本發(fā)明屬于生物化學(xué)與醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種吡喃并吲哚類化合物及其制備方法和在制備抗艾滋病的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

根據(jù)聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署最新報(bào)道，至2015年底，全世界有3670萬人口感染了hiv，每年還會(huì)新增感染者210萬人，每年因hiv死亡人數(shù)有110萬人。從發(fā)現(xiàn)艾滋病病毒已超過三十年，卻仍找不到方法治能愈這種疾病。目前對hiv感染者是通過抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(art)進(jìn)行治療，通過兩種或多種高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的組合可使hiv病毒的復(fù)制得到有效抑制，但art治療不能徹底清除感染者體內(nèi)的hiv病毒，從而導(dǎo)致art停藥后體內(nèi)的潛伏病毒就會(huì)迅速反彈，所以hiv感染者需要終身服用art藥物，這種治療方式讓各國政府和患者背付了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。同時(shí)，由于hiv病毒的高變異性，長期服藥帶來的hiv耐藥情況和不良副反應(yīng)等問題，給當(dāng)前的art療法帶來了諸多挑戰(zhàn)。針對上述嚴(yán)峻的艾滋病防控形勢，以及給社會(huì)帶來的沉重負(fù)擔(dān)，亟需研制出更為有效的防治和根除艾滋病的新技術(shù)。

迄今為止，有關(guān)艾滋病功能治愈的策略還未取得令人滿意的效果，通往艾滋病功能治愈道路上面臨的最大障礙是hiv病毒儲存庫的存在，這也是art無法根除hiv感染且需要終身治療的根本原因。hiv病毒一旦感染機(jī)體，就會(huì)整合到宿主基因組中，并形成潛伏感染。在特定細(xì)胞因子的刺激下，病毒感染靜息cd4+t細(xì)胞可以建立潛伏模型，或?qū)⒒罨膖細(xì)胞轉(zhuǎn)換為靜息狀態(tài)。研究學(xué)者稱這種整合并潛伏感染的細(xì)胞為hiv的病毒儲存庫(viralreservoirs)。hiv感病毒儲存庫通常處于“沉默狀態(tài)”——不產(chǎn)生病毒蛋白，也不能被免疫系統(tǒng)識別。潛伏的病毒儲存庫通常存在于中央和外周記憶cd4+t細(xì)胞中，也存在于在單核巨噬細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中，以及nk細(xì)胞、cd4+cd8+雙陽性t細(xì)胞等。因此，如何有效激活并清除病毒儲存庫是根治艾滋病感染的關(guān)鍵難題。

激活技術(shù)方面，國際上已探索了一些可激活潛伏感染的病毒儲存庫的激活劑，例如抗il-2單抗，抗cd3單抗、短桿菌肽(gramicidine)大分子以及組蛋白去乙?；敢种苿?hdac)[異羥肟酸(suberoylanilidehydroxamicacid，saha)]、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(hmtis)、白藜蘆醇(resveratrol)、酪氨酸激酶抑制劑(prostratin)、bryostratin等小分子化合物。這些化合物在體外實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出了一定的激活效果，但其體內(nèi)效果均不理想，且一些如激活pkc通路的lra能夠引起免疫系統(tǒng)的t細(xì)胞激活，這反而有可能促進(jìn)hiv的感染。因而，尋找更加安全有效激活劑藥物和研發(fā)高效特異激活hiv-1儲存庫的新技術(shù)非常必要。一個(gè)理想的儲存庫激活劑在能高效的激活hiv病毒儲存庫的同時(shí)不引起免疫系統(tǒng)的非特異性免疫激活。目前并沒有一個(gè)有效的激活劑能完全符合上述指標(biāo)。

吡喃并吲哚(pyranoindole)骨架在藥物研發(fā)中是一個(gè)被較多研究的可能具有藥理學(xué)活性的結(jié)構(gòu)核心。前期研究表明，有一些吡喃并吲哚衍生物類顯示出了抗炎、抗癌和抗細(xì)菌感染的活性。最近，我們研發(fā)了一種二氫吡喃并吲哚(dihydropyranoindole)衍生物的有機(jī)催化不對稱合成的有效方法。使用該技術(shù)，我們合成了一系列新型化合物(含有三氟甲基的手性季碳)，產(chǎn)率高達(dá)99％，并具有優(yōu)良的對映選擇性(高達(dá)98％的ee值)。

然而，這些具有全新結(jié)構(gòu)的小分子化合物的潛在的生物活性還不清楚。本專利中，我們驗(yàn)證了這些具有全新結(jié)構(gòu)的小分子化合物在治療艾滋病中的應(yīng)用；利用獼猴艾滋病感染細(xì)胞和hiv患者的cd4淋巴細(xì)胞，我們驗(yàn)證了該類化合物對潛伏感染病毒的激活效果，證明了它們可有效激活艾滋病毒潛伏感染儲存庫，從而可用于治療艾滋病。基于這些數(shù)據(jù)，我們認(rèn)為這類新化合物可在hiv治療領(lǐng)域產(chǎn)生重要影響，將有助于艾滋病患者擺脫或減少對傳統(tǒng)藥物的依賴性，將為最終實(shí)現(xiàn)治愈艾滋病積累重要經(jīng)驗(yàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種吡喃并吲哚類化合物及其制備方法和應(yīng)用，尤其是提供一種吡喃并吲哚類化合物及其制備方法和在制備抗艾滋病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的吡喃并吲哚類化合物可有效激活hiv病毒儲存庫，可開發(fā)為抗艾滋病的感染的候選藥物。

為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一方面，本發(fā)明提供一種吡喃并吲哚類化合物，所述吡喃并吲哚類化合物具有如式i所示的結(jié)構(gòu)：

其中，r1選自h、低級烷基、-coor7、?；?、鹵素、苯基或雜環(huán)基；r2選自h、-coor7、?；?、鹵素、低級烷基、烷氧基、苯基或雜環(huán)基；r3和r4獨(dú)立地選自h、-coor7、低級烷基、鹵素、烷氧基、苯基或芳雜環(huán)基；r5選自h、低級烷烴、氰基，-coor7、鹵素、烷氧基、苯基或芳雜環(huán)基；r6選自h、低級烷烴、氨基，-coor7、鹵素、烷氧基、苯基或芳雜環(huán)基；其中r7選自低級烷基，芐基、苯基或芳雜環(huán)基；a選自c3～c10環(huán)烷基、苯基或芳雜環(huán)基。優(yōu)選地，在式i中，所述r1選自h、低級烷基、酰基、-coor7。

優(yōu)選地，在式i中，所述r2選自h、-coor7、低級烷烴、苯基或芳雜環(huán)基，其中r7選自低級烷基。

優(yōu)選地，在式i中，所述r3和r4獨(dú)立地選自h、低級烷烴、鹵素、烷氧基、基苯基或芳雜環(huán)基。

優(yōu)選地，在式i中，所述r5選自h、低級烷烴、氰基，-coor7、苯基或芳雜環(huán)基。

優(yōu)選地，在式i中，所述r6選自：低級烷烴、氰基，-coor7、苯基或芳雜環(huán)基。

優(yōu)選地，在式i中，所述a選自苯基或芳雜環(huán)基。

更優(yōu)選地，在式i中，所述r1選自h、甲基、乙基、環(huán)丙基、乙?；?coor7或芐基，其中r7選自低級烷基或芐基。

更優(yōu)選地，在式i中，所述r2選自h或-coor7，其中r7選自低級烷基。

更優(yōu)選地，在式i中，所述r3和r4獨(dú)立地選自h、甲基、乙基、丙基、環(huán)丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、三氟甲氧基或鹵素。

更優(yōu)選地，在式i中，所述r5選自h、低級烷烴或氰基。

更優(yōu)選地，在式i中，所述r6選自h、低級烷烴或氨基。

更優(yōu)選地，在式i中，所述a選自苯基、呋喃基、吡啶基或噻吩基。

本發(fā)明所述的烷基指由碳和氫原子組成的直鏈或支鏈的飽和脂肪族原子團(tuán)，優(yōu)選含有1到6個(gè)碳原子的烷基。所述的低級烷基是指由1-4個(gè)碳原子組成的直鏈或支鏈的飽和烷基，具體的例子包括但不限于甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基、異丁基或叔丁基等。

本發(fā)明所述的烷氧基表示具有進(jìn)一步的烷基取代基的含氧部分，即-o-烷基基團(tuán)。低級烷氧基是指具有低級烷基取代基的含氧基團(tuán)，即-o-低級烷基基團(tuán)，具體的例子包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、仲丁氧基、異丁氧基或叔丁氧基等。

“氨基”表示具有兩個(gè)取代基的含氮部分，其中氫或碳原子與氮連接。氨基的具體例子包括但不限于-nh2、-nhch3、-n(ch3)2、-nhc1-3烷基、-n(c1-3烷基)2等。

