)下超聲振動形成油包水乳液(w/o乳液)，去除有機溶劑后超聲振動即得囊泡。

本發(fā)明的目的之六是提供一種上述囊泡或上述o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖在藥物載體領(lǐng)域中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果為：

1)本發(fā)明制備的o-羧甲基-n,n-雙長鏈烷基化殼寡糖是一種類似于卵磷脂的雙親性聚合物，它的結(jié)構(gòu)具有親水的殼寡糖骨架主鏈和羧甲基側(cè)鏈以及疏水的長烷基側(cè)鏈，不但具有抗菌性和保濕性，而且保持了殼寡糖原有良好的成膜性、生物相容性和生物降解等性能。

2)本發(fā)明制備的納米泡囊體積小于傳統(tǒng)納米泡囊，具有超微小體積，能穿過組織間隙并被細(xì)胞吸收，可通過人體最小的毛細(xì)血管，還可通過血腦屏障。這些特有的性質(zhì)使其在藥物和基因輸送方面具有許多優(yōu)越性。

3)本發(fā)明制備的納米泡囊，在相同實驗條件下，相比于傳統(tǒng)泡囊產(chǎn)量更高，且性能優(yōu)異，載藥量大，藥物的釋放速率高。

4)本發(fā)明制備的o-羧甲基-n,n-雙長鏈烷基化殼寡糖自組裝納米泡囊穩(wěn)定性好、滲透性可控、易降解、生物相容性高等優(yōu)點，可作為藥物緩釋材料應(yīng)用于人體，生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣譜的應(yīng)用價值。

附圖說明

構(gòu)成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本申請的進(jìn)一步理解，本申請的示意性實施例及其說明用于解釋本申請，并不構(gòu)成對本申請的不當(dāng)限定。

圖1為b12載藥泡囊的體外藥物釋放曲線；

圖2為胰島素載藥泡囊的體外藥物釋放曲線。

具體實施方式

應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說明都是示例性的，旨在對本申請?zhí)峁┻M(jìn)一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本申請所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語僅是為了描述具體實施方式，而非意圖限制根據(jù)本申請的示例性實施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說明書中使用術(shù)語“包含”和/或“包括”時，其指明存在特征、步驟、操作、器件、組件和/或它們的組合。

本發(fā)明中所述的小分子醛類化合物為主鏈碳數(shù)小于4的脂肪醛或側(cè)鏈碳數(shù)小于3的苯甲醛，例如乙醛、丙醛、對甲氧基苯甲醛、苯甲醛、對硝基苯甲醛、間甲氧基對硝基苯甲醛

本發(fā)明中所述的長鏈脂肪醛為主鏈碳數(shù)為12～24的脂肪醛。

正如背景技術(shù)所介紹的，現(xiàn)有技術(shù)中存在殼寡糖不具備兩親性的不足，為了解決如上的技術(shù)問題，本申請?zhí)岢隽艘环No-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖。

本申請的一種典型實施方式，提供了一種o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖，其結(jié)構(gòu)式為，

由殼寡糖經(jīng)過改性獲得，所述殼寡糖的數(shù)均分子量為200～3000。

本申請?zhí)峁┝艘环No-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖的制備方法，采用小分子醛類化合物對殼寡糖的氨基進(jìn)行保護(hù)，再采用氯乙酸將氨基保護(hù)后的殼寡糖的c6位羥基羧甲基化，然后將保護(hù)氨基的保護(hù)基脫除得到o-羧甲基殼寡糖，最后采用長鏈脂肪醛將o-羧甲基殼寡糖上氨基的兩個h進(jìn)行烷基化反應(yīng)即得o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖。

通過本發(fā)明的制備路徑能夠制備出o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖，首先，不但具有抗菌性和保濕性，而且保持了殼寡糖原有良好的成膜性、生物相容性和生物降解等性能。其次，該殼寡糖不僅具有羧甲基，還具有長烷基側(cè)鏈，使其具有兩親性，從而為制備性能優(yōu)良的泡囊提供基礎(chǔ)。

