本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種頭孢拉定合成酶突變體及其編碼基因，特別涉及大腸桿菌青霉素g?；附M合突變體、編碼基因及其在合成頭孢拉定中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：半合成β-內(nèi)酰胺類抗生素是醫(yī)藥行業(yè)中使用最廣泛的抗生素，每年產(chǎn)量達(dá)3萬噸，年銷售額超過150億美元，占整個(gè)抗生素市場(chǎng)的65％，其中頭孢菌素類占比約2/3。與此同時(shí)，用于合成β-內(nèi)酰胺類抗生素及β-內(nèi)酰胺母核的青霉素g?；傅挠昧恳哺哌_(dá)1000～3000萬噸(h,m,grulichm,etal.currentstateandperspectivesofpenicillingacylase-basedbiocatalyses.appliedmicrobiologyandbiotechnology,2014,98(7):2867-2879)。頭孢拉定是美國施貴寶制藥公司于1972年研究成功的第一代半合成頭孢類抗生素，1977年首次在日本上市，也稱先鋒霉素vi，因其臨床使用中的具有很多優(yōu)點(diǎn)在我國占據(jù)很大市場(chǎng)。頭孢拉定的合成方法包括化學(xué)法和酶法。目前工業(yè)生產(chǎn)中多采用化學(xué)法，尤其是混合酸酐法來制備頭孢拉定?；瘜W(xué)法生產(chǎn)頭孢拉定的過程中存在著活化、縮合、基團(tuán)保護(hù)與去保護(hù)等多個(gè)步驟，合成過程繁瑣，反應(yīng)條件苛刻，產(chǎn)生大量三廢。酶法合成頭孢拉定則工藝簡單，反應(yīng)條件溫和，生產(chǎn)周期短，并且綠色環(huán)保(芮菊，張?bào)w磊.酶法合成7-aca及頭孢菌素類抗生素的研究進(jìn)展.中國藥學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)暨中國藥師周.2008:348-348)。酶法合成頭孢拉定如圖1所示。目前報(bào)道的青霉素g?；讣捌渫蛔凅w合成頭孢拉定的收率不夠高，酶法未能工業(yè)化。但隨著環(huán)保要求越來越高，開發(fā)高質(zhì)量的頭孢拉定合成酶顯得尤為重要和迫切。目前酶法合成頭孢拉定的工藝主要是，利用固定的青霉素g?；讣捌渫蛔凅w催化二氫苯甘氨酸甲酯(2,5-dihydrophenylglycinemethylester,dhme)與7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸(7-aminodesacetoxycephalosporanicacid,7-adca)縮合生成頭孢拉定(cephradine)和甲醇(yeshu-xiang,xucheng-miao,wangjia-bing.synthesisofcephradinewiththeimmobilizedpenicillinacylase.chinesejournalofpharmaceuticals,2007,38:619-620)。上述反應(yīng)是動(dòng)力學(xué)控制的過程，除合成反應(yīng)外，還有頭孢拉定水解和dhme水解兩個(gè)反應(yīng)，如圖2所示。在動(dòng)力學(xué)控制的合成反應(yīng)中，有兩個(gè)參數(shù)非常重要。第一個(gè)參數(shù)是vs/vh，即初始合成水解比，反映的是在一定反應(yīng)條件下，酶對(duì)合成與水解反應(yīng)的傾向性。vs/vh越大越好，越大說明越有利于合成頭孢拉定，反之則傾向于水解生成二氫苯甘氨酸(2,5-dihydrophenylglycine,dhpg)。另外一個(gè)參數(shù)是α，為酶催化水解頭孢拉定的催化效率(kcat/km)cephradine與水解dhme的催化效率(kcat/km)dhme之比。α越小越好，α越小表明酶越不容易水解產(chǎn)物頭孢拉定，從而有利于頭孢拉定的積累，否則合成得到的頭孢拉定又很快水解掉，導(dǎo)致頭孢拉定的總收率低。工業(yè)化要求vs/vh大于10，α小于0.1，這樣有利于底物7-adca和dhme盡可能地轉(zhuǎn)化成頭孢拉定，減少水解產(chǎn)物的生成(wynandb.l.alkema,anne-jandijkhuis,erikdevriesanddickb.janssen.theroleofhydrophobicactive-siteresiduesinsubstratespecificityandacyltransferactivityofpenicillinacylase.europeanjournalofbiochemistry,2002,269:2093–2100)。。