本發(fā)明所述的“芳基”是指含有5-10個(gè)碳原子的全碳單環(huán)或稠合多環(huán)(即，多個(gè)環(huán)共有相鄰的碳原子對)基團(tuán)，具有完全共軛的π電子體系，芳基的非限制性實(shí)例如苯基、萘基等。芳基可以是取代的或未取代的。

“鹵素”表示氟、氯、溴或碘?！胞u烷基”表示被一個(gè)或多個(gè)“鹵素”原子取代的“烷基”，包括一鹵代烷基、二鹵代烷基、三鹵代烷基、全鹵代烷基等，具體的例子包括但不限于氯甲基、二氯甲基、二氟甲基、三氟甲基、全氟乙基或2,2,2-三氟乙基等。

本發(fā)明所述的“雜芳基”是指有5-10個(gè)原子的單環(huán)或雙環(huán)芳族基團(tuán)，其中至少含有1個(gè)選自n、o或s的雜原子，其余的原子是c，此外，還有完全共軛的π電子體系。雜芳基的例子包括但不限于噠嗪、吲哚、喹唑啉、吡咯、噻吩、吲唑、吡唑、喹啉、吡啶、呋喃、咪唑、吡嗪、嘧啶、噻唑、異喹啉、苯并噻唑或二氮雜萘等。雜芳基可以是取代的或未取代的。

最優(yōu)選地，所述吡喃并吲哚類化合物為選自如下表1中所示化合物1-21以及化合物1-a～21-a中的任意一種或至少兩種的組合：

表1

另一方面，本發(fā)明提供上述吡喃并吲哚類化合物的制備方法，所述制備方法包括：

(i)當(dāng)式i所示吡喃并吲哚類化合物中r2為-coor7時(shí)，以三氟丙酮酸酯和取代的2-吲哚酮為原料，制備方法包括以下步驟：

a、式ii所示的取代的2-吲哚酮與式iii所示三氟丙酮酸酯反應(yīng)得到式iv所示化合物，反應(yīng)式如下：

b、步驟a得到的式iv所示化合物與氯化物r1cl反應(yīng)，得到式v所示化合物，反應(yīng)式如下：

c、步驟b得到的式v所示化合物與丙二腈反應(yīng)，得到式i'所示吡喃并吲哚類化合物，反應(yīng)式如下：

(ii)當(dāng)式i所示吡喃并吲哚類化合物中r2為h時(shí)，制備方法包括以下步驟：

a、式ii所示的取代的2-吲哚酮與式iii所示的化合物反應(yīng)得到式iv所示化合物，反應(yīng)式如下：

b、步驟a得到的式iv所示化合物與氯化物r1cl反應(yīng)，得到式v所示化合物，反應(yīng)式如下：

c、步驟b得到的式v所示化合物與丙二腈反應(yīng)，得到式i”所示吡喃并吲哚類化合物，反應(yīng)式如下：

優(yōu)選地，步驟a所述式ii所示的取代的2-吲哚酮與式iii所示三氟丙酮酸酯的摩爾比為1:(1-2)，例如1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9或1:2。

優(yōu)選地，步驟a所述反應(yīng)在弱堿性物質(zhì)存在下進(jìn)行。

優(yōu)選地，所述弱堿性物質(zhì)為吡啶、哌啶、三乙胺或4-二甲氨基吡啶中的任意一種或至少兩種的組合。

優(yōu)選地，步驟a所述反應(yīng)的溶劑為甲苯、二甲苯、二氯甲烷或四氫呋喃中的任意一種或至少兩種的組合。

優(yōu)選地，步驟a所述反應(yīng)的溫度為100-130℃，例如100℃、105℃、108℃、110℃、115℃、118℃、120℃、125℃、128℃或130℃。

優(yōu)選地，步驟a所述反應(yīng)的時(shí)間為1-8小時(shí)，例如1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)、6小時(shí)、7小時(shí)或8小時(shí)。

優(yōu)選地，步驟b所述式iv所示合物與氯化物r1cl的摩爾比為1:(1-2)，例如1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9或1:2。

優(yōu)選地，步驟b所述反應(yīng)在堿性物質(zhì)存在下進(jìn)行；

優(yōu)選地，所述堿性物質(zhì)為三乙胺、吡啶或4-二甲氨基吡啶中的任意一種或至少兩種的組合。

優(yōu)選地，步驟b所述反應(yīng)的溶劑為n,n-二甲基甲酰胺或四氫呋喃。

優(yōu)選地，步驟b所述反應(yīng)的溫度為室溫。

優(yōu)選地，步驟b所述反應(yīng)的時(shí)間為1-8小時(shí)，例如1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)、6小時(shí)、7小時(shí)或8小時(shí)。

優(yōu)選地，步驟c所述式v所示化合物與丙二腈的摩爾比為1:(1-2)，例如1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9或1:2。

優(yōu)選地，步驟c所述反應(yīng)在催化劑存在下進(jìn)行，所述催化劑優(yōu)選如下式a或式b所示的化合物：

優(yōu)選地，所述催化劑的用量為步驟c所述式v所示化合物摩爾量的5％-20％，例如5％、7％、9％、10％、12％、15％、18％或20％，優(yōu)選10-15％，更優(yōu)選10％。

優(yōu)選地，步驟c所述反應(yīng)的溶劑為n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷或三氯甲烷中的任意一種或至少兩種的組合。

優(yōu)選地，步驟c所述反應(yīng)的溫度為0℃～-30℃，例如0℃、-4℃、-8℃、-10℃、-12℃、-15℃、-18℃、-20℃、-22℃、-25℃、-28℃或-30℃。

優(yōu)選地，步驟c所述反應(yīng)的時(shí)間為8-72小時(shí)，例如8小時(shí)、10小時(shí)、13小時(shí)、15小時(shí)、18小時(shí)、20小時(shí)、24小時(shí)、28小時(shí)、30小時(shí)、36小時(shí)、42小時(shí)、48小時(shí)、52小時(shí)、55小時(shí)、60小時(shí)、64小時(shí)、70小時(shí)或72小時(shí)。

優(yōu)選地，步驟a所述式ii所示的取代的2-吲哚酮與式iii所示的化合物的摩爾比為1:(1-2)，例如1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9或1:2。

優(yōu)選地，步驟a所述反應(yīng)在堿性物質(zhì)存在下進(jìn)行。

優(yōu)選地，所述弱堿性物質(zhì)為叔丁醇鉀(t-buok)。

優(yōu)選地，步驟a所述反應(yīng)的溶劑為四氫呋喃。

優(yōu)選地，步驟a所述反應(yīng)的溫度為60-130℃，例如60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、110℃、120℃或130℃。

優(yōu)選地，步驟a所述反應(yīng)的時(shí)間為8-72小時(shí)，例如8小時(shí)、10小時(shí)、13小時(shí)、15小時(shí)、18小時(shí)、20小時(shí)、24小時(shí)、28小時(shí)、30小時(shí)、36小時(shí)、42小時(shí)、48小時(shí)、52小時(shí)、55小時(shí)、60小時(shí)、64小時(shí)、70小時(shí)或72小時(shí)。

優(yōu)選地，步驟b所述式iv所示化合物與氯化物r1cl的摩爾比為1:(1-2)，例如1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9或1:2。

優(yōu)選地，步驟b所述反應(yīng)在堿性物質(zhì)存在下進(jìn)行；

優(yōu)選地，所述堿性物質(zhì)為三乙胺、吡啶或4-二甲氨基吡啶中的任意一種或至少兩種的組合。

優(yōu)選地，步驟b所述反應(yīng)的溶劑為n,n-二甲基甲酰胺或四氫呋喃。

優(yōu)選地，步驟b所述反應(yīng)的溫度為室溫。

優(yōu)選地，步驟b所述反應(yīng)的時(shí)間為1-8小時(shí)，例如1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)、6小時(shí)、7小時(shí)或8小時(shí)。

優(yōu)選地，步驟c所述式v所示化合物與丙二腈的摩爾比為1:(1-2)，例如1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9或1:2。

優(yōu)選地，步驟c所述反應(yīng)在催化劑存在下進(jìn)行，所述催化劑優(yōu)選如下式a或式b所示的化合物：

優(yōu)選地，所述催化劑的用量為步驟c所述式v所示化合物摩爾量的5％-20％，例如5％、7％、9％、10％、12％、15％、18％或20％，優(yōu)選10-15％，更優(yōu)選10％。

優(yōu)選地，步驟c所述反應(yīng)的溶劑為為n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷或三氯甲烷中的任意一種或至少兩種的組合。

優(yōu)選地，步驟c所述反應(yīng)的溫度為0℃～-30℃，例如0℃、-4℃、-8℃、-10℃、-12℃、-15℃、-18℃、-20℃、-22℃、-25℃、-28℃或-30℃。

