本發(fā)明屬于dna提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種花生組織的dna快速提取方法。
背景技術(shù)：
：花生一直是我國傳統(tǒng)的農(nóng)作物種植品種之一，也是主要的油料作物，花生種含有豐富的油酸和亞油酸，營養(yǎng)豐富，由花生制備而成的花生壓榨油是人們的常用的食用油。傳統(tǒng)的花生育種過程為自然雜交、自交或者轉(zhuǎn)基因分子育種，分子育種首先涉及的就是花生dna的提取，轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化體的鑒定篩選。大量的分子育種工作已經(jīng)很繁雜，簡便快速的dna提取方法一直是廣大科研工作者的需求。目前，由于花生組織包括根、莖、葉、種子等，干擾基因組dna的提取的因子也很多，傳統(tǒng)的基因組dna提取方法包括ctab和酚類法，這些方法提取dna過程中，步驟操作繁瑣、耗時，通常ctab法制備提取dna需要數(shù)小時甚至更長的時間，極大的浪費了時間資源。因此，有必要尋求一種快速的dna的快速提取方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供的一種花生組織的dna快速提取方法，解決了傳統(tǒng)的ctab和酚類法提取基因組dna，步驟操作繁瑣、耗時的問題。本發(fā)明目的是提供一種花生組織的dna快速提取方法，包括以下步驟：s1，材料預(yù)處理：采集花生組織，洗凈晾干，交替置于-20℃5min和20℃5min，每個溫度各兩次，再次晾干，得到待測樣品；s2，取待測樣品，加入玻璃珠研磨至粉末狀，然后加入dna提取液研磨，后置于40±1℃條件下水浴30min，然后加入β-巰基乙醇和20g/100ml的sds，65℃水浴加熱20min，離心，收集第一次上清液；其中，1ldna提取貯藏液中含有0.1moltris-hcl、0.1moledta、1.5molnacl、10gctab、ph8.0；使用時，每毫升dna提取貯藏液中加入40μl100mg/ml纖維素酶和40μl50mg/ml脂肪酶，作為dna提取液使用；s3，向第一次上清液中，加入0.8倍體積經(jīng)4℃預(yù)冷的異丙醇，混勻，-20℃放置≥20min的時間，離心，棄上清，收集dna沉淀；s4，在dna沉淀中加入75％乙醇，離心，棄上清，最后置于通風(fēng)處風(fēng)干；s5，風(fēng)干的dna沉淀用te溶解，-20℃保存?zhèn)溆?。?yōu)選的，上述的花生組織的dna快速提取方法，s2中，所述脂肪酶為堿性脂肪酶或者中性脂肪酶。優(yōu)選的，上述的花生組織的dna快速提取方法，s2中，待測樣品、dna提取液、β-巰基乙醇和20g/100ml的sds的比例為1g：2ml：50μl：20μl。優(yōu)選的，上述的花生組織的dna快速提取方法，s2、s4中離心的條件均為4℃、12000rpm離心10min，s3中離心的條件均為4℃、12000rpm離心15min。優(yōu)選的，上述的花生組織的dna快速提取方法，s2與s3之間還包括有機溶劑萃取步驟，具體為：s2中收集第一次上清液后，取第一次上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入等體積的體積比為25:24:1的苯酚:氯仿:異戊醇溶液，在4℃下12000rpm離心10min，收集第二次上清液；然后向第二次上清液中，加入0.8倍體積經(jīng)4℃預(yù)冷的異丙醇。優(yōu)選的，上述的花生組織的dna快速提取方法，s6中，風(fēng)干的dna沉淀用50μlph8.0te溶解，然后加入1μl10ng/μl的rnasea，常溫過夜后置于-20℃保存?zhèn)溆?。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的一種花生組織的dna快速提取方法，具有以下有益效果：1、適用于花生的根、莖、葉、花、種子等不同組織，dna提取液中添加纖維素酶用于溶解植物中纖維素，添加脂肪酶用于溶解樣品中脂肪，尤其是溶解花生種子中脂肪，使dna更容易釋放，提高dna純度；20g/100ml的sds用于裂解細(xì)胞，β-巰基乙醇一方面具有抗氧化效果，另一方面，其與sds聯(lián)合使用，可以沉淀掉蛋白質(zhì)，比單獨使用sds效果更佳，避免蛋白質(zhì)對dna純度的影響。