本發(fā)明涉及生物技術(shù)和植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種水稻根特異表達(dá)啟動(dòng)子posro4的克隆及利用其進(jìn)行轉(zhuǎn)基因水稻培育的方法。

背景技術(shù)：

高等生物的生長(zhǎng)發(fā)育是不同基因在時(shí)間和空間上有序表達(dá)和協(xié)同作用的過(guò)程。啟動(dòng)子作為一個(gè)重要的調(diào)控元件，通過(guò)和眾多轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合進(jìn)而決定了基因的表達(dá)模式與表達(dá)強(qiáng)度。

通過(guò)分子生物學(xué)以及基因工程的手段去研究和改良作物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有很好的應(yīng)用前景。在近年的時(shí)間里，植物基因工程的研究取得了突飛猛進(jìn)的進(jìn)展，已經(jīng)成為作物遺傳改良和基因功能研究中的一項(xiàng)重要方法和手段。但是在其廣泛運(yùn)用的過(guò)程中也逐漸暴露了一些問(wèn)題。其中之一就是現(xiàn)階段研究中經(jīng)常用組成型表達(dá)啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)目的基因表達(dá)。盡管組成型啟動(dòng)子能高效、非特異性的啟動(dòng)外源基因表達(dá)，但這種外源基因的組成型表達(dá)往往會(huì)造成大量異源蛋白的積累，從而打破植物原有的代謝平衡，妨礙植物的正常生長(zhǎng)。例如生長(zhǎng)遲緩、生長(zhǎng)期長(zhǎng)、甚至不育和死亡。因此，需要尋找更為有效的特異啟動(dòng)子來(lái)調(diào)節(jié)外源基因的表達(dá)。組織特異性啟動(dòng)子使基因的表達(dá)往往只限于某些特定的器官或組織部位，不僅能使目的基因的表達(dá)產(chǎn)物在該器官或組織積累，增加區(qū)域表達(dá)量，同時(shí)可避免植物體內(nèi)不必要的營(yíng)養(yǎng)浪費(fèi)，減少對(duì)植物生長(zhǎng)的副作用，因此具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

水稻作為人類最重要的糧食作物之一，其產(chǎn)量的高低對(duì)人類生活，經(jīng)濟(jì)具有重要的影響，而病蟲害及逆境常常造成水稻大量減產(chǎn)，因此利用基因工程技術(shù)改良水稻，使其獲得抗病、抗蟲能力以及對(duì)環(huán)境的耐受性是提高水稻產(chǎn)量的有效途徑之一。要使外源基因有效、合理、穩(wěn)定的表達(dá),需要有相應(yīng)的啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)。根是水稻吸收水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要器官，根特異表達(dá)系統(tǒng)可用于研究植物的高滲脅迫耐受、植物修復(fù)和根際分泌等。目前在植物中，雖然已有少數(shù)根部特異表達(dá)的啟動(dòng)子被克隆并應(yīng)用于基因功能的研究，但在一個(gè)載體中重復(fù)使用同一個(gè)啟動(dòng)子易造成轉(zhuǎn)基因沉默，由此可見(jiàn)，有必要去發(fā)展更多的水稻等禾谷科作物的根特異型啟動(dòng)子，這對(duì)基礎(chǔ)性研究和遺傳改良應(yīng)用都具有重要的意義。

水稻發(fā)育的最重要的器官并非種子，而是根部，水稻的根毛部位是水稻根系發(fā)揮其作用的最重要的一個(gè)部位，現(xiàn)有的根特異啟動(dòng)子，往往是在整個(gè)水稻的根系發(fā)揮作用，而實(shí)際上，根毛部位和根主干部位所起到的作用還是具有很大差異的，因此，若是能夠提供一種僅在水稻根毛部位表達(dá)，而在其他部位，不表達(dá)的啟動(dòng)子，則可以在減少植物代謝負(fù)擔(dān)的情況下，而實(shí)現(xiàn)對(duì)植物的特異性調(diào)控。

但是目前現(xiàn)有的文獻(xiàn)中，均未見(jiàn)到有根毛特異性表達(dá)啟動(dòng)子的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種水稻根特異表達(dá)基因posro4的啟動(dòng)子，利用該啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)外源基因在水稻根組織中特異表達(dá)。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供水稻根特異表達(dá)基因posro4的啟動(dòng)子，其特征在于，該啟動(dòng)子包含seqidno：1所示的核苷酸序列。