優(yōu)選地，步驟c所述反應(yīng)的時(shí)間為8-72小時(shí)，例如8小時(shí)、10小時(shí)、13小時(shí)、15小時(shí)、18小時(shí)、20小時(shí)、24小時(shí)、28小時(shí)、30小時(shí)、36小時(shí)、42小時(shí)、48小時(shí)、52小時(shí)、55小時(shí)、60小時(shí)、64小時(shí)、70小時(shí)或72小時(shí)。

在本發(fā)明中，所述式a或式b所示的催化劑中，式a所示催化劑具有優(yōu)良的對映選擇性；式b所示催化劑不具有對映選擇性。

本發(fā)明提供的上述吡喃并吲哚類化合物可以以其鹽、水合物的形式存在，它們在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為本發(fā)明所述化合物。例如，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，按照本領(lǐng)域熟知的工藝，將本發(fā)明化合物轉(zhuǎn)化為藥學(xué)上可接受的鹽的形式，并且以鹽形式使用它們。

當(dāng)本發(fā)明化合物具備游離堿的形式時(shí)，使化合物的游離堿形式與藥學(xué)上可接受的無機(jī)或有機(jī)酸反應(yīng)，可以制備本發(fā)明化合物的酸加成鹽，這些鹽包括但不限于：鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、乙磺酸鹽、甲苯磺酸鹽和苯磺酸鹽、乙酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、苯甲酸鹽、抗壞血酸鹽、水楊酸鹽、丙二酸鹽、己二酸鹽、己酸鹽、精氨酸鹽、富馬酸鹽、煙酸鹽、鄰苯二甲酸鹽或草酸鹽等。

另一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包括治療有效量的如上所述的吡喃并吲哚類化合物、或其藥學(xué)上可接受的鹽、異構(gòu)體、外消旋體、前體藥物共結(jié)晶復(fù)合物、水合物或溶劑合物以及藥用輔料。

本發(fā)明所提供的藥物組合物可以激活hiv病毒儲存庫，作為用于治療艾滋病的藥物。

本發(fā)明所述的組合物可以是液體、半液體或固體形式，按照適合于所用的給藥途徑的方式配制。本發(fā)明所述的組合物可以按照下列給藥方式給藥：口服、腸胃外、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、透皮、舌下、肌內(nèi)、直腸、口腔、鼻內(nèi)、脂質(zhì)體等方式。

口服組合物可以是固體、凝膠或液體。固體制劑的實(shí)例包括但不限于片劑、膠囊劑、顆粒劑和散裝粉劑。這些制劑可以選擇地含有粘合劑、稀釋劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、甜味劑和矯味劑等。粘合劑的實(shí)例包括但不限于微晶纖維素、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠溶液、蔗糖和淀粉糊；潤滑劑的實(shí)例包括但不限于滑石、淀粉、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸；稀釋劑的實(shí)例包括但不限于乳糖、蔗糖、淀粉、甘露糖醇、磷酸二鈣；助流劑的實(shí)例包括但不限于二氧化硅；崩解劑的實(shí)例包括但不限于交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、淀粉羥乙酸鈉、藻酸、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、甲基纖維素、瓊脂和羧甲基纖維素。

以腸胃外給予本發(fā)明組合物，一般以注射為主，包括皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射。注射劑可以被制成任何常規(guī)形式，如液體溶液或懸液、適合于在注射之前溶解或懸浮在液體中的固體形式或者乳劑?？捎糜诒景l(fā)明注射劑的藥學(xué)上可接收的載體的實(shí)例包括但不限于水性載體、非水性載體、抗微生物劑、等滲劑、緩沖劑、抗氧劑、懸浮與分散劑、乳化劑、螯合劑和其它藥學(xué)上可接受的物質(zhì)。水性載體的實(shí)例包括氯化鈉注射液、林格式注射液、等滲葡萄糖注射液、無菌水注射液、葡萄糖與乳酸化林格氏注射液；非水性載體的實(shí)例包括植物來源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油；抗微生物劑的實(shí)例包括間甲酚、芐醇、氯丁醇、苯扎氯銨等；等滲劑的實(shí)例包括氯化鈉和葡萄糖；緩沖劑包括磷酸鹽和檸檬酸鹽。

本發(fā)明組合物還可以制備成無菌的凍干粉針劑，將化合物溶于磷酸鈉緩沖溶液，其中含有葡萄糖或其他適合的賦形劑，隨后在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)條件下將溶液無菌過濾，繼之以冷凍干燥，得到所需的制劑。

另一方面，本發(fā)明提供了如上所述的吡喃并吲哚類化合物或所述藥物組合物在制備激活hiv潛伏感染病毒儲存庫的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明利用體外hiv儲存庫模型和體內(nèi)siv感染獼猴感染模型以及hiv病人的cd4t細(xì)胞對該類化合物的有效性進(jìn)行了評估，發(fā)現(xiàn)其能有效激活上述細(xì)胞的胞內(nèi)病毒rna。同時(shí)對其安全性和有效性進(jìn)行了評估，發(fā)現(xiàn)了該類化合物可有效激活hiv儲存庫，并且不會(huì)導(dǎo)致廣泛的t細(xì)胞激活和炎癥應(yīng)答，因而該類化合物可以作為一種全新的激活劑應(yīng)用于治療艾滋病。

另一方面，本發(fā)明提供了如上所述的吡喃并吲哚類化合物或所述藥物組合物在制備用于與其他抗hiv病毒藥物聯(lián)合用于治療艾滋病的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的吡喃吲哚類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、異構(gòu)體、外消旋體、前體藥物共結(jié)晶復(fù)合物、水合物或溶劑合物可與其他已知抗hiv病毒藥物聯(lián)合組成聯(lián)合治療艾滋病的藥物，以取得更加優(yōu)異的治療效果。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供的吡喃并吲哚類化合物可有效激活hiv病毒儲存庫，可開發(fā)為抗艾滋病的感染的候選藥物。并且該化合物的制備方法簡單、易于工業(yè)化生產(chǎn)，應(yīng)用前景廣闊。

附圖說明

圖1a為本發(fā)明用于篩選化合物的細(xì)胞系j-lat通過表達(dá)gfp(綠色螢光蛋白)顯示藥物的激活效果圖；

圖1b為不同化合物對細(xì)胞系j-lat表達(dá)gfp(綠色螢光蛋白)的激活效果圖；

圖1c為化合物4(gibh-lra002)對j-lat表達(dá)的綠色熒光蛋白(gfp)的影響結(jié)果圖；

圖2a為對攜帶有siv儲存庫的艾滋病猴cd4+t細(xì)胞進(jìn)行激活檢測的流程圖；

圖2b為選用前病毒轉(zhuǎn)錄出來的胞內(nèi)rna中的msrna作為檢測指標(biāo)對化合物4(gibh-lra002)能有效激活siv感染猴的cd4+t細(xì)胞的驗(yàn)證結(jié)果圖；

圖2c為選用前病毒轉(zhuǎn)錄出來的胞內(nèi)rna中的usrna作為檢測指標(biāo)對化合物4(gibh-lra002)能有效激活siv感染猴的cd4+t細(xì)胞的驗(yàn)證結(jié)果圖；

圖3a為對攜帶有hiv儲存庫的艾滋病人cd4+t細(xì)胞進(jìn)行激活檢測的流程

圖3b為選用前病毒轉(zhuǎn)錄出來的胞內(nèi)rna中的msrna作為檢測指標(biāo)對化合物4(gibh-lra002)能有效激活hiv感染者的cd4+t細(xì)胞的驗(yàn)證結(jié)果圖；

圖3c為選用前病毒轉(zhuǎn)錄出來的胞內(nèi)rna中的usrna作為檢測指標(biāo)對化合物4(gibh-lra002)能有效激活hiv感染者的cd4+t細(xì)胞的驗(yàn)證結(jié)果圖；

圖4為通過cck8方法檢測化合物4(gibh-lra002)對獼猴細(xì)胞細(xì)胞活性的影響結(jié)果圖；

圖5a為通過流式檢測cd4+t細(xì)胞的激活標(biāo)志物cd25的表達(dá)情況結(jié)果圖；

圖5b為通過流式檢測cd3+t細(xì)胞的激活標(biāo)志物cd25的表達(dá)情況結(jié)果圖；

圖5c為通過流式檢測cd4+t細(xì)胞的激活標(biāo)志物cd69的表達(dá)情況結(jié)果圖；

圖5d為通過流式檢測cd3+t細(xì)胞的激活標(biāo)志物cd69的表達(dá)情況結(jié)果圖；

圖5e為通過流式檢測cd4+t細(xì)胞的激活標(biāo)志物ccr5的表達(dá)情況結(jié)果圖；

圖5f為通過流式檢測cd3+t細(xì)胞的激活標(biāo)志物ccr5的表達(dá)情況結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施方式來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實(shí)施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對本發(fā)明的具體限制。