2、傳統(tǒng)ctab方法排除人為操作時間誤差，提取植物dna耗時120min以上，而本發(fā)明的方法取花生組織dna耗時70min左右，耗時短、dna純度高，并且提取過程中不使用苯酚等揮發(fā)性有毒有機溶劑，減少有機溶劑對人體健康的損害，安全性高。附圖說明圖1為花生葉片基因組dna的酶切電泳圖譜；其中，1號泳道均為bamhⅰ酶切結(jié)果，2號泳道為kpnⅰ酶切結(jié)果，3號泳道為pstⅰ酶切結(jié)果，4號泳道為花生葉片基因組dna。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細(xì)說明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明的限制。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中涉及到數(shù)據(jù)范圍的，在該數(shù)據(jù)范圍內(nèi)包括兩個端點的任何數(shù)值均可實現(xiàn)，由于效果和步驟相同，故不贅述。實施例1一種花生組織的dna快速提取方法，包括以下步驟：s1，材料預(yù)處理：采集根、莖、葉、花或者種子等花生組織，洗凈晾干，置于-20℃5min，再置于20℃5min，再置于-20℃5min，再置于20℃5min，最后再次晾干，得到待測樣品。s2，取1g待測樣品置于研磨中，加入玻璃珠研磨至粉末狀，玻璃珠的直徑φ:0.4-0.6mm，然后加入2mldna提取液研磨5-10min，后置于40±1℃條件下水浴30min，然后加入50μlβ-巰基乙醇和20μl20g/100ml的sds，65℃水浴加熱20min，4℃、12000rpm離心10min，收集第一次上清液。其中，1ldna提取貯藏液中含有0.1moltris-hcl、0.1moledta、1.5molnacl、10gctab、ph8.0；使用時，每毫升dna提取貯藏液中加入40μl100mg/ml纖維素酶和40μl50mg/ml堿性脂肪酶，作為dna提取液使用。s3，將第一次上清液轉(zhuǎn)入新的1.5ml離心管中，加入0.8倍體積經(jīng)4℃預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，-20℃放置20min，12000rpm離心15min，棄上清，收集dna沉淀。s4，在dna沉淀中加入75％乙醇600μl，輕搖5min，以清洗dna，12000rpm離心10min，棄上清，重復(fù)清洗步驟1次，最后置于通風(fēng)處風(fēng)干。s5，風(fēng)干的dna沉淀用50μlph8.0te溶解，然后加入1μl10ng/μl的rnasea，常溫過夜后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｎ覀円曰ㄉN子為對象，利用實施例1的方法提取基因組dna，圖1為花生種子基因組dna的酶切電泳圖譜；其中，1號泳道均為bamhⅰ酶切結(jié)果，2號泳道為kpnⅰ酶切結(jié)果，3號泳道為pstⅰ酶切結(jié)果，4號泳道為花生葉片基因組dna。各個泳道均可見清晰條帶，說明本發(fā)明方法提取的dna不會影響后續(xù)酶切、pcr等步驟。取2μl實施例1溶解的dna溶液，在eppendorfbiophotomete型核酸蛋白質(zhì)分析儀上檢測260nm、280nm處的吸收值和dna的濃度，并根據(jù)od260/od280值、od260/od230值來判斷dna的純度，結(jié)果如表1所示。表1結(jié)果顯示，采用實施例1的方法提取花生不同組織的dna均具有較高的純度。表1實施例1花生不同組織提取的dna檢測信息實施例2一種花生組織的dna快速提取方法，包括以下步驟：s1，材料預(yù)處理：采集根、莖、葉、花或者種子等花生組織，洗凈晾干，置于-20℃5min，再置于20℃5min，再置于-20℃5min，再置于20℃5min，最后再次晾干，得到待測樣品。