天然青霉素g?；杆馀c合成頭孢拉定的活性較高，但合成頭孢拉定的vs/vh很低，而α很高。雖然目前有關(guān)酶法合成β-內(nèi)酰胺類抗生素的報(bào)道較多，但研究主要集中在氨芐西林、阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢羥氨芐以及頭孢克洛等幾種抗生素上(h,m,grulichm,kyslíkp.currentstateandperspectivesofpenicillingacylase-basedbiocatalyses.appliedmicrobiologyandbiotechnology,2014,98:2867–2879)。利用青霉素g酰化酶及其突變體合成頭孢拉定的相關(guān)報(bào)道較少。目前只有專利wo2005/003367、wo2008/110527和wo2011/073166報(bào)道了利用青霉素g?；竼吸c(diǎn)突變體βf24a合成頭孢拉定時(shí)，在相同反應(yīng)條件下其vs/vh比野生型酶高，但并沒有基于βf24a實(shí)現(xiàn)酶法合成頭孢拉定的工業(yè)化報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是在大腸桿菌天然青霉素g?；讣皢吸c(diǎn)突變?chǔ)耭24a基礎(chǔ)上，提高合成頭孢拉定vs/vh與降低α的組合突變。本發(fā)明首先要求保護(hù)如下(a)或(b)或(c)所示的蛋白質(zhì)：(a)將大腸桿菌天然青霉素g?；傅摩骆湹牡?4位苯丙氨酸替換為丙氨酸，β鏈的第67位絲氨酸替換為丙氨酸后得到的；(b)將大腸桿菌天然青霉素g?；傅摩伶湹牡?42位甲硫氨酸替換為亮氨酸，β鏈的第24位苯丙氨酸替換為丙氨酸，β鏈的第67位絲氨酸替換為丙氨酸后得到的；(c)將(a)或(b)所限定的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有合成頭孢拉定能力的由(a)或(b)衍生的蛋白質(zhì)。進(jìn)一步，所述蛋白質(zhì)為如下(a)或(b)或(c)：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)(pga_m1)；(b)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)(pga_m2)；(c)將序列表中序列2或序列4的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有合成頭孢拉定能力的由(a)或(b)衍生的蛋白質(zhì)。其中，序列表中序列2所示的蛋白pga_m1有846個(gè)氨基酸殘基，第1～26位為信號(hào)肽，第27～235位為pga_m1的α鏈、第236-289位為連接肽、第290-846位為pga_m1的β鏈。序列表中序列4所示的蛋白pga_m2有846個(gè)氨基酸殘基，第1～26位為信號(hào)肽，第27-235位為pga_m2的α鏈、第236-289位為連接肽、第290-846位為pga_m2的β鏈。蛋白質(zhì)pga_m1的具體示意圖如圖3所示，pga_m2的具體示意圖與之相同。為了便于所述蛋白質(zhì)的純化，可在所述蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如下表所示的標(biāo)簽。表：標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列poly-arg5-6(通常為5個(gè))rrrrrpoly-his2-10(通常為6個(gè))hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna、hnrna或trna等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述核酸分子具體為編碼所述蛋白質(zhì)的基因，所述基因具體可為如下任一所示的dna分子：1)序列表中序列1所示的dna分子；2)序列表中序列3所示的dna分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的dna分子雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的dna分子；4)與1)或2)或3)限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且編碼所述蛋白質(zhì)的dna分子。