本發(fā)明提供的化合物可以通過多種制備方法來合成，實(shí)施例中僅提供了合成這些化合物的代表性方法。這里要說明的是，不管以何種方式開發(fā)的本發(fā)明化合物的異構(gòu)體形式，游離酸和/或堿形式，還是鹽的形式，均屬于本發(fā)明的范圍。具體實(shí)施例的目的是進(jìn)一步說明本發(fā)明內(nèi)容但不意味著對本發(fā)明進(jìn)行限制。

本發(fā)明具體實(shí)施例中所使用的初始原料、反應(yīng)試劑等若無特殊說明均為市售產(chǎn)品。

實(shí)施例1(s)-2-氨基-3-氰基-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-4,9(4h)-二羧酸9-(叔丁基)-4-乙酯(化合物1)和2-氨基-3-氰基-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-4,9(4h)-二羧酸9-(叔丁基)-4-乙酯(化合物1-a)的制備

制備方法包括以下步驟：

(1)

在50ml反應(yīng)瓶中，將吲哚酮(1.33g,10mmol)溶于甲苯(20ml)中，加入三氟丙酮酸乙酯(1.98ml,15mmol)和哌啶(0.27ml,3mmol)。在110℃條件下反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)完畢，濃縮，柱層析得2.28g產(chǎn)物，產(chǎn)率70％。¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ8.89(br,1h),7.73(d,j＝8.0hz,1h),7.37-7.40(m,1h),7.07-7.10(m,1h),6.90(d,j＝7.5hz,1h),4.46(q,j＝9.0hz,2h),1.42(t,j＝7.0hz,3h)ppm；¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ166.8,162.9(d,j＝2.9hz),143.3,133.3,132.8(d,j＝4hz),127.1,126.9(d,j＝5.5hz),123.2,118.0(q,j＝273hz),117.9,110.8,62.8,13.7ppm；¹⁹fnmr(471mhz,cdcl3)δ-60.37(s,3f)ppm；hrms-ei(m/z):calcdforc13h11f3no3⁺[m+h⁺]:286.0686；found:286.0693.

(2)

在100ml反應(yīng)瓶中，將上步產(chǎn)物(2.85g,10mmol)溶于40ml二氯甲烷，加入boc酸酐(2.75ml,12mmol)dmap(122mg,1mmol)，室溫反應(yīng)1小時(shí)，濃縮，柱層析得產(chǎn)物3.63g，產(chǎn)率94％。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.91(d,j＝8.4hz,1h),7.79(d,j＝7.6hz,1h),7.44-7.48(m,1h),7.18-7.22(m,1h),4.46(q,j＝7.2hz,2h),1.62(s,9h),1.38(t,j＝7.2hz,3h)ppm；¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ163.5,163.0,148.6,142.3,133.7,131.5,127.5,126.5,125.4(q,j＝273.4hz),125.2,117.7,115.8,85.6,63.3,28.3,14.0ppm；¹⁹fnmr(471mhz,cdcl3)δ-60.30(s,3f)ppm；hrms-ei(m/z):calcdforc18h19f3no5⁺[m+h⁺]:386.1210；found:386.1213.

(3)

-20℃條件下，于0.5ml反應(yīng)瓶中加入丙二腈(0.1mmol,6.6mg)，攪拌30分鐘，再加入催化劑1a或1b(0.1mmol)。-20℃反應(yīng)48小時(shí)，tlc監(jiān)測反應(yīng)完全，濃縮，柱層析。得白色粉末狀固體?；衔?產(chǎn)率99％，ee值95％。1-a產(chǎn)率98％。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.07(d,j＝8.0hz,1h),7.49(d,j＝7.6hz,1h),7.24-7.32(m,2h),5.57(s,2h),4.25-4.40(m,2h),1.69(s,9h),1.26(t,j＝7.2hz,3h)ppm；¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ165.8,161.6,147.9,142.8,131.5,124.5,124.2(q,j＝283.8hz),124.1,123.6,119.7(d,j＝1.9hz),117.2,115.2,63.3,55.7,52.4(q,j＝29.4hz),28.2,14.1ppm；¹⁹fnmr(471mhz,cdcl3)δ-66.00(s,3f)ppm；theenantiomericexcessisdeterminedbyhplcwithachiralpakiccolumn(hexanes:isopropanol＝95:5,flowrate:1.0ml/min,λ＝254nm):tr＝14.21min(major),tr＝16.62min(minor)；hrms-ei(m/z):calcdforc21h21f3n3o5⁺[m+na⁺]:474.1247；found:474.1252；[α]d²⁵＝-7.6(c＝1.0,chcl3).

實(shí)施例2(s)-9-乙?；?2-氨基-3-氰基-4-(三氟甲基)-4,9-二氫吡喃并[2,3-b]吲哚-4-羧酸乙酯(化合物2)和9-乙?；?2-氨基-3-氰基-4-(三氟甲基)-4,9-二氫吡喃并[2,3-b]吲哚-4-羧酸乙酯(化合物2-a)的制備

參考實(shí)施例1化合物的合成方法，制備得到化合物2和2-a。產(chǎn)率73％，ee值47％。2-a產(chǎn)率98％。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ8.41(d,j＝8.1hz,1h),7.48(d,j＝7.7hz,1h),7.32(td,j＝22.1,7.5,1.1hz,2h),7.26(s,1h),5.48(s,2h),4.69–3.96(m,2h),2.72(s,3h),1.27(dd,j＝13.7,6.5hz,4h)ppm；¹³cnmr(126mhz,dmso)δ168.79,165.68,161.69,142.60,131.11,124.89(q,j＝283.8hz),124.37(d,j＝14.3hz),123.23,118.04,117.28,116.01,86.97,62.68,52.04(q,j＝28.8hz),50.71,26.70,13.80ppm；¹⁹fnmr(471mhz,cdcl3)δ-70.66(s,3f)ppm；theenantiomericexcessisdeterminedbyhplcwithachiralpakic-hcolumn(hexanes:isopropanol＝95:5,flowrate:1.0ml/min,λ＝254nm):tr＝16.89min(major),tr＝23.59min(minor)；hrms-ei(m/z):calcdforc18h14f3n3o4⁺[m+na⁺]:416.0829；found:416.0851；[α]d²⁵＝-20.2(c＝0.5,chcl3)。

實(shí)施例39-芐基4-乙基(s)-2-氨基-3-氰基-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-4,9(4h)-二羧酸酯(化合物3)和9-芐基4-乙基-2-氨基-3-氰基-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-4,9(4h)-二羧酸酯(化合物3-a)的制備

參考實(shí)施例1化合物的合成方法，制備得到化合物3和3-a。產(chǎn)率96％，ee值93％。3-a產(chǎn)率98％。

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.25–7.94(m,1h),7.60–7.37(m,6h),7.35–6.93(m,3h),5.59–5.37(m,2h),5.28(s,2h),4.49–4.18(m,2h),1.27(t,j＝7.1hz,3h)ppm；¹³cnmr(126mhz,cdcl3)δ165.65,161.43,149.36,142.55,134.53,131.46,129.29,129.03,128.71,124.89,124.55,124.59(q,j＝283.8hz),123.76,119.89,117.01,115.29,89.22,77.41,77.16,76.91,69.75,63.40,55.79,52.45(q,j＝30.0hz),14.10ppm；¹⁹fnmr(471mhz,cdcl3)δ-70.78(s,3f)ppm；theenantiomericexcessisdeterminedbyhplcwithachiralpakic-hcolumn(hexanes:isopropanol＝95:5,flowrate:1.0ml/min,λ＝254nm):tr＝22.91min(major),tr＝28.23min(minor)；hrms-ei(m/z):calcdforc24h19f3in3o5⁺[m+h⁺]:486.1271；found:486.1304；[α]d²⁵＝-10.0(c＝0.5,chcl3)。

實(shí)施例4(s)-2-氨基-6-氯-3-氰基-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-4,9(4h)-二羧酸9-(叔丁基)-4-乙酯(化合物9)和2-氨基-6-氯-3-氰基-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-4,9(4h)-二羧酸9-(叔丁基)-4-乙酯(化合物9-a)的制備