本申請?zhí)峁┮环N優(yōu)選的殼寡糖的氨基進(jìn)行保護(hù)的方法，其步驟為，將殼寡糖制備成殼寡糖水溶液，將小分子醛類化合物溶于有機溶劑一中制備成醛溶液，將醛溶液加入至殼寡糖混合溶液，加熱反應(yīng)即可完成對殼寡糖氨基的保護(hù)。所述的有機溶劑一為既能夠溶解小分子醛類化合物，又能夠與水互溶的有機物，例如甲醇、乙醇、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)等。由于殼寡糖為水溶性大分子，一般小分子醛類化合物難溶于水，所以需要采用水與有機溶劑一進(jìn)行混合，從而保證殼寡糖與小分子醛類化合物進(jìn)行反應(yīng)。

進(jìn)一步優(yōu)選的，加熱至20～40℃，反應(yīng)3～5h。

為了對氨基的保護(hù)殼寡糖進(jìn)行提純，本申請進(jìn)一步優(yōu)選的，采用乙醇對反應(yīng)后的物料進(jìn)行沉降、洗滌，然后進(jìn)行抽濾、真空干燥。

優(yōu)選的，所述殼寡糖的數(shù)均分子量為200～3000，脫乙酰度為80％～95％，進(jìn)一步優(yōu)選的脫乙酰度為90％～95％。

優(yōu)選的，所述小分子醛類化合物的加入量為：小分子醛類化合物中醛基與殼寡糖中氨基的摩爾比為(3:1)～(1:1)，進(jìn)一步優(yōu)選為(3:1)～(2:1)。

優(yōu)選的，所述羧甲基化反應(yīng)的步驟為，將氨基保護(hù)后的殼寡糖置于異丙醇中在常溫調(diào)節(jié)下進(jìn)行溶脹，再置于冰鹽浴中進(jìn)行冷卻，然后滴加naoh溶液，繼續(xù)溶脹一段時間，溶脹結(jié)束后滴加氯乙酸的異丙醇溶液，加熱進(jìn)行羧甲基化反應(yīng)，至形成均一溶液。由于進(jìn)行氨基保護(hù)后的殼寡糖的溶解性較差，采用上述步驟后會使殼寡糖中的所有的c6位羥基均進(jìn)行羥甲基化反應(yīng)，從而提高了羥甲基化反應(yīng)的效率。

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述naoh溶液中naoh的濃度為50％(質(zhì)量)。

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述羥甲基化反應(yīng)的反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時間為4～6h。

為了將羥甲基化反應(yīng)后的殼寡糖提取出來，進(jìn)一步優(yōu)選的，將羥甲基化反應(yīng)后的溶液調(diào)節(jié)ph至中性，用4倍體積乙醇沉降，再依次進(jìn)行抽濾、洗滌、真空干燥，其中所述洗滌，采用80～100％(體積)的乙醇洗滌3次。

優(yōu)選的，所述氯乙酸的加入量為：氯乙酸的羧酸基團(tuán)與殼寡糖的c6位羥基基團(tuán)的摩爾比為2:1。

本申請優(yōu)選的一種將保護(hù)氨基的保護(hù)基脫除的方法為，將羧甲基化反應(yīng)后的殼寡糖溶于鹽酸的乙醇溶液中，反應(yīng)一段時間即到o-羧甲基殼寡糖。