上述嚴(yán)格條件可為用6×ssc，0.5％sds的溶液，在65℃下雜交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。其中，序列表中的序列1由2538個(gè)堿基組成，其開放閱讀框架(orf)為第1-2538位堿基，編碼具有序列表中序列2的氨基酸序列的蛋白，其中第79-705位堿基編碼pga_m1的α鏈；第868-2538位堿基編碼pga_m1的β鏈。序列表中的序列3由2538個(gè)堿基組成，其開放閱讀框架(orf)為第1-2538位堿基，編碼具有序列表中序列4的氨基酸序列的蛋白，其中第79-705位堿基編碼pga_m2的α鏈；第868-2538位堿基編碼pga_m2的β鏈。含上述核酸分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組載體可為重組表達(dá)載體，也可為重組克隆載體。所述重組表達(dá)載體可用現(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建。所述表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mrna加工或基因表達(dá)的dna片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mrna前體的3’端。使用所述基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，它們可單獨(dú)使用或與其它的啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是atg起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述重組載體為在pet28a(+)載體的多克隆位點(diǎn)間插入所述基因得到的重組質(zhì)粒。所述表達(dá)盒由能夠啟動(dòng)所述基因表達(dá)的啟動(dòng)子，所述基因，以及轉(zhuǎn)錄終止序列組成。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述重組菌為含有所述重組載體的大腸桿菌；所述大腸桿菌具體如bl21(de3)。所述蛋白質(zhì)在作為青霉素g酰化酶中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述蛋白質(zhì)在如下任一中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：(a1)作為青霉素g酰化酶催化二氫苯甘氨酸甲酯與7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸縮合生成頭孢拉定的動(dòng)力學(xué)控制合成反應(yīng)中提高vs/vh；(a2)作為青霉素g酰化酶催化二氫苯甘氨酸甲酯與7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸縮合生成頭孢拉定的動(dòng)力學(xué)控制合成反應(yīng)中降低α。所述蛋白質(zhì)或所述核酸分子或所述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在如下任一中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：(b1)制備具有青霉素g?；富钚缘漠a(chǎn)品；(b2)制備頭孢拉定或其他β-內(nèi)酰胺類抗生素。本發(fā)明還保護(hù)一種制備頭孢拉定的方法。本發(fā)明所提供的制備頭孢拉定的方法，具體可包括步驟：制備所述蛋白質(zhì)；以所述蛋白質(zhì)為青霉素g酰化酶催化二氫苯甘氨酸甲酯與7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸縮合生成頭孢拉定。其中，制備所述蛋白質(zhì)的方法包括如下步驟：將編碼所述蛋白質(zhì)的編碼基因?qū)氪竽c桿菌后，培養(yǎng)重組菌，并加入終濃度為0.5mm的iptg，在20℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)14h。本發(fā)明還保護(hù)一種在青霉素g?；复呋浔礁拾彼峒柞ヅc7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸縮合生成頭孢拉定的動(dòng)力學(xué)控制合成反應(yīng)中提高vs/vh和/或降低α的方法。