參考實(shí)施例1化合物的合成方法，制備得到化合物9和9-a。產(chǎn)率99％，ee值92％。9-a產(chǎn)率99％。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ8.00(d,j＝9.0hz,1h),7.48(s,1h),7.25-7.27(m,1h),5.48(s,2h),4.29-4.42(m,2h),1.69(s,9h),1.31(t,j＝7.0hz,3h)ppm；¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ165.5,161.4,147.5,143.5,129.9,129.8,124.8,123.4(q,j＝283.8hz),119.5,117.0,116.4,88.0,86.3,63.6,55.6,52.2(q,j＝30.0hz),28.2,14.1ppm；¹⁹fnmr(471mhz,cdcl3)δ-70.45(s,3f)ppm；theenantiomericexcessisdeterminedbyhplcwithachiralpakiccolumn(hexanes:isopropanol＝95:5,flowrate:1.0ml/min,λ＝254nm):tr＝12.70min(major),tr＝14.38min(minor)；hrms-ei(m/z):calcdforc21h19clf3n3o5⁺[m+na⁺]:508.0858；found:508.0864；[α]d²⁵＝-53.6(c＝1.0,chcl3)。

實(shí)施例5(s)-2-氨基-3-氰基-6-甲基-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-4,9(4h)-二羧酸9-(叔丁基)-4-乙酯(化合物5)和2-氨基-3-氰基-6-甲基-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-4,9(4h)-二羧酸9-(叔丁基)-4-乙酯(化合物5-a)的制備

參考實(shí)施例1化合物的合成方法，制備得到化合物5和5-a。產(chǎn)率99％，ee值94％。5-a產(chǎn)率95％。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.91(d,j＝8.5hz,1h),7.26(s,1h),7.11(d,j＝8.5hz,1h),5.43(s,2h),4.26-4.41(m,2h),2.40(s,3h),1.69(s,9h),1.28(t,j＝6.0hz,3h)ppm；¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ165.8,161.6,148.0,142.8,133.8,129.6,125.8,123.7,123.5(q,j＝285hz),119.6,117.2,114.9,88.4,85.6,63.3,55.7,52.5(q,j＝30.0hz),28.2,21.5,14.1ppm；¹⁹fnmr(471mhz,cdcl3)δ-70.88(s,3f)ppm；theenantiomericexcessisdeterminedbyhplcwithachiralpakad-hcolumn(hexanes:isopropanol＝98:2,flowrate:0.5ml/min,λ＝254nm):tr＝40.61min(minor),tr＝43.14min(major)；hrms-ei(m/z):calcdforc22h22f3n3o5⁺[m+na⁺]:488.1404；found:488.1405；[α]d²⁵＝-12.4(c＝1.0,chcl3)。

實(shí)施例6(s)-2-氨基-3-氰基-6-甲氧基-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-4,9(4h)-二羧酸9-(叔丁基)-4-乙酯(化合物6)和2-氨基-3-氰基-6-甲氧基-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-4,9(4h)-二羧酸9-(叔丁基)-4-乙酯(化合物6-a)的制備

參考實(shí)施例1化合物的合成方法，制備得到化合物6和6-a。產(chǎn)率99％，ee值94％。6-a產(chǎn)率98％。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.93(d,j＝9.0hz,1h),6.97(s,1h),6.88(dd,j＝9.5,2.5hz,1h),5.52(s,2h),4.26-4.39(m,2h),3.81(s,3h),1.68(s,9h),1.28(t,j＝7.0hz,3h)ppm；¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ165.7,161.6,156.7,147.9,143.1,125.8,124.5,124.3(q,j＝283.8hz),117.2,116.1,112.7,103.0,88.5,85.7,63.3,55.6(d,j＝30.0hz),52.4(q,j＝29.5hz),28.2,14.1ppm；¹⁹fnmr(471mhz,cdcl3)δ-70.71(s,3f)ppm；hrms-ei(m/z):calcdforc22h22f3n3o6⁺[m+na⁺]:504.1353；found:504.1360；[α]d²⁵＝-9.8(c＝1.0,chcl3)。

實(shí)施例7(s)-2-氨基-6-溴-3-氰基-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-4,9(4h)-二羧酸9-(叔丁基)-4-乙酯(化合物7)和2-氨基-6-溴-3-氰基-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-4,9(4h)-二羧酸9-(叔丁基)-4-乙酯(化合物7-a)的制備

參考實(shí)施例1化合物的合成方法，制備得到化合物7和7-a。產(chǎn)率99％，ee值90％。7-a產(chǎn)率98％。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.95(d,j＝8.5hz,1h),7.64(s,1h),7.40(dd,j＝9.0,2.0hz,1h),5.51(s,2h),4.29-4.42(m,2h),1.69(s,9h),1.31(t,j＝6.0hz,3h)ppm；¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ165.6,161.4,147.5,143.4,130.2,127.5,125.2,122.5,121.1(q,j＝283.8hz),117.5,117.0,116.7,87.9,86.4,63.6,55.5,52.0(q,j＝30.0hz),28.2,14.1ppm；¹⁹fnmr(471mhz,cdcl3)δ-70.42(s,3f)ppm；theenantiomericexcessisdeterminedbyhplcwithachiralpakiccolumn(hexanes:isopropanol＝95:5,flowrate:1.0ml/min,λ＝254nm):tr＝13.43min(major),tr＝15.06min(minor)。hrms-ei(m/z):calcdforc21h19brf3n3o5⁺[m+na⁺]:552.0352；found:552.0355；[α]d²⁵＝-60.4(c＝1.0,chcl3)。

實(shí)施例8(s)-2-氨基-6-氟-3-氰基-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-4,9(4h)-二羧酸9-(叔丁基)-4-乙酯(化合物8)和2-氨基-6-氟-3-氰基-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-4,9(4h)-二羧酸9-(叔丁基)-4-乙酯(化合物8-a)的制備

參考實(shí)施例1化合物的合成方法，制備得到化合物8和8-a。產(chǎn)率99％，ee值94％。8-a產(chǎn)率97％。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ8.01(dd,j＝9.0,4.5hz,1h),7.18(d,j＝9.0hz,1h),6.99-7.03(m,1h),5.51(s,2h),4.27-4.41(m,2h),1.69(s,9h),1.29(t,j＝7.0hz,3h)ppm；¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ165.5,161.4,160.8,158.9,147.6,143.7,127.5,124.6(d,j＝11.3hz),124.5(q,j＝283.8hz),117.0,116.5(d,j＝8.8hz),112.2(d,j＝24.5hz),106.1(d,j＝27.5hz),88.5,86.2,63.5,55.5,52.4(q,j＝30.0hz),28.2,14.1ppm；¹⁹fnmr(471mhz,cdcl3)δ-60.23(s,3f),-116.48(m,1f)ppm；theenantiomericexcessisdeterminedbyhplcwithachiralpakiccolumn(hexanes:isopropanol＝95:5,flowrate:1.0ml/min,λ＝254nm):tr＝12.42min(major),tr＝14.20min(minor)；hrms-ei(m/z):calcdforc21h19f4n3o5⁺[m+na⁺]:492.1153；found:492.1160；[α]d²⁵＝-41.4(c＝1.0,chcl3)。

實(shí)施例9(s)-2-氨基-3-氰基-9-甲基-4-(三氟甲基)-4,9-二氫吡喃并[2,3-b]吲哚-4-羧酸乙酯(化合物4)和2-氨基-3-氰基-9-甲基-4-(三氟甲基)-4,9-二氫吡喃并[2,3-b]吲哚-4-羧酸乙酯(化合物4-a)的制備

參考實(shí)施例1化合物的合成方法，制備得到化合物4和4-a。產(chǎn)率61％，ee值54％。4-a產(chǎn)率88％。

¹hnmr(400mhz,dmso)δ7.91(s,2h),7.49(d,j＝8.1hz,1h),7.32(d,j＝7.9hz,1h),7.20(t,j＝7.1hz,1h),7.13(t,j＝7.2hz,1h),4.43–4.00(m,2h),3.70(s,3h),1.13(t,j＝7.1hz,3h)ppm；¹³cnmr(125mhz,dmso)δ166.31,162.05,143.55,132.12,125.21(q,j＝283.8hz),121.96,121.36,120.95,118.06,117.86,109.99,80.35,62.26,52.67(q,j＝27.5hz),51.42,27.97,13.86ppm；¹⁹fnmr(471mhz,cdcl3)δ-70.69(s,3f)ppm；theenantiomericexcessisdeterminedbyhplcwithachiralpakic-hcolumn(hexanes:isopropanol＝95:5,flowrate:1.0ml/min,λ＝254nm):tr＝33.31min(major),tr＝45.65min(minor)。hrms-ei(m/z):calcdforc17h15f3n3o3⁺[m+h⁺]:366.1060；found:366.1063；[α]d²⁵＝10.2(c＝0.5,chcl3)。

實(shí)施例10(s)-2-氨基-6-碘-3-氰基-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-4,9(4h)-二羧酸9-(叔丁基)-4-乙酯(化合物10)和2-氨基-6-碘-3-氰基-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-4,9(4h)-二羧酸9-(叔丁基)-4-乙酯(化合物10-a)的制備