進(jìn)一步優(yōu)選的，羧甲基化反應(yīng)后的殼寡糖與氯化氫比為160:3(g:mol)。

為了將o-羧甲基殼寡糖提取出來，進(jìn)一步優(yōu)選的，采用丙酮沉淀，抽濾，丙酮洗滌3次以上，真空干燥。

本申請優(yōu)選了一種o-羧甲基殼寡糖制備o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖的方法，將o-羧甲基殼寡糖溶于去離子水中，加入長鏈脂肪醛和相轉(zhuǎn)移催化劑，加熱反應(yīng)后，加入nabh4溶液，繼續(xù)反應(yīng)一段時間；反應(yīng)后再次加入長鏈脂肪醛和相轉(zhuǎn)移催化劑，進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后再加入nabh4溶液，繼續(xù)反應(yīng)一段時間即的o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖。

進(jìn)一步優(yōu)選的，反應(yīng)溫度為45℃，加入長鏈脂肪醛和相轉(zhuǎn)移催化劑后的反應(yīng)時間為4h，加入nabh4溶液后的反應(yīng)時間為2～3h。

進(jìn)一步優(yōu)選的，第一次加入的長鏈脂肪醛與o-羧甲基殼寡糖的氨基摩爾比為4:1，第二次加入的脂肪醛與o-羧甲基殼寡糖的氨基摩爾比為2:1。

進(jìn)一步優(yōu)選的，第一次加入硼氫化鈉的量為第一次加入的長鏈脂肪醛的摩爾量的2倍，第二次加入硼氫化鈉的量為第二次加入的長鏈脂肪醛的摩爾量的2倍。

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述相轉(zhuǎn)移催化劑為與加入長鏈脂肪醛上碳的個數(shù)相等的烷基磺酸鈉，加入的質(zhì)量為第一次加入長鏈脂肪醛質(zhì)量的1～2％。

為了將制備的o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖提取出來，進(jìn)一步優(yōu)選的，先采用乙醇進(jìn)行沉降，抽濾，再依次采用90％(體積)、95％(體積)、100％(體積)的乙醇洗滌，至ph值為中性，真空干燥烘至恒重。

本發(fā)明的工藝路線為：

其中，為殼寡糖，數(shù)均分子量為200～3000，脫乙酰度為80％～95％；r為(ch2)xch3，x為10～22。

本發(fā)明的目的之二是提供一種上述方法制備的o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖。

本發(fā)明的目的之三是提供一種上述o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖在制備泡囊或藥物緩釋材料中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的之四是提供一種泡囊，采用上述o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖自組織形成。該泡囊體積小于傳統(tǒng)納米泡囊，能穿過組織間隙并被細(xì)胞吸收。

本發(fā)明的目的之五是提供一種上述泡囊的制備方法，將上述o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖溶解于有機溶劑二形成有機相，將藥物溶解于水形成水相，將有機相與水相混合，在冰浴調(diào)節(jié)下超聲振動形成油包水乳液(w/o乳液)，去除有機溶劑后超聲振動即得囊泡。所述有機溶劑二為能夠溶解o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖，且不能與水互溶的有機物，如氯仿等。

優(yōu)選的，所述有機相與水相的體積比為3:1。

優(yōu)選的，制備的泡囊的直徑為20～70nm。

本申請所述的藥物為具有一定水溶性的藥物，其溶解度為每100ml水溶解0.1～5g。

本發(fā)明的目的之六是提供一種上述囊泡或上述o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖在藥物載體領(lǐng)域中的應(yīng)用。

為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本申請的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的實施例詳細(xì)說明本申請的技術(shù)方案。

實施例1

(1)n-苯亞甲基殼寡糖的合成

5g的殼寡糖溶于100ml去離子水中，室溫下攪拌充分溶解后加入10ml無水乙醇，稱取6.58g苯甲醛溶于10ml無水乙醇后加入到上述溶液中，攪拌，30℃反應(yīng)4h。4倍體積乙醇沉降，乙醇洗滌二次，抽濾，真空干燥，得到n-苯亞甲基殼寡糖。