本發(fā)明所提供的在青霉素g?；复呋浔礁拾彼峒柞ヅc7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸縮合生成頭孢拉定的動(dòng)力學(xué)控制合成反應(yīng)中提高vs/vh和/或降低α的方法，其中以所述蛋白質(zhì)為青霉素g?；复呋浔礁拾彼峒柞ヅc7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸縮合生成頭孢拉定。上述出現(xiàn)的所述vs/vh為初始合成水解比。所述vs/vh反映的是在一定反應(yīng)條件下，酶對(duì)合成與水解反應(yīng)的傾向性。vs/vh越大越好，越大說明越有利于合成頭孢拉定，反之則傾向于水解生成二氫苯甘氨酸(2,5-dihydrophenylglycine,dhpg)。上述出現(xiàn)的所述α為酶催化水解頭孢拉定的催化效率(kcat/km)cephradine與水解dhme的催化效率(kcat/km)dhme之比。α越小越好，α越小表明酶越不容易水解產(chǎn)物頭孢拉定，從而有利于頭孢拉定的積累，否則合成得到的頭孢拉定又很快水解掉，導(dǎo)致頭孢拉定的總收率低。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)本發(fā)明中青霉素g?；傅膬蓚€(gè)突變體pga_m1、pga_m2表達(dá)水平高，可在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)高水平表達(dá)；(2)本發(fā)明中青霉素g?；傅膬蓚€(gè)突變體之一pga_m1與其野生型酶相比，vs/vh從1.23提高到7.19，同時(shí)α從6.14降低到0.31，合成頭孢拉定的酶活力(0～30分鐘內(nèi))從0.59u/mg提高到0.77u/mg(1u為1個(gè)酶活力單位，是指在本實(shí)驗(yàn)測(cè)定條件下在1分鐘內(nèi)合成出1微摩爾頭孢拉定的酶量，下同)；(3)本發(fā)明中青霉素g酰化酶的兩個(gè)突變體之一pga_m1與突變體βf24a相比vs/vh從1.75提高到7.19，同時(shí)α從1.72降低到0.31，合成頭孢拉定的酶活力(0～30分鐘內(nèi))從0.54u/mg提高到0.77u/mg；(4)本發(fā)明中青霉素g酰化酶的兩個(gè)突變體之一pga_m2與野生型酶相比，vs/vh從1.23提高到14.42，同時(shí)α從6.14降低到0.51，合成頭孢拉定的酶活力(0～30分鐘內(nèi))從0.59u/mg提高到0.87u/mg；(5)本發(fā)明中青霉素g?；傅膬蓚€(gè)突變體之一pga_m2與突變體βf24a相比，vs/vh從1.75提高到14.42，同時(shí)α從1.72降低到0.51，合成頭孢拉定的酶活力(0～30分鐘內(nèi))從0.54u/mg提高到0.87u/mg；(6)本發(fā)明pga_m1與pga_m2均具較高的合成頭孢拉定的活性和vs/vh以及較低的α，為酶法合成頭孢拉定的工業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。附圖說明圖1為酶催化dhme和7-adca生成頭孢拉定和甲醇的反應(yīng)式。圖2為動(dòng)力學(xué)控制的頭孢拉定合成過程。當(dāng)dhme與酶作用形成酰化態(tài)酶后，可以有兩種去向，7-adca親核進(jìn)攻合成得到頭孢拉定，水分子親核進(jìn)攻水解生成dhpg。頭孢拉定也能水解生成dhpg與7-adca。圖3為本發(fā)明提供的青霉素g?；竿蛔凅wpet28a-pga_m1、pet28a-pga_m2構(gòu)成示意圖，均由四部分組成。分別為：(1)信號(hào)肽，包含pga_m1、pga_m2上第1-26位的26個(gè)氨基酸殘基；(2)酶突變體α鏈的肽段，包含pga_m1、pga_m2上27-235位的209個(gè)氨基酸殘基；(3)連接肽段，包含pga_m1、pga_m2上236-289位的54個(gè)氨基酸殘基；(4)酶突變體β鏈的肽段，包含pga_m1、pga_m2上290-846位的557個(gè)氨基酸殘基。圖4為hplc檢測(cè)青霉素g?；竿蛔凅wpga_m1水解頭孢拉定和dhme反應(yīng)后的樣品圖譜。其中圖(a)為頭孢拉定的水解，(b)為dhme的水解。圖中cephradine即為頭孢拉定。圖5為hplc檢測(cè)青霉素g?