優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子還包括1)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與seqidno：1所示的核苷酸序列雜交、且具有啟動(dòng)子功能的核苷酸序列；或者

2)與1)限定的dna序列與seqidno：1所示的dna序列有至少80％的同源性，且具有啟動(dòng)子功能的核苷酸序列；或者

3)在seqidno：1中所示的核苷酸序列中取代、缺失或添加一個(gè)或插入多個(gè)核苷酸后所獲得的具有啟動(dòng)子功能的核苷酸序列。

另一方面，本發(fā)明提供一組擴(kuò)增所述核苷酸序列的全部或其任意片段的引物對(duì)。

優(yōu)選地，正向引物的核苷酸序列如seqidno：2所示，反向引物的核苷酸序列如seqidno：3所示。

另一方面，本發(fā)明提供一種表達(dá)盒，其特征在于，所述表達(dá)盒包含所述的核苷酸序列。

另一方面，本發(fā)明提供一種重組表達(dá)載體，其特征在于，其為在植物表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)插入所述的核苷酸序列得到的重組質(zhì)粒，所述核苷酸序列連接于載體中待表達(dá)基因序列的上游。

另一方面，本發(fā)明提供一種所述的啟動(dòng)子posro4在驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因在植物中根特異性表達(dá)方面的應(yīng)用。

另一方面，本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)基因水稻培育方法，其特征在于，所述方法包括：(1)獲取權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子posro4；

(2)將步驟(1)中所獲得的啟動(dòng)子連接至具有改善根功能的目標(biāo)基因，獲得重組表達(dá)載體；

(3)將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入目標(biāo)水稻種子；

(4)利用所述目標(biāo)水稻種子進(jìn)行水稻植株的培育。

在一種實(shí)現(xiàn)方式中，所述待表達(dá)的基因?yàn)間us基因。該重組表達(dá)載體為將seqidno.1所示的序列即posro4或啟動(dòng)子posro4。構(gòu)建于pcambia1381中得到的重組表達(dá)載體，本文中稱為pcambia1381-posro4。或者待表達(dá)基因可以為任何對(duì)水稻根組織具有改善功能的基因。

優(yōu)選地，所述待表達(dá)基因?yàn)榫哂懈纳扑靖M織性狀能力的基因。

另一方面，本發(fā)明提供一種所述的水稻根表達(dá)啟動(dòng)子在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括：將所述水稻根表達(dá)啟動(dòng)子連接于載體中待表達(dá)的基因序列上游，從而構(gòu)建重組表達(dá)載體；將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞、組織或器官中進(jìn)行培育。

進(jìn)一步地，所述應(yīng)用用于改良植物生長(zhǎng)特性，特別是根部的生長(zhǎng)及改良。

序列表中seqidno.1所示的dna序列為來(lái)源于日本晴水稻(oryzasativalcv.nipponbare)的根特異性強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng)子，本文中稱為posro4或啟動(dòng)子posro4。具體而言，本申請(qǐng)的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)日本晴水稻基因上游包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在內(nèi)的1972bp的dna序列，具有驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因水稻根中特異性表達(dá)的功能，并且分離克隆、鑒定該dna序列的功能。

技術(shù)效果

本發(fā)明所述的啟動(dòng)子序列可與植物雙元表達(dá)載體連接，用于取代組成型啟動(dòng)子。并且，該啟動(dòng)子序列可以與所需的靶標(biāo)基因連接，構(gòu)建重組植物表達(dá)載體，經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化后，在水稻的根部位(尤其是根毛部位)特異性的驅(qū)動(dòng)靶標(biāo)基因的表達(dá)，增加轉(zhuǎn)基因的效果，避免不必要部位表達(dá)帶來(lái)的物質(zhì)能量浪費(fèi)，有效改良水稻的特性，在實(shí)際應(yīng)用中具有顯著價(jià)值，如通過(guò)該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因在植株根中表達(dá)，可以增強(qiáng)根發(fā)育過(guò)程中對(duì)環(huán)境的抵抗力，比如耐寒性、耐熱性等等；或提高根部吸收營(yíng)養(yǎng)和水分的能力；或提高根部抵抗害蟲的能力，從而培育出理想的轉(zhuǎn)基因植物品種。

附圖說(shuō)明

以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中：

圖1為將啟動(dòng)子posro4構(gòu)建于pcambia1381載體質(zhì)粒中的示意圖，其中圖a為pcambia1381示意圖，圖b為pcambia1381-posro4示意圖，其中示出了利用posro4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)位于其下游的gus基因表達(dá)。