(2)o-羧甲基-n-苯亞甲基殼寡糖的合成

稱取4g的(1)中干燥后的產(chǎn)品于20ml異丙醇中常溫溶脹1h后置于冰鹽浴中冷卻2h，緩慢滴加50％的naoh溶液30ml，攪拌均勻，在冰鹽浴中繼續(xù)溶脹2h，緩慢滴加5ml含有3.23g氯乙酸的異丙醇溶液。50℃下水浴攪拌4h以上至形成均相溶液，10％的鹽酸調(diào)ph至中性，4倍體積乙醇沉降，抽濾，用80％、90％、100％的乙醇各洗滌1次，真空干燥至恒重。

(3)o-羧甲基殼寡糖的合成

稱取4g的(2)中干燥后的產(chǎn)品溶于150ml0.5mol/l的鹽酸/乙醇溶液，攪拌反應(yīng)12h。4倍體積丙酮沉淀，抽濾，丙酮洗滌3次以上，真空干燥至恒重。

(4)o-羧甲基-n，n-雙鏈長烷基化殼寡糖的合成

稱取2g(3)中干燥后的產(chǎn)品溶于50ml去離子水中，加入6.73g月桂醛和0.13g十二烷基磺酸鈉45℃攪拌4h，緩慢加入4.6gnabh4的水溶液，繼續(xù)加熱攪拌2小時。重復(fù)上述操作，再次加入3.36g月桂醛和2.3gnabh4的水溶液。4倍體積乙醇沉降，抽濾，依次用90％、95％、100％的乙醇洗滌3次，至ph值為中性，50℃真空干燥烘至恒重。

(5)o-羧甲基-n，n-雙鏈長烷基化殼寡糖自組裝納米泡囊的合成

將24ml含0.2mol/l的o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖的氯仿溶液與8ml含4mg/ml維生素b12的水溶液混合，冰浴超聲形成w/o乳液，減壓蒸發(fā)除去有機溶劑至半固體膠狀。在真空干燥器室溫放置過夜，進(jìn)一步除去剩余的氯仿。在超聲波儀中超聲3min即得泡囊，其平均直徑為27.9nm。所得的泡囊用冷凍離心機分離，除去未包封的藥物。記為樣品1。

實施例2

(1)n-苯亞甲基殼寡糖的合成

5g的殼寡糖溶于100ml去離子水中，室溫下攪拌充分溶解后加入10ml無水乙醇，稱取6.58g苯甲醛溶于10ml無水乙醇后加入到上述溶液中，攪拌，30℃反應(yīng)4h。4倍體積乙醇沉降，乙醇洗滌二次，抽濾，真空干燥，得到n-苯亞甲基殼寡糖。

(2)o-羧甲基-n-苯亞甲基殼寡糖的合成

稱取4g的(1)中干燥后的產(chǎn)品于20ml異丙醇中常溫溶脹1h后置于冰鹽浴中冷卻1h，緩慢滴加50％的naoh溶液30ml，攪拌均勻，在冰鹽浴中繼續(xù)溶脹2h，緩慢滴加5ml含有3.23g氯乙酸的異丙醇溶液。50℃下水浴攪拌4h以上至形成均相溶液，10％的鹽酸調(diào)ph至中性，4倍體積乙醇沉降，抽濾，用80％、90％、100％的乙醇各洗滌1次，真空干燥至恒重。

(3)o-羧甲基殼寡糖的合成

稱取4g的(2)中干燥后的產(chǎn)品溶于150ml0.5mol/l的鹽酸/乙醇溶液，攪拌反應(yīng)12h。4倍體積丙酮沉淀，抽濾，丙酮洗滌3次以上，真空干燥至恒重。

(4)o-羧甲基-n，n-雙鏈長烷基化殼寡糖的合成

稱取2g(3)中干燥后的產(chǎn)品溶于50ml去離子水中，加入7.68g十四醛和0.15g十四烷基磺酸鈉45℃攪拌4h，緩慢加入4.6gnabh4的水溶液，繼續(xù)加熱攪拌2小時。重復(fù)上述操作，再次加入3.84g十四醛和2.3gnabh4的水溶液。4倍體積乙醇沉降，抽濾，依次用90％、95％、100％的乙醇洗滌3次，至ph值為中性，50℃真空干燥烘至恒重。