；竿蛔凅wpga_m1合成頭孢拉定反應(yīng)后的樣品色譜圖；其中，(a)為含有失活目的蛋白的頭孢拉定合成空白實(shí)驗(yàn)；(b)為含有目的蛋白的樣品反應(yīng)20小時(shí)后的圖譜?？梢钥吹綀D譜(a)中在15.0min附近基本沒有合成產(chǎn)物頭孢拉定的生成，而在4.0min左右出現(xiàn)巨大的7-adca的峰；圖譜(b)中在15.0min附近有明顯的合成產(chǎn)物頭孢拉定的生成，同時(shí)在4.0min左右7-adca的峰面積和峰高有明顯降低，說明產(chǎn)物頭孢拉定確實(shí)由底物7-adca轉(zhuǎn)化生成。圖中cephradine即為頭孢拉定。圖6為hplc檢測(cè)青霉素g?；竿蛔凅wpga_m2合成頭孢拉定反應(yīng)后的樣品色譜圖；其中，(a)為含有失活目的蛋白的頭孢拉定合成空白實(shí)驗(yàn)；(b)為含有目的蛋白的樣品反應(yīng)20小時(shí)后的圖譜?？梢钥吹綀D譜(a)中在15.0min附近基本沒有合成產(chǎn)物頭孢拉定的生成，而在4.0min左右出現(xiàn)巨大的7-adca的峰；圖譜(b)中在15.0min附近有明顯的合成產(chǎn)物頭孢拉定的生成，同時(shí)在4.0min左右7-adca的峰面積和峰高有明顯降低，說明產(chǎn)物頭孢拉定確實(shí)由底物7-adca轉(zhuǎn)化生成。并且與圖5對(duì)比可以看出，在相同的條件下，圖6(b)中頭孢拉定的峰面積更大。圖中cephradine即為頭孢拉定。圖7為青霉素g?；敢吧兔?wt)、突變體βf24a、突變pga_m1和突變pga_m2在5小時(shí)反應(yīng)時(shí)間內(nèi)合成得到的頭孢拉定與水解得到的dhpg的濃度變化。其中，wt組的酶濃度為0.18μm；突變體βf24a組的酶濃度為0.13μm；突變體pga_m1組的酶濃度為0.42μm；突變體pga_m2組的酶濃度為0.35μm?？梢钥闯觯?)wt反應(yīng)中，5小時(shí)后頭孢拉定濃度曲線已經(jīng)走平，但dhpg濃度仍在升高，且超過頭孢拉定；2)突變體βf24a反應(yīng)中，頭孢拉定和dhpg的濃度都在上升，且dhpg的濃度在不斷接近頭孢拉定；3)和4)突變體pga_m1和pga_m2的反應(yīng)中，頭孢拉定的濃度遠(yuǎn)高于dhpg的濃度，說明突變體pga_m1和pga_m2合成頭孢拉定的vs/vh高，比單點(diǎn)突變?chǔ)耭24a更好。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、青霉素g?；竿蛔凅w的制備純化一、青霉素g?；竿蛔凅w編碼基因與重組表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)文獻(xiàn)獲得了野生的編碼大腸桿菌青霉素g?；傅幕?。序列通過overlappingpcr擴(kuò)增出本發(fā)明中的pet28a-pga_m1基因(序列1)和pet28a-pga_m2基因(序列3)。組氨酸標(biāo)簽his6-tag添加于基因序列碳端末尾以利于后續(xù)的純化步驟。利用ncoi和xhoi雙酶切并純化后，與用同樣內(nèi)切酶進(jìn)行雙切的表達(dá)載體pet28a(+)(含卡那霉素抗性基因)過夜連接，隨后轉(zhuǎn)入化轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞bl21(de3)中，即獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pet28a-pga_m1和pet28a-pga_m2。經(jīng)測(cè)序，pet28a-pga_m1和pet28a-pga_m2序列正確。重組質(zhì)粒pet28a-pga_m1結(jié)構(gòu)描述：將序列表中序列1所示dna片段插入pet28a(+)的ncoi和xhoi位點(diǎn)間后得到的重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒pet28a-pga_m2結(jié)構(gòu)描述：將序列表中序列3所示dna片段插入pet28a(+)的ncoi和xhoi位點(diǎn)間后得到的重組質(zhì)粒。二、重組菌的獲得將步驟一獲得的重組質(zhì)粒pet28a-pga_m1和pet28a-pga_m2分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)(takara公司，大連)，得到重組菌escherichiacolibl21(de3)/pet28a-pga_m1以及escherichiacolibl21(de3)/pet28a-pga_m2。