參考實(shí)施例1化合物的合成方法，制備得到化合物10和10-a。產(chǎn)率97％，ee值91％。10-a產(chǎn)率98％。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.82-7.84(m,2h),7.59(dd,j＝9.0,1.0hz,1h),5.52(s,2h),4.30-4.42(m,2h),1.69(s,9h),1.32(t,j＝6.0hz,3h)ppm；¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ165.6,161.4,147.5,143.1,133.2,130.9,128.5,125.7,121.1(q,j＝283.8hz),117.1,88.2,87.6,86.4,63.6,55.5,52.3(q,j＝28.8hz),28.2,14.1ppm；¹⁹fnmr(471mhz,cdcl3)δ-70.39(s,3f)ppm；theenantiomericexcessisdeterminedbyhplcwithachiralpakiccolumn(hexanes:isopropanol＝95:5,flowrate:1.0ml/min,λ＝254nm):tr＝14.45min(major),tr＝15.84min(minor)；hrms-ei(m/z):calcdforc21h19if3n3o5⁺[m+na⁺]:600.0214；found:600.0219；[α]d²⁵＝-76.6(c＝1.0,chcl3)。

實(shí)施例11(s)-2-氨基-3-氰基-6-(三氟甲氧基)-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-4,9(4h)-二羧酸(化合物11)和2-氨基-3-氰基-6-(三氟甲氧基)-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-4,9(4h)-二羧酸(化合物11-a)的制備

參考實(shí)施例1化合物的合成方法，制備得到化合物11和11-a。產(chǎn)率93％，ee值86％。11-a產(chǎn)率96％。

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.10(d,j＝7.2hz,1h),7.38(s,1h),7.18(dd,j＝7.2,1.2hz,1h),5.44(s,2h),4.31-4.36(m,2h),1.69(s,9h),1.29(t,j＝5.6hz,3h)ppm；¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ165.5,161.4,147.5,145.8,143.8,129.7,124.5,124.5(q,j＝276.3hz),122.4(q,j＝258hz),117.9,116.9,116.4,112.7,88.5,86.5,63.6,55.7,52.2(q,j＝29.6hz),28.2,14.0ppm；¹⁹fnmr(471mhz,cdcl3)δ-58.19(s,3f),-70.41(s,3f)ppm；theenantiomericexcessisdeterminedbyhplcwithachiralpakiccolumn(hexanes:isopropanol＝95:5,flowrate:1.0ml/min,λ＝254nm):tr＝8.21min(major),tr＝9.94min(minor)；hrms-ei(m/z):calcdforc22h19f6n3o6⁺[m+na⁺]:558.1070；found:558.1073；[α]d²⁵＝-11.6(c＝1.0,chcl3)。

實(shí)施例12(s)-2-氨基-7-溴-3-氰基-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-4,9(4h)-二羧酸9-(叔丁基)-4-乙酯(化合物12)和2-氨基-7-溴-3-氰基-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-4,9(4h)-二羧酸9-(叔丁基)-4-乙酯(化合物12-a)的制備

參考實(shí)施例1化合物的合成方法，制備得到化合物12和12-a。產(chǎn)率94％，ee值98％。12-a產(chǎn)率92％。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ8.28(s,1h),7.34-7.39(m,2h),5.48(s,2h),4.25-4.38(m,2h),1.69(s,9h),1.26(t,j＝7.0hz,3h)ppm；¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ165.6,161.4,147.5,142.9,132.1,127.4,124.5(q,j＝283.8hz),121.0(d,j＝18.8hz),118.5,117.9,117.0,88.5,86.5,63.4,55.5,52.3(q,j＝30.0hz),28.2,14.1ppm；¹⁹fnmr(471mhz,cdcl3)δ-70.62(m,3f)ppm；theenantiomericexcessisdeterminedbyhplcwithachiralpakiccolumn(hexanes:isopropanol＝95:5,flowrate:1.0ml/min,λ＝254nm):tr＝13.03min(major),tr＝15.31min(minor)；hrms-ei(m/z):calcdforc21h19brf3n3o5⁺[m+na⁺]:522.0352；found:552.0358；[α]d²⁵＝-32.2(c＝1.0,chcl3)。

實(shí)施例13(s)-2-氨基-3-氰基-8-氟-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-4,9(4h)-二羧酸9-(叔丁基)-4-乙酯(化合物13)和2-氨基-3-氰基-8-氟-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-4,9(4h)-二羧酸9-(叔丁基)-4-乙酯(化合物13-a)的制備

參考實(shí)施例1化合物的合成方法，制備得到化合物13和13-a。產(chǎn)率99％，ee值98％。13-a產(chǎn)率99％。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.28(d,j＝8.0hz,1h),7.18-7.22(m,1h),7.00-7.04(m,1h),5.58(s,2h),4.26-4.40(m,2h),1.65(s,9h),1.28(t,j＝7.0hz,3h)ppm；¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ165.6,161.5,150.8,148.8,146.7,143.5,127.0(d,j＝3.3hz),124.8(d,j＝7.4hz),123.4(q,j＝283.8hz),118.6(d,j＝9.9hz),117.0,115.6,111.5(d,j＝20.8hz),88.0,86.5,63.4,55.6,52.1(q,j＝30.1hz),27.8,14.1ppm；¹⁹fnmr(471mhz,cdcl3)δ-60.48(s,3f),-133.54(m,1f)ppm；theenantiomericexcessisdeterminedbyhplcwithachiralpakiccolumn(hexanes:isopropanol＝95:5,flowrate:1.0ml/min,λ＝254nm):tr＝11.54min(major),tr＝12.83min(minor)；hrms-ei(m/z):calcdforc21h19f4n3o5⁺[m+na⁺]:492.1153；found:492.1158；[α]d²⁵＝-16.8(c＝1.0,chcl3)。

實(shí)施例14(s)-2-氨基-3-氰基-8-溴-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-4,9(4h)-二羧酸9-(叔丁基)-4-乙酯(化合物14)和2-氨基-3-氰基-8-溴-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-4,9(4h)-二羧酸9-(叔丁基)-4-乙酯(化合物14-a)的制備

參考實(shí)施例1化合物的合成方法，制備得到化合物14和14-a。產(chǎn)率98％，ee值97％。14-a產(chǎn)率97％。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.46-7.50(m,2h),7.10-7.13(m,1h),5.37(s,2h),4.26-4.40(m,2h),1.67(s,9h),1.29(t,j＝7.0hz,3h)ppm；¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ165.6,161.2,146.3,143.5,129.8,129.0,126.9,125.0,124.5(q,j＝283.8hz),119.2(d,j＝2.5hz),117.0,107.3,87.1,86.5,63.5,56.3,52.5(q,j＝30.0hz),27.9,14.1ppm；¹⁹fnmr(471mhz,cdcl3)δ-70.62(m,3f)ppm；theenantiomericexcessisdeterminedbyhplcwithachiralpakiccolumn(hexanes:isopropanol＝95:5,flowrate:1.0ml/min,λ＝254nm):tr＝10.77min(major),tr＝12.46min(minor)；hrms-ei(m/z):calcdforc21h19brf3n3o5⁺[m+na⁺]:552.0352；found:552.0356；[α]d²⁵＝-44.4(c＝0.5,chcl3)。

實(shí)施例15(s)-2-氨基-3-氰基-4-(三氟甲基)吡喃并[3'，2'：4,5]吡咯并[2,3-b]吡啶-4，9(4h)-二羧酸酯(化合物15)和2-氨基-3-氰基-4-(三氟甲基)吡喃并[3'，2'：4,5]吡咯并[2,3-b]吡啶-4，9(4h)-二羧酸酯(化合物15-a)的制備

參考實(shí)施例1化合物的合成方法，制備得到化合物15和15-a。產(chǎn)率95％，ee值85％。15-a產(chǎn)率94％。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ8.44(dd,j＝5.0,1.5hz,1h),7.87(d,j＝6.4hz,1h),7.22-7.24(m,1h),5.35(s,2h),4.27-4.39(m,2h),1.69(s,9h),1.28(t,j＝5.6hz,3h)ppm；¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ165.4,161.0,146.4,144.8,144.4,142.8,128.4,124.5(q,j＝283.8hz),120.0,117.4,116.9,86.1,85.7,63.5,56.0,52.0(q,j＝30.1hz),28.2,14.1ppm；¹⁹fnmr(471mhz,cdcl3)δ-70.55(s,3f)ppm；theenantiomericexcessisdeterminedbyhplcwithachiralpakiccolumn(hexanes:isopropanol＝97:3,flowrate:0.8ml/min,λ＝254nm):tr＝42.83min(minor),tr＝50.65min(major)；hrms-ei(m/z):calcdforc20h20f3n4o5⁺[m+h⁺]:453.1380；found:453.1382；[α]d²⁵＝-24.0(c＝0.5,chcl3)。