(5)o-羧甲基-n，n-雙鏈長烷基化殼寡糖自組裝納米泡囊的合成

將24ml含0.2mol/l的o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖的氯仿溶液與8ml含4mg/ml維生素b12的水溶液混合，冰浴超聲形成w/o乳液，減壓蒸發(fā)除去有機溶劑至半固體膠狀。在真空干燥器室溫放置過夜，進(jìn)一步除去剩余的氯仿。在超聲波儀中超聲3min即得泡囊，其平均直徑為42.4nm。所得的泡囊用冷凍離心機分離，除去未包封的藥物。記為樣品2。

實施例3

(1)n-苯亞甲基殼寡糖的合成

5g的殼寡糖溶于100ml去離子水中，室溫下攪拌充分溶解后加入10ml無水乙醇，稱取6.91g苯甲醛溶于10ml無水乙醇后加入到上述溶液中，攪拌，20℃反應(yīng)4h。4倍體積乙醇沉降，乙醇洗滌二次，抽濾，真空干燥，得到n-苯亞甲基殼寡糖。

(2)o-羧甲基-n-苯亞甲基殼寡糖的合成

稱取4g的(1)中干燥后的產(chǎn)品于20ml異丙醇中常溫溶脹1h后置于冰鹽浴中冷卻2h，緩慢滴加50％的naoh溶液30ml，攪拌均勻，在冰鹽浴中繼續(xù)溶脹2h，緩慢滴加5ml含有3.23g氯乙酸的異丙醇溶液。50℃下水浴攪拌4h以上至形成均相溶液，10％的鹽酸調(diào)ph至中性，4倍體積乙醇沉降，抽濾，用80％、90％、100％的乙醇各洗滌1次，真空干燥至恒重。

(3)o-羧甲基殼寡糖的合成

稱取4g的(2)中干燥后的產(chǎn)品溶于150ml0.5mol/l的鹽酸/乙醇溶液，攪拌反應(yīng)12h。4倍體積丙酮沉淀，抽濾，丙酮洗滌3次以上，真空干燥。

(4)o-羧甲基-n，n-雙鏈長烷基化殼寡糖的合成稱取2g(3)中干燥后的產(chǎn)品溶于50ml去離子水中，加入8.77g十六醛和0.17g十六烷基磺酸鈉45℃攪拌4h，緩慢加入4.6gnabh4的水溶液，繼續(xù)加熱攪拌2小時。重復(fù)上述操作，再次加入4.38g十六醛和2.3gnabh4的水溶液。4倍體積乙醇沉降，抽濾，依次用90％、95％、100％的乙醇洗滌3次，至ph值為中性，50℃真空干燥烘至恒重。

(5)o-羧甲基-n，n-雙鏈長烷基化殼寡糖自組裝納米泡囊的合成

將24ml含0.2mol/l的o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖的氯仿溶液與8ml含4mg/ml維生素b12的水溶液混合，冰浴超聲形成w/o乳液，減壓蒸發(fā)除去有機溶劑至半固體膠狀。在真空干燥器室溫放置過夜，進(jìn)一步除去剩余的氯仿。在超聲波儀中超聲3min即得泡囊，其平均直徑為64.5nm。所得的泡囊用冷凍離心機分離，除去未包封的藥物。記為樣品3。

實施例4

(1)n-苯亞甲基殼寡糖的合成

5g的殼寡糖溶于100ml去離子水中，室溫下攪拌充分溶解后加入10ml無水乙醇，稱取6.62g苯甲醛溶于10ml無水乙醇后加入到上述溶液中，攪拌，30℃反應(yīng)4h。4倍體積乙醇沉降，乙醇洗滌二次，抽濾，真空干燥，得到n-苯亞甲基殼寡糖。