將得到的重組菌分別在含卡那霉素(50μg/ml)的lb平板上劃線，37℃下過夜培養(yǎng)，再挑取生長良好的的單菌落接種于100mllb液體培養(yǎng)基(含50μg/ml卡那霉素)中，在37℃、200rpm培養(yǎng)7h以上，制備成種子液，以1ml:100ml的接種量進(jìn)行步驟三的實(shí)驗(yàn)。三、青霉素g?；竿蛔凅w的獲得1、酶突變體的表達(dá)以上述1ml:100ml的接種量，取5ml種子液轉(zhuǎn)接于500ml的新鮮lb液體培養(yǎng)基(含50μg/ml卡那霉素)中，在37℃、200rpm的條件下，繼續(xù)培養(yǎng)至od600為0.6～0.8，制備成發(fā)酵液。然后加入終濃度為0.5mm的iptg，在20℃，120rpm條件下培養(yǎng)14h，誘導(dǎo)青霉素g酰化酶突變體基因的表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，將所有500ml菌液在4℃，10,000rpm(相當(dāng)于11,000g)的條件下離心10min，離心得到的菌體沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸(100mm磷酸鉀鹽，ph7.0)。重懸液用超聲破碎方法提取可溶蛋白(超聲時(shí)間4s、間隔時(shí)間6s，60％功率，20min)。將裂解液在4℃，10,000rpm(相當(dāng)于11,000g)條件下離心10min，取上清即為含目的蛋白粗酶液；再將含目的蛋白粗酶液在4℃，12,000rpm(相當(dāng)于13,500g)條件下離心10min，進(jìn)一步去除超聲破碎帶來的細(xì)胞雜質(zhì)。2、酶突變體的純化將步驟1處理過的含目的蛋白的粗酶液上樣至ni-nta柱，通過鎳離子作為親和離子，利用不同咪唑濃度梯度洗脫目的蛋白。由于青霉素g?；讣捌渫蛔凅w在280nm有特定吸收峰，故在純化過程中，用280nm檢測(cè)蛋白峰可以有效防止雜蛋白干擾。首先，使用結(jié)合緩沖液a(100mm磷酸鉀鹽，ph8.0，含500mmnacl和20mm咪唑)預(yù)平衡柱床，隨后，使用結(jié)合緩沖液b(100mm磷酸鉀鹽，ph8.0，含500mmnacl和50mm咪唑)洗脫雜蛋白，至洗脫液在280nm下的吸光度與緩沖液b基本相同。使用洗脫緩沖液(100mm磷酸鉀鹽，ph8.0，含500mmnacl和200mm咪唑)收集目的蛋白，并用10kdaultra-0.5超濾離心管(millipore)濃縮目的蛋白，并進(jìn)行兩次脫鹽，移除目的蛋白中的咪唑和nacl組分。純化后的目的蛋白保存于磷酸鹽緩沖液中(100mm磷酸鉀鹽，ph7.0)，并置于4℃冷藏保存。目的蛋白純度由sds-page(5％積層膠，12％分離膠)檢驗(yàn)，根據(jù)sds-page結(jié)果，收集的蛋白純度大于90％。純化后得到的目的蛋白濃度通過bradford法并使用牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)試劑測(cè)得，測(cè)定所使用的吸光度為595nm。采用類似的方法制備并純化獲得野生型青霉素g?；?，以及青霉素g酰化酶單點(diǎn)突變體βf24a。其中，野生型青霉素g?；傅木幋a基因如序列表中序列5所示；青霉素g酰化酶單點(diǎn)突變體βf24a的編碼基因如序列表中序列6所示。實(shí)施例2、酶突變體的水解dhme催化活性測(cè)定通過hplc(lc-20at，島津公司)分析dhme轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，從而測(cè)定實(shí)施例1制備的兩種酶突變體pga_m1和pga_m2水解dhme的催化活性和動(dòng)力學(xué)參數(shù)。所選用色譜柱為inertsilc18反相柱(glsciences，5μm，150×4.6mm)。反應(yīng)過程中酶突變體與底物配比為：0.5ml純化后的目的蛋白(足量，保存于100mm磷酸鉀鹽緩沖液，ph7.0)與0.5mldhme溶液(ph7.0，濃度呈梯度變化，最高濃度為1g/100ml)，在22℃下反應(yīng)8min。反應(yīng)結(jié)束后添加1ml甲醇終止反應(yīng)。hplc的流動(dòng)相配比為：75％磷酸鉀鹽緩沖液(30mm，ph4.5)：25％甲醇(v/v)，流速0.8ml/min，檢測(cè)波長為230nm，柱溫箱恒定為25℃。