s2，取0.5g待測樣品置于研磨中，加入玻璃珠研磨至粉末狀，玻璃珠的直徑φ:0.4-0.6mm，然后加入1mldna提取液研磨5-10min，后置于40±1℃條件下水浴30min，然后加入25μlβ-巰基乙醇和10μl20g/100ml的sds，65℃水浴加熱20min，4℃、12000rpm離心10min，收集第一次上清液；其中1ldna提取貯藏液中含有0.1moltris-hcl、0.1moledta、1.5molnacl、10gctab、ph8.0；使用時，每毫升dna提取貯藏液中加入40μl100mg/ml纖維素酶和40μl50mg/ml中性脂肪酶，作為dna提取液使用。取第一次上清液轉(zhuǎn)入新的2.0ml的離心管中，加入等體積的體積比為24:1的氯仿:異戊醇溶液，輕搖萃取使蛋白質(zhì)變性，在4℃下12000rpm離心10min，收集第二次上清液。s3，將第二次上清液轉(zhuǎn)入新的1.5ml離心管中，加入0.8倍體積經(jīng)4℃預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，-20℃放置30min，12000rpm離心15min，棄上清，收集dna沉淀。s4，在dna沉淀中加入75％乙醇600μl，輕搖5min，以清洗dna，12000rpm離心10min，棄上清，重復(fù)清洗步驟1次，置于通風(fēng)處風(fēng)干。s5，風(fēng)干的dna沉淀用50μlph8.0te溶解，然后加入1μl10ng/μl的rnasea，常溫過夜后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ?μl實施例2溶解的dna溶液，在eppendorfbiophotomete型核酸蛋白質(zhì)分析儀上檢測260nm、280nm處的吸收值和dna的濃度，并根據(jù)od260/od280值、od260/od230值來判斷dna的純度，結(jié)果參見表2。表2結(jié)果顯示，采用實施例2的方法提取花生不同組織的dna均具有較高的純度。表2實施例2花生不同組織提取的dna檢測信息根莖葉花種子樣品質(zhì)量(g)0.5320.5310.5350.5290.528濃度(ng/μl)400351.4390.7380387.1od260/od2801.801.781.801.771.82od260/od2302.082.112.102.082.05傳統(tǒng)ctab方法排除人為操作時間誤差，提取植物dna耗時120min以上，而本發(fā)明的方法取花生組織dna耗時70min左右，耗時短、dna純度高，并且提取過程中不使用苯酚等揮發(fā)性有毒有機溶劑，減少有機溶劑對人體健康的損害，安全性高。為了驗證本發(fā)明提取方法的效果，我們以花生種子為樣品，設(shè)計了對照一組、對照二組、對照三組和實驗組。其中實驗組采用實施例1的試劑和方法。對照一組與實施例1的方法相似，只是將dna提取液的配方替換為1ldna提取液中含有0.1moltris-hcl、0.1moledta、1.5molnacl、10gctab、ph8.0。對照二組與實施例1的方法相似，只是將“加入50μlβ-巰基乙醇和20μl20g/100ml的sds，65℃水浴加熱20min”改為“加入20μl20g/100ml的sds，65℃水浴加熱20min”。對照三組采用授權(quán)公告號為cn101805730b，名稱為《花生健康組織和病組織簡便快速dna提取方法》中述及的方法。在eppendorfbiophotomete型核酸蛋白質(zhì)分析儀上檢測260nm、280nm處的吸收值和dna的濃度，并根據(jù)od260/od280值來判斷dna的純度，結(jié)果如下：實驗組的od260/od280值為1.82，純度高；對照一組、對照二組的od260/od280值分別為1.45、1.50，說明有不同程度的蛋白質(zhì)污染；對照三組的od260/od280值為1.99，說明rna干擾比實驗組較嚴(yán)重，再者，對照三組中使用了苯酚等揮發(fā)性有毒有機溶劑，且用量較大，危害性較大，不適合大量樣本的dna提取。盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內(nèi)。當(dāng)前第1頁12