(2)o-羧甲基-n-苯亞甲基殼寡糖的合成

稱取4g的(1)中干燥后的產(chǎn)品于20ml異丙醇中常溫溶脹1h后置于冰鹽浴中冷卻2h，緩慢滴加50％的naoh溶液30ml，攪拌均勻，在冰鹽浴中繼續(xù)溶脹2h，緩慢滴加5ml含有3.23g氯乙酸的異丙醇溶液。50℃下水浴攪拌4h以上至形成均相溶液，10％的鹽酸調(diào)ph至中性，4倍體積乙醇沉降，抽濾，用80％、90％、100％的乙醇各洗滌1次，真空干燥至恒重。

(3)o-羧甲基殼寡糖的合成稱取4g的(2)中干燥后的產(chǎn)品溶于150ml0.5mol/l的鹽酸/乙醇溶液，攪拌反應(yīng)12h。4倍體積丙酮沉淀，抽濾，丙酮洗滌3次以上，真空干燥。

(4)o-羧甲基-n，n-雙鏈長烷基化殼寡糖的合成

稱取2g(3)中干燥后的產(chǎn)品溶于50ml去離子水中，加入6.73g月桂醛和0.13g十二烷基磺酸鈉45℃攪拌4h，緩慢加入4.6gnabh4水溶液，繼續(xù)加熱攪拌2小時。重復(fù)上述操作，再次加入3.36g月桂醛和2.3gnabh4水溶液。4倍體積乙醇沉降，抽濾，依次用90％、95％、100％的乙醇洗滌3次，至ph值為中性，50℃真空干燥烘至恒重。

(5)o-羧甲基-n，n-雙鏈長烷基化殼寡糖自組裝納米泡囊的合成

將24ml含0.2mol/l的o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖的氯仿溶液與8ml含4mg/ml胰島素的水溶液混合，冰浴超聲形成w/o乳液，減壓蒸發(fā)除去有機溶劑至半固體膠狀。在真空干燥器室溫放置過夜，進(jìn)一步除去剩余的氯仿。在超聲波儀中超聲3min即得泡囊，其平均直徑為31.3nm。所得的泡囊用冷凍離心機分離，除去未包封的藥物。記為樣品4。

實施例5

(1)n-苯亞甲基殼寡糖的合成

5g的殼寡糖溶于100ml去離子水中，室溫下攪拌充分溶解后加入10ml無水乙醇，稱取6.64g苯甲醛溶于10ml無水乙醇后加入到上述溶液中，攪拌，40℃反應(yīng)4h。4倍體積乙醇沉降，乙醇洗滌二次，抽濾，真空干燥，得到n-苯亞甲基殼寡糖。

(2)o-羧甲基-n-苯亞甲基殼寡糖的合成

稱取4g的(1)中干燥后的產(chǎn)品于20ml異丙醇中常溫溶脹1h后置于冰鹽浴中冷卻1h，緩慢滴加50％的naoh溶液30ml，攪拌均勻，在冰鹽浴中繼續(xù)溶脹2h，緩慢滴加5ml含有3.23g氯乙酸的異丙醇溶液。50℃下水浴攪拌4h以上至形成均相溶液，10％的鹽酸調(diào)ph至中性，4倍體積乙醇沉降，抽濾，用80％、90％、100％的乙醇各洗滌1次，真空干燥至恒重。

(3)o-羧甲基殼寡糖的合成

稱取4g的(2)中干燥后的產(chǎn)品溶于150ml0.5mol/l的鹽酸/乙醇溶液，攪拌反應(yīng)12h。4倍體積丙酮沉淀，抽濾，丙酮洗滌3次以上，真空干燥。