圖2為對(duì)本發(fā)明的pcambia1381-posro4表達(dá)載體進(jìn)行酶切驗(yàn)證的結(jié)果示意圖。

圖3為對(duì)獲得的posro4：：gus轉(zhuǎn)基因水稻植株pcr檢測(cè)電泳圖，m:dnamarker2000；pc，陽(yáng)性質(zhì)粒；nc，陰性對(duì)照植株；1-16:pcambia1381-posro4轉(zhuǎn)基因水稻潮霉素hpt基因pcr產(chǎn)物。

圖4為對(duì)獲得的posro4：：gus轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性水稻植株進(jìn)行g(shù)us染色結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1、根特異表達(dá)啟動(dòng)子的獲得

一、根特異性表達(dá)啟動(dòng)子的獲得及表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)ncbi中提供的水稻品種日本晴(oryzasativalcv.nipponbare)全基因組序列，利用primer5引物設(shè)計(jì)軟件依據(jù)水稻posro4啟動(dòng)子的序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，并根據(jù)選用的載體及靶標(biāo)基因的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物的酶切位點(diǎn)，引物序列如下：

fp：gtcgacgagagcaggacagcgcaactaa

rp:gaattcttttaatctatatttttttcct

其中g(shù)tcgac堿基為限制性內(nèi)切酶sali的識(shí)別位點(diǎn)及保護(hù)堿基；gaattc堿基為限制性內(nèi)切酶ecori的識(shí)別位點(diǎn)及保護(hù)堿基。

采用天根公司(北京)的植物dna提取試劑盒方法提取水稻基因組dna。以基因組dna為模板，利用正向引物、反向引物，采用phusion高保真dna聚合酶，按常規(guī)pcr體系，采用如下擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，循環(huán)35次；最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。回收pcr產(chǎn)物，并按照說(shuō)明書，將其連接至t‐載體中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，在含有卡那霉素的lb培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)24小時(shí)。待長(zhǎng)出單個(gè)克隆后，對(duì)單個(gè)克隆進(jìn)行pcr篩選，挑出陽(yáng)性克隆。提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，送去北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，并與ncbi中該啟動(dòng)子序列比對(duì)。測(cè)序結(jié)果表明，pcr產(chǎn)物具有序列表的序列，末端第1至1796位核苷酸所示的dna片段，并將序列表的序列末端第1至1796位核苷酸所示的dna片段命名為posro4。

用限制性內(nèi)切酶sali和ecori酶切植物表達(dá)載pcambia1381，回收線性化載體骨架(約10657bp)。

將posro4的酶切回收產(chǎn)物與載體骨架線性化片段用progemat4連接酶連接(10×t4ligasebuffer1μl，t4ligase1μl，目的片段2μl，pcambia1381質(zhì)粒大片段6μl)，4℃冰箱過(guò)夜連接16-18h，得到連接產(chǎn)物重組質(zhì)粒，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。經(jīng)過(guò)菌落pcr篩選重組子和雙酶切驗(yàn)證正確的(酶切驗(yàn)證結(jié)果如圖2所示)，送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序并將測(cè)序。測(cè)序正確的重組子，提取其質(zhì)粒，利用凍融法將其轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌eha105中，挑取陽(yáng)性的菌落搖菌，并用甘油保存菌液備用。至此，獲得含有pcambia1381‐posro4表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化。

實(shí)施例2、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化

(1)愈傷組織誘導(dǎo)消毒后的種子用無(wú)菌水在30℃黑暗條件下浸泡過(guò)夜，用解剖刀將胚剝下置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。每皿(規(guī)格為100×25mm的一次性塑料培養(yǎng)皿，內(nèi)含50ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基)均勻放置12個(gè)胚，在30℃黑暗條件下放置2～3周誘導(dǎo)愈傷組織，至長(zhǎng)出淡黃色顆粒狀愈傷。

(2)預(yù)培養(yǎng)從誘導(dǎo)培養(yǎng)基上挑選顆粒狀、不帶病斑的愈傷組織置于新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，于30℃黑暗條件下培養(yǎng)3～5d。

(3)侵染及共培養(yǎng)將預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)移至50ml無(wú)菌管中，加入表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液浸泡20min，倒出菌液，并用無(wú)菌濾紙將殘余菌液吸干。后將愈傷均勻撒在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，于23℃黑暗條件下培養(yǎng)2～3d。