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置以等量野生型青霉素g?；?或者青霉素g?；竼吸c(diǎn)突變體βf24a)替換酶突變體pga_m1(或pga_m2)的對(duì)照。結(jié)果顯示：pga_m1和pga_m2均在保留時(shí)間tr＝3.1min附近出現(xiàn)產(chǎn)物dhpg色譜峰，在保留時(shí)間tr＝6.0min附近出現(xiàn)底物dhme色譜峰。hplc檢測(cè)青霉素g酰化酶突變體pga_m1水解dhme的色譜圖如圖4中(b)所示。酶催化動(dòng)力學(xué)參數(shù)(kcat、km、kcat/km)通過lineweaver-burk法擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到。本發(fā)明中頭孢菌素?；傅耐蛔凅wpga_m1水解dhme的kcat/km為0.21mm-1s-1，與野生型酶相比(kcat/km＝0.15mm-1s-1)，水解dhme的活性提高了40％，與突變體βf24a相比(kcat/km＝0.13mm-1s-1)，水解dhme的活性提高了62％；突變體pga_m2水解dhme的催化效率kcat/km為0.78mm-1s-1，與野生型酶相比提高了4.2倍，與突變體βf24a相比提高了5倍。實(shí)施例3、酶突變體的水解頭孢拉定催化活性測(cè)定通過hplc(lc-20at，島津公司)分析頭孢拉定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，從而測(cè)定實(shí)施例1制備的兩種酶突變體pga_m1和pga_m2水解頭孢拉定的催化活性和動(dòng)力學(xué)參數(shù)。所選用色譜柱為inertsilc18反相柱(glsciences，5μm，150×4.6mm)。反應(yīng)過程中酶突變體與底物配比為：0.5ml純化后的目的蛋白(足量，保存于100mm磷酸鉀鹽緩沖液，ph7.0)與0.5ml頭孢拉定溶液(ph7.0，濃度呈梯度變化，最高濃度為2g/100ml)，在22℃下反應(yīng)8min。反應(yīng)結(jié)束后添加1ml甲醇終止反應(yīng)。hplc的流動(dòng)相配比為：75％磷酸鉀鹽緩沖液(30mm，ph4.5)：25％甲醇(v/v)，流速0.8ml/min，檢測(cè)波長為254nm，柱溫箱恒定為25℃。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置以等量野生型青霉素g?；?或者青霉素g?；竼吸c(diǎn)突變體βf24a)替換酶突變體pga_m1(或pga_m2)的對(duì)照。結(jié)果顯示：pga_m1和pga_m2均在保留時(shí)間tr＝2.8min附近出現(xiàn)水解產(chǎn)物7-adca的色譜峰，在保留時(shí)間tr＝7.2min附近出現(xiàn)底物頭孢拉定的色譜峰。酶催化動(dòng)力學(xué)參數(shù)(kcat、km、kcat/km)通過lineweaver-burk法擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到。hplc檢測(cè)青霉素g?；竿蛔凅wpga_m1水解頭孢拉定的色譜圖如圖4中(a)所示。本發(fā)明中頭孢菌素?；傅耐蛔凅wpga_m1水解頭孢拉定的kcat/km為0.06mm-1s-1，降低為野生型酶(kcat/km＝0.90mm-1s-1)的6.7％，降低為βf24a(kcat/km＝0.23mm-1s-1)的26％；突變體pga_m2水解頭孢拉定的kcat/km為0.27mm-1s-1，降低為野生型酶的30％，與βf24a相比提高了4％。實(shí)施例4、酶突變體合成頭孢拉定vs/vh測(cè)定通過hplc(lc-20at，島津公司)分析頭孢拉定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，從而測(cè)定實(shí)施例1制備的兩種酶突變體pga_m1和pga_m2水解頭孢拉定的催化活性和動(dòng)力學(xué)參數(shù)。所選用色譜柱為hypersilc18反相柱(伊利特，5μm，250×4.6mm)。反應(yīng)過程中酶突變體與底物配比為：0.5ml純化后的目的蛋白(足量，保存于100mm磷酸鉀鹽緩沖液，ph7.0)與0.5ml底物混合溶液(ph7.0，dhme為36mm，7-adca為30mm)，在22℃下分別反應(yīng)0.5、1、2、3、4、5小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后添加1ml甲醇終止反應(yīng)。