(4)o-羧甲基-n，n-雙鏈長烷基化殼寡糖的合成

稱取2g(3)中干燥后的產(chǎn)品溶于50ml去離子水中，加入7.68g十四醛和0.15g十四烷基磺酸鈉45℃攪拌4h，緩慢加入4.6gnabh4水溶液，繼續(xù)加熱攪拌2小時。重復(fù)上述操作，再次加入3.84g十四醛和2.3gnabh4水溶液。4倍體積乙醇沉降，抽濾，依次用90％、95％、100％的乙醇洗滌3次，至ph值為中性，50℃真空干燥烘至恒重。

(5)o-羧甲基-n，n-雙鏈長烷基化殼寡糖自組裝納米泡囊的合成

將24ml含0.2mol/l的o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖的氯仿溶液與8ml含4mg/ml胰島素的水溶液混合，冰浴超聲形成w/o乳液，減壓蒸發(fā)除去有機溶劑至半固體膠狀。在真空干燥器室溫放置過夜，進(jìn)一步除去剩余的氯仿。在超聲波儀中超聲3min即得泡囊，其平均直徑為46.6nm。所得的泡囊用冷凍離心機分離，除去未包封的藥物。記為樣品5。

實施例6

(1)n-苯亞甲基殼寡糖的合成

5g的殼寡糖溶于100ml去離子水中，室溫下攪拌充分溶解后加入10ml無水乙醇，稱取6.58g苯甲醛溶于10ml無水乙醇后加入到上述溶液中，攪拌，30℃反應(yīng)4h。4倍體積乙醇沉降，乙醇洗滌二次，抽濾，真空干燥，得到n-苯亞甲基殼寡糖。

(2)o-羧甲基-n-苯亞甲基殼寡糖的合成

稱取4g的(1)中干燥后的產(chǎn)品于20ml異丙醇中常溫溶脹1h后置于冰鹽浴中冷卻2h，緩慢滴加50％的naoh溶液30ml，攪拌均勻，在冰鹽浴中繼續(xù)溶脹2h，緩慢滴加5ml含有3.23g氯乙酸的異丙醇溶液。50℃下水浴攪拌4h以上至形成均相溶液，10％的鹽酸調(diào)ph至中性，4倍體積乙醇沉降，抽濾，用80％、90％、100％的乙醇各洗滌1次，真空干燥至恒重。

(3)o-羧甲基殼寡糖的合成

稱取4g的(2)中干燥后的產(chǎn)品溶于150ml0.5mol/l的鹽酸/乙醇溶液，攪拌反應(yīng)12h。4倍體積丙酮沉淀，抽濾，丙酮洗滌3次以上，真空干燥。

(4)o-羧甲基-n，n-雙鏈長烷基化殼寡糖的合成

稱取2g(3)中干燥后的產(chǎn)品溶于50ml去離子水中，加入8.77g十六醛和0.17g十六烷基磺酸鈉45℃攪拌4h，緩慢加入4.6gnabh4水溶液，繼續(xù)加熱攪拌2小時。重復(fù)上述操作，再次加入4.38g十六醛和2.3gnabh4水溶液。4倍體積乙醇沉降，抽濾，依次用90％、95％、100％的乙醇洗滌3次，至ph值為中性，50℃真空干燥烘至恒重。

(5)o-羧甲基-n，n-雙鏈長烷基化殼寡糖自組裝納米泡囊的合成

將24ml含0.2mol/l的o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖的氯仿溶液與8ml含4mg/ml胰島素的水溶液混合，冰浴超聲形成w/o乳液，減壓蒸發(fā)除去有機溶劑至半固體膠狀。在真空干燥器室溫放置過夜，進(jìn)一步除去剩余的氯仿。在超聲波儀中超聲3min即得泡囊，其平均直徑為66.7nm。所得的泡囊用冷凍離心機分離，除去未包封的藥物。記為樣品6。

對比例1

本實施例與實施例1相同，不同之處在于，采用分子量30萬、脫乙酰度90％的殼聚糖制備成o-羧甲基-n，n-十二烷基化殼聚糖納米泡囊，其中溶劑為1％的乙酸水溶液。記為對比樣品1。