實(shí)施例16(s)-2-氨基-3-氰基-6,8-二甲基-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-4,9(4h)-二羧酸(化合物16)和2-氨基-3-氰基-6,8-二甲基-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-4,9(4h)-二羧酸(化合物16-a)的制備

參考實(shí)施例1化合物的合成方法，制備得到化合物16和16-a。產(chǎn)率94％，ee值88％。16-a產(chǎn)率98％。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.11(s,1h),6.91(s,1h),5.38(s,2h),4.25-4.41(m,2h),2.40(s,3h),2.36(s,3h),1.65(s,9h),1.28(t,j＝7.0hz,3h)ppm；¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ166.0,161.6,147.7,142.8,133.7,128.9,128.7,124.9,124.2,124.5(q,j＝283.8hz),117.4,86.8,85.7,63.2,56.0,52.5(q,j＝28.8hz),28.1,21.4,20.6,14.1ppm；¹⁹fnmr(471mhz,cdcl3)δ-70.88(s,3f)ppm；hrms-ei(m/z):calcdforc23h24f3n3o5⁺[m+na⁺]:502.1560；found:502.1566；[α]d²⁵＝-9.2(c＝1.0,chcl3)。

實(shí)施例17(s/r)-2-氨基-3-氰基-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-9(4h)-羧酸叔丁酯(化合物17)和2-氨基-3-氰基-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-9(4h)-羧酸叔丁酯(化合物17-a)的制備

參考實(shí)施例1化合物的合成方法，制備得到化合物17和17-a。產(chǎn)率99％，ee值86％。

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.03-8.05(m,1h),7.46-7.48(m,1h),7.28-7.33(m,2h),5.28(s,2h),4.39(q,j＝5.2hz,1h),1.69(s,9h)ppm；¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ162.3,148.1,143.2,131.7,124.5,124.3(q,j＝280hz),124.1,118.9,118.5,115.3,88.7,85.6,52.7,37.7(q,j＝32.5hz),28.3ppm；¹⁹fnmr(471mhz,cdcl3)δ-72.19(m,3f)ppm；theenantiomericexcessisdeterminedbyhplcwithachiralpakiccolumn(hexanes:isopropanol＝95:5,flowrate:1.0ml/min,λ＝254nm):tr＝7.63min(major),tr＝8.34min(minor)；hrms-ei(m/z):calcdforc18h16f3n3o3⁺[m+na⁺]:402.1306；found:402.1320；[α]d²⁵＝-7.4(c＝1.0,chcl3)。

實(shí)施例18(s)-2-氨基-3-氰基-6-甲氧基-4-(三氟甲基)-4,9-二氫吡喃并[2,3-b]吲哚-4-羧酸乙酯(化合物18)和2-氨基-3-氰基-6-甲氧基-4-(三氟甲基)-4,9-二氫吡喃并[2,3-b]吲哚-4-羧酸乙酯(化合物18-a)的制備

將實(shí)施例6中的化合物6加入到0.5ml二氯甲烷中，滴加0.1ml三氟乙酸，室溫反應(yīng)，反應(yīng)完畢，濃縮，柱層析得到化合物18和18-a。產(chǎn)率92％，ee值94％。18-a產(chǎn)率99％。

¹hnmr(400mhz,dmso-6d)δ12.29(br,1h),7.79(s,2h),7.24(d,j＝9.6hz,1h),6.75-6.77(m,2h),4.15-4.30(m,2h),3.69(s,3h),1.14(t,j＝7.2hz,3h)ppm；¹³cnmr(125mhz,dmso-6d)δ167.3,163.1,155.1,145.2,126.6,126.2(q,j＝283.8hz),124.2,119.0,113.4,111.0,102.0,81.5,63.1,56.2,53.3(q,j＝27.6hz),14.8ppm.theenantiomericexcessisdeterminedbyhplcwithachiralpakas-hcolumn(hexanes:isopropanol＝95:5,flowrate:1.0ml/min,λ＝254nm):tr＝14.19min(minor),tr＝17.84min(major)；hrms-ei(m/z):calcdforc17h14f3n3o4⁺[m+na⁺]:404.0829；found:404.0836；[α]d²⁵＝-10.4(c＝1.0,chcl3)。

實(shí)施例19(s)-2-氨基-3-氰基-6,8-二甲基-4-(三氟甲基)-4,9-二氫吡喃并[2,3-b]吲哚-4-羧酸乙酯(化合物19)和2-氨基-3-氰基-6,8-二甲基-4-(三氟甲基)-4,9-二氫吡喃并[2,3-b]吲哚-4-羧酸乙酯(化合物19-a)的制備

參考實(shí)施例1與實(shí)施例18化合物的合成方法，制備得到化合物19和19-a。產(chǎn)率95％，ee值88％。19a產(chǎn)率96％。

¹hnmr(400mhz,dmso-6d)δ11.93(br,1h),7.75(s,2h),6.89(s,1h),6.74(s,1h),4.12-4.30(m,2h),2.37(s,3h),2.28(s,3h),1.14(t,j＝7.2hz,3h)ppm；¹³cnmr(125mhz,dmso-6d)δ167.4,163.1,145.0,130.2,129.3,124.6,123.8(q,j＝283.8hz),123.6,121.6,119.1,116.1,80.0,63.0,53.3(q,j＝27.5hz),52.0,22.1,17.4,14.8ppm；theenantiomericexcessisdeterminedbyhplcwithachiralpakad-hcolumn(hexanes:isopropanol＝95:5,flowrate:1.0ml/min,λ＝254nm):tr＝8.81min(minor),tr＝10.19min(major)；hrms-ei(m/z):calcdforc18h16f3n3o5⁺[m+na⁺]:402.1036；found:402.1046；[α]d²⁵＝-12.0(c＝1.0,chcl3)。

實(shí)施例209-(叔丁基)-4-甲基(s)-2-氨基-3-氰基-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-4,9(4h)-二羧酸酯(化合物20)和9-(叔丁基)-4-甲基-2-氨基-3-氰基-4-(三氟甲基)吡喃并[2,3-b]吲哚-4,9(4h)-二羧酸酯(化合物20-a)的制備

參考實(shí)施例1化合物的合成方法，制備得到化合物20和20-a。產(chǎn)率99％，ee值86％。20-a產(chǎn)率98％。

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.05-8.07(m,1h),7.46-7.48(m,1h),7.25-7.33(m,2h),5.47(s,2h),3.84(s,3h),1.70(s,9h)ppm；¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ166.3,161.7,147.9,142.9,131.5,128.0,125.7(q,j＝280hz),124.6,124.3,123.6，123.4,121.2,119.5,117.2,115.3,88.5,85.9,55.5,52.6(q,j＝32.5hz),28.3ppm；hrms-ei(m/z):calcdforc20h18f3n3o5⁺[m+h⁺]:437.1199；found:402.1320。

實(shí)施例21(s)-2-氨基-3-氰基-4-(三氟甲基)-4,9-二氫吡喃并[2,3-b]吲哚-4-羧酸乙酯(化合物21)和2-氨基-3-氰基-4-(三氟甲基)-4,9-二氫吡喃并[2,3-b]吲哚-4-羧酸乙酯(化合物21-a)的制備

參考實(shí)施例1與實(shí)施例18化合物的合成方法，制備得到化合物21和21-a。產(chǎn)率95％，ee值88％。21-a產(chǎn)率97％。

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.58(s,h),7.58(m,1h),7.17-7.26(m,3h),5.24(br,2h),4.34-4.41(m,2h),1.26-1.43(m,3h)ppm；¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ166.9,161.5,143.1,130.7,123.3,122.5,121.6(q,j＝283.8hz),119.8,111.2,82.7,63.3,14.0ppm；hrms-ei(m/z):calcdforc16h12f3n3o3⁺[m+h⁺]:402.1036；found:351.0831。