hplc的流動(dòng)相配比為：75％磷酸鉀鹽緩沖液(30mm，ph4.5)：25％甲醇(v/v)，流速0.8ml/min，檢測(cè)波長為230nm，柱溫箱恒定為25℃實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置將實(shí)施例1制備的兩種酶突變體pga_m1和pga_m2進(jìn)行失活處理的對(duì)照，失活處理的方法為：取10ml圓底離心管，加入0.5ml純化后的目的蛋白(足量，保存于100mm磷酸鉀鹽緩沖液，ph7.0)，然后加入1ml色譜醇甲醇，使酶失活，然后再加入相應(yīng)量的底物溶液。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置以等量野生型青霉素g?；?或者青霉素g?；竼吸c(diǎn)突變體βf24a)替換酶突變體pga_m1(或pga_m2)的對(duì)照。結(jié)果如圖5和圖6所示：pga_m1和pga_m2均在保留時(shí)間tr＝15.0min附近出現(xiàn)合成產(chǎn)物頭孢拉定的色譜峰，在保留時(shí)間tr＝4.0min附近出現(xiàn)底物7-adca的色譜峰。而在tr＝4.7min附近出現(xiàn)dhpg的色譜峰。通過實(shí)施例2和實(shí)施例3中測(cè)定的催化效率，可以計(jì)算出野生型酶、βf24a、突變體pga_m1和pga_m2的α分別為6.14、0.31和0.51。此外本發(fā)明還測(cè)定了專利wo2005/003367、wo2008/110527和wo2011/073166報(bào)道的突變?chǔ)耭24a的α為1.72。青霉素g?；敢吧兔?wt)、突變體βf24a、突變pga_m1和突變pga_m2在5小時(shí)反應(yīng)時(shí)間內(nèi)合成得到的頭孢拉定與水解得到的dhpg的濃度變化如圖7所示。本發(fā)明中以反應(yīng)0.5h時(shí)反應(yīng)液中頭孢拉定的濃度與dhpg的濃度比作為初始合成水解比vs/vh。本發(fā)明中測(cè)得野生型酶、βf24a、突變體pga_m1和pga_m2合成頭孢拉定的vs/vh分別為1.23、1.75、7.19和14.42。<110>清華大學(xué)<120>頭孢拉定合成酶突變體及其編碼基因<130>cggnqaln176076<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>2538<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1atgaaaaatagaaatcgtatgatcgtgaactgtgttactgcttccctgatgtattattgg60agcttacctgcactggctgaacagtctagctctgagattaagattgtgcgtgacgaatac120ggcatgcctcatatctacgccaacgacacctggcacctgttctacggctatggctacgtg180gtagcacaggaccgtctgtttcagatggaaatggctcgtcgtagcacccagggcaccgta240gcagaagtgctgggcaaagacttcgtgaagttcgacaaagacattcgtcgcaactactgg300ccggacgcgatccgtgcgcagattgcggcgctgagcccggaagacatgagcatcctgcaa360ggttacgctgatggtatgaacgcatggatcgataaagtgaacacgaaccctgaaaccctg420ctgccgaaacagttcaacacctttggcttcaccccgaaacgctgggaaccgttcgatgtg480gcgatgatcttcgtgggcactatggccaatcgcttctctgattctacctccgagatcgac540aatctggccctgctgaccgcactgaaagacaagtatggtgtcagccagggcatggcggtg600ttcaaccagctgaaatggctggtcaacccgtccgcgccgactacgatcgcggtgcaggag660tctaactacccgctgaaattcaaccaacagaacagccagacggctgcactgctgccgcgt720tatgatctgccagcgccaatgc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