對比例2

本實施例與實施例4相同，不同之處在于，采用分子量30萬、脫乙酰度90％的殼聚糖制備成o-羧甲基-n，n-十二烷基化殼聚糖納米泡囊，其中溶劑為1％的乙酸水溶液。記為對比樣品2。

b12載藥泡囊的體外藥物釋放測定

實驗方法：取一定量的b12載藥泡囊放入透析袋中，置于ph＝7的0.2mol/l磷酸鹽緩沖溶液中。每隔一定的時間取出2ml透析液，再補充2ml的新鮮緩沖溶液。取出的溶液經(jīng)分光光度計在361nm波長下測定吸光度。根據(jù)b12的濃度—吸光度關(guān)系曲線確定藥物釋放量，據(jù)此數(shù)據(jù)繪制b12載藥泡囊的釋放量和時間的關(guān)系曲線，如圖1。

由圖1中數(shù)據(jù)可知，殼寡糖基載藥泡囊的體外藥物釋放比殼聚糖基載藥泡囊的體外藥物釋放量大大提高。殼聚糖基泡囊的藥物釋放速率較低，達(dá)到平衡的釋放百分率也較小，這與其微囊的結(jié)構(gòu)較為緊密有關(guān)。而殼寡糖基泡囊正是彌補了這一不足，從而大大提高了藥物釋放速率。相比樣品1-3，隨著脂肪醛基鏈長的增加器藥物釋放速率也有略微降低，這是因為脂肪醛在取代過程中，隨著鏈長的增加其空間位阻增大，使其取代度降低，導(dǎo)致藥物釋放量和釋放速率略有降低。由于囊泡是由雙親分子自組裝形成的一種超分子聚集體，它們是由密閉雙分子層所形成的球形的單腔室或多腔室的締合結(jié)構(gòu)，類似于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，所以其脂肪醛的鏈長也不能太短，太短會無法形成密閉的雙分子層。實驗結(jié)果顯示o-羧甲基-n,n-十二烷基化殼寡糖納米泡囊的藥物緩釋效果最好。

胰島素泡囊的體外藥物釋放測定

實驗方法：胰島素載藥泡囊的體外釋放測定于0.2mol/l的磷酸緩沖溶液中進(jìn)行。取一定量的胰島素載藥泡囊放入透析袋中，置于磷酸緩沖溶液中。每隔一定的時間取出0.2ml緩沖液，再補充0.2ml的新鮮緩沖溶液。取出的溶液用0.2mol/l的醋酸/醋酸鈉緩沖溶液(ph3.6)稀釋至3.2ml，再經(jīng)紫外-可見分光光度計在226nm波長下測定吸光度。根據(jù)胰島素的濃度-吸光度關(guān)系曲線確定藥物的濃度，據(jù)此數(shù)據(jù)繪制泡囊中胰島素的釋放量和時間的關(guān)系曲線，如圖2。

由圖2中數(shù)據(jù)可知，殼寡糖基胰島素載藥泡囊的體外藥物釋放比殼聚糖基胰島素載藥泡囊的體外藥物釋放量大大提高。相比殼聚糖基胰島素載藥泡囊，殼寡糖基胰島素載藥泡囊的釋放有一定的規(guī)律，易于掌控。由于o-羧甲基-n,n-雙鏈長烷基化殼寡糖納米泡囊較小，在體內(nèi)更容易降解，不會對人體帶來傷害。

此外，胰島素的釋放速率比b12稍低，持續(xù)釋放時間為48小時以上，而b12僅為24小時左右。這些性質(zhì)對胰島素載藥泡囊的實際應(yīng)用非常有利。

以上所述僅為本申請的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本申請，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本申請可以有各種更改和變化。凡在本申請的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本申請的保護(hù)范圍之內(nèi)。