(4)恢復(fù)將共培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至恢復(fù)培養(yǎng)基上(愈傷之間盡量避免重疊)。23℃黑暗培養(yǎng)3～5d。

(5)篩選從篩選培養(yǎng)基上挑選不帶菌斑顏色鮮亮呈淡黃色顆粒狀的抗性胚性愈傷組織，每皿30粒接種于篩選培養(yǎng)基，30℃黑暗培養(yǎng)2～3周，至長(zhǎng)出新的抗性顆粒狀愈傷。

(6)分化每一轉(zhuǎn)化事件(篩選時(shí)由一粒愈傷組織繁殖產(chǎn)生的所有愈傷組織)挑選三個(gè)獨(dú)立的胚性愈傷到分化培養(yǎng)基某一區(qū)域，30℃光照培養(yǎng)室(16h光照/8h黑暗)條件下培養(yǎng)3～4周，待幼苗長(zhǎng)出。

(7)生根每一區(qū)域挑選兩棵健壯的幼苗移栽至生根培養(yǎng)基，30℃組織培養(yǎng)室光周期(16h光照/8h黑暗)培養(yǎng)三周左右，進(jìn)行鑒定并移栽至田間。

實(shí)施例3、轉(zhuǎn)基因水稻苗中啟動(dòng)子的特異表達(dá)

按照天根試劑盒的方法，提取實(shí)施例2轉(zhuǎn)化了pcambia1381-posro4表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因水稻葉片的dna，用潮霉素基因hpt檢測(cè)引物進(jìn)行擴(kuò)增，挑出陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果如圖3所示。

選取轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的組織器官，即根、莖、葉、葉鞘、花和種子分別進(jìn)行g(shù)us染色(50ml0.5m磷酸緩沖液(ph7.0)，50μl100mm鐵氰化鉀k3fe(cn)6，50μl100mm亞鐵氰化鉀k4〔fe(cn)6〕·3h2o，1ml0.5medta，250μl1mg/mlx-gluc)。將各組織分別浸于gus染色液中，37℃過(guò)夜24小時(shí)。經(jīng)75％乙醇脫色后，在體視鏡下觀察并記錄gus染色的結(jié)果。結(jié)果如圖4所示(標(biāo)尺＝0.5cm)，在含有posro4：：gus轉(zhuǎn)基因水稻植株中，只有根中有明顯的藍(lán)色，而在莖、葉、葉鞘、花和種子中沒(méi)有著色。這表明posro4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gus基因只在根部表達(dá)，由此說(shuō)明，posro4啟動(dòng)子是根部特異表達(dá)啟動(dòng)子。

此外，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，從圖中的深淺度對(duì)比可以看出，并且通過(guò)各部位表達(dá)量的歸一化數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比也可以得出，啟動(dòng)子在根毛部位的表達(dá)強(qiáng)度要比根其他部位表達(dá)強(qiáng)度高5倍以上，也就是說(shuō)，本發(fā)明的啟動(dòng)子是一種在根尖的根毛部位具有特異性強(qiáng)表達(dá)的啟動(dòng)子，而根毛是根更新?lián)Q代和生長(zhǎng)最重要的器官，本發(fā)明的啟動(dòng)子在根毛部位的特異性強(qiáng)表達(dá)意義重大。

以上對(duì)本發(fā)明具體實(shí)施方式的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍。

序列表

<110>安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所

<120>水稻根特異表達(dá)啟動(dòng)子posro4及相應(yīng)水稻培育方法

<130>hci20170109

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1972

<212>dna

<213>根特異表達(dá)啟動(dòng)子

<400>1:

gagagcaggacagcgcaactaatctctgaaaaattagtggctaggagccttggatcatag60

caaaaaagtgctaacaactgcactataaaatgcgtgcctcgcgagtcacaaaattggctg120

ttgtcagagaatatgaaattgcagaagattcttgcaattttcctgttaagtgcatttctg180

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ttcacttacatggattaaaagaatgttaggtgctagcgaaatactagtggagtaattcac300

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aatgtagaaagtgcagtttgaagacatccagtataacctcactgtatctagcgaagatat840

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agagacctctccacacttatcagagtaataaggaaaaaaatatagattaaaa1972

<210>2

<211>28

<212>dna

<213>正向引物

<400>2:

gtcgacgagagcaggacagcgcaactaa28

<210>3

<211>28

<212>dna

<213>反向引物

<400>3:

gaattcttttaatctatatttttttcct28