實(shí)施例22

在本實(shí)施例中，利用hiv潛伏感染庫細(xì)胞系j-lata10.6篩選有效的激活化合物，方法如下：

實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞j-lata10.6，7-aad抗體

實(shí)驗(yàn)操作

復(fù)蘇細(xì)胞：從液氮中取出的j-lat細(xì)胞，蓋緊凍存管的瓶蓋，于37℃水浴鍋中復(fù)蘇，快速搖晃，直到細(xì)胞全部溶解。迅速將溶解后的細(xì)胞置于離心機(jī)中1000rpm離心約3min。吸去上清，用1ml1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至5cm培養(yǎng)皿，另外加入3ml新鮮1640完全培養(yǎng)基，于37℃，5％co2恒溫培養(yǎng)箱中復(fù)蘇2天。待細(xì)胞恢復(fù)活力后，收集j-lat細(xì)胞。取lymphoprep淋巴細(xì)胞分離液4ml加入一新的15ml離心管，用2.5ml巴氏吸管將細(xì)胞沿管壁逐滴加入到分離液液面，共加入10ml細(xì)胞液，1000g離心30min，控制開始加速度為3。離心后將j-lat細(xì)胞層吸出，加入8ml的rpmi1640重懸細(xì)胞，350g離心7分鐘。離心后，倒出上清，沉淀細(xì)胞用2mlrpmi1640完全培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞濃度。得出細(xì)胞濃度后，將j-lat細(xì)胞稀釋成1500萬/ml的濃度。重懸細(xì)胞后，將j-lat加入到96孔u(yù)底板，每孔200μl。加入稀釋好的刺激物，一般先將化合物稀釋為終濃度的20倍，后每孔加入10μl化合物到200μl的j-lat細(xì)胞中即得最終濃度。37℃，5％co2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，此時(shí)間可根據(jù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整。j-lat被激活后，進(jìn)行7-aad(bd)死細(xì)胞染料染色，每孔加入7-aad10μl。37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5mlep管內(nèi)，加入1mlpbs洗滌細(xì)胞后350g離心5min，棄培養(yǎng)基。重復(fù)(3)加入1mlpbs重懸細(xì)胞，350g離心5min，棄上清。用300μlpbs重懸細(xì)胞。用bdc6流式檢測，flowjow分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在本實(shí)施例中設(shè)置了1um、10um、100um、100nm濃度的化合物實(shí)驗(yàn)組，以mock代表陰性對照刺激組(dmso作為溶劑對照)，陽性對照pma組或陽性對照pma+iono組和陽性對照vpa組，其中pma為佛波酯，vpa為丙戊酸鈉，iono為離子霉素，結(jié)果如圖1所示，化合物9(本發(fā)明中將其命名為gibh-lra002)顯示出了很好的激活效果。圖1a顯示我們篩選細(xì)胞系j-lat可以通過表達(dá)gfp(綠色螢光蛋白)顯示藥物的激活效果；圖1b顯示了不同化合物的激活效果，編號1-12對應(yīng)本發(fā)明實(shí)施例制備得到的化合物1-12，可以看出化合物9的激活效果最好，表現(xiàn)為gfp表達(dá)水平最高；圖1c顯示化合物9(gibh-lra002)可以使j-lat表達(dá)的gfp從5.06％升高至23.0％，其效果在100μm用量下達(dá)到最大。陽性刺激化合物pma以及vpa可高水平地激活j-lat細(xì)胞系中的潛伏hiv，表明我們的篩選模型是良好的，化合物9表現(xiàn)出了較好的激活水平。

實(shí)驗(yàn)例23

在本實(shí)施例中，對化合物9(gibh-lra002)能有效激活siv感染的獼猴cd4+t細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證，方法如下：

實(shí)驗(yàn)材料

siv感染的獼猴；非人靈長類cd4+t細(xì)胞分選試劑盒；

實(shí)驗(yàn)操作

取siv感染獼猴的抗凝血，將抗凝血分離pbmc，將pbmc通過磁珠分選出cd4+t細(xì)胞，將cd4+t細(xì)胞與不同濃度的gibh-lra002共孵育24h，收集共孵育后的cd4+t細(xì)胞，提取胞內(nèi)rna，對rna進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄變?yōu)閏dna，將cdna分別用msrna和usrna的引物進(jìn)行第一輪pcr。對msrna和usrna的第一輪pcr產(chǎn)物進(jìn)行稀釋，并作為第二輪熒光定量pcr的模板，利用兩種rna的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行絕對定量，得出一定數(shù)量cd4+t細(xì)胞中msrna和usrna的絕對數(shù)量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2a顯示了該實(shí)驗(yàn)流程，具體是：獼猴siv感染模型作為模擬人感染hiv的最佳模型，選用siv感染的獼猴pbmc，分選出siv感染的靶細(xì)胞cd4+t細(xì)胞，對攜帶有siv儲存庫的cd4+t細(xì)胞進(jìn)行激活檢測；設(shè)置了100nm、1um、10um的化合物實(shí)驗(yàn)組，并以mock為陰性對照(dmso作為溶劑對照)，以本領(lǐng)域常用的化合物pma+ion(佛波酯+離子霉素)和vpa(丙戊酸鈉)作為陽性對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物9(gibh-lra002)能有效激活siv感染的獼猴cd4+t細(xì)胞，選用前病毒轉(zhuǎn)錄出來的胞內(nèi)rna作為檢測指標(biāo)：msrna(如圖2b所示)和usrna(如圖2c所示)，發(fā)現(xiàn)在gibh-lra002刺激cd4+t細(xì)胞24小時(shí)后，兩種rna的量都上升了，因此說明gibh-lra002能夠有效激活原代細(xì)胞的siv病毒pma+ion可高水平地激活潛伏siv病毒的轉(zhuǎn)錄，而vpa盡管可在j-lat細(xì)胞中激活潛伏hiv，但在感染獼猴的原代cd4+t細(xì)胞中激活很低。值得說明地是，gibh-lra002化合物的激活水平很高，介于vpa和pma+ion的激活水平之間。

實(shí)驗(yàn)例24

在本實(shí)施例中，對gibh-lra002能有效激活hiv感染患者的cd4+t細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證，方法如下：

實(shí)驗(yàn)材料

hiv感染患者的新鮮血液；cd4+t細(xì)胞磁珠分選試劑盒；

實(shí)驗(yàn)操作

取hiv感染患者的抗凝血，將抗凝血分離pbmc，將pbmc通過磁珠分選出cd4+t細(xì)胞，將cd4+t細(xì)胞與不同濃度的gibh-lra002共孵育24h，收集共孵育后的cd4+t細(xì)胞，提取胞內(nèi)rna，對rna進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄變?yōu)閏dna，將cdna分別用msrna和usrna的引物進(jìn)行第一輪pcr。對msrna和usrna的第一輪pcr產(chǎn)物進(jìn)行稀釋，并作為第二輪熒光定量pcr的模板，利用兩種rna的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行絕對定量，得出一定數(shù)量cd4+t細(xì)胞中msrna和usrna的絕對數(shù)量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3a顯示了對攜帶有hiv儲存庫的cd4+t細(xì)胞進(jìn)行激活檢測的流程。本實(shí)施例中，我們隨機(jī)使用了4個(gè)艾滋病人的標(biāo)本，編號分別為#1，#2，#3，#4。我們發(fā)現(xiàn)gibh-lra002能有效激活hiv感染者的cd4+t細(xì)胞，選用前病毒轉(zhuǎn)錄出來的胞內(nèi)rna作為檢測指標(biāo)：msrna(如圖3b所示)和usrna(如圖3c所示)；設(shè)置了10um、100um的化合物濃度組，并以mock為陰性對照(dmso作為溶劑對照)，以本領(lǐng)域常用的化合物pma+ion(佛波酯+離子霉素)和vpa(丙戊酸鈉)作為陽性對照，結(jié)果顯示在gibh-lra002刺激cd4+t細(xì)胞24小時(shí)后，兩種rna的量都上升了，因此說明gibh-lra002能夠有效激活原代細(xì)胞的hiv病毒。pma+ion可高水平地激活潛伏hiv病毒的轉(zhuǎn)錄，而vpa盡管可在j-lat細(xì)胞中激活潛伏hiv，但在病人的原代cd4+t細(xì)胞中沒有激活效果。值得說明地是，gibh-lra002化合物的激活水平很高，可達(dá)到pma+ion的激活水平。

實(shí)施例25

在本實(shí)施例中，對gibh-lra002在效應(yīng)濃度處的細(xì)胞毒性以及對t細(xì)胞的激活作用進(jìn)行測定，方法如下：

實(shí)驗(yàn)材料

j-lata10.6細(xì)胞系；獼猴pbmc；qpcr檢測試劑；流式抗體；cck8試劑盒

實(shí)驗(yàn)操作

用cck8試劑盒檢測不同濃度的gibh-lra002對j-lat細(xì)胞系和獼猴pbmc細(xì)胞活力的影響：通過加入細(xì)胞培養(yǎng)體積10％的cck8到培養(yǎng)基中培養(yǎng)2h，后檢測發(fā)射廣譜的熒光強(qiáng)度確定細(xì)胞活力；檢測gibh-lra002對t細(xì)胞激活的影響：分泌獼猴pbmc，將as2o3與獼猴pbmc孵育24小時(shí)，收集細(xì)胞后，流式染色分析，檢測cd25、cd38、cd69、hla-dr的差異，染色后洗滌，流式檢測。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在本實(shí)施例中，設(shè)置了10um、100um和500um的化合物濃度組，以mock為陰性對照(即以dmso作為溶劑對照)，以本領(lǐng)域常用的化合物pma+ion(佛波酯+離子霉素)作為陽性對照，結(jié)果如圖4所示，使用獼猴細(xì)胞以及j-lat細(xì)胞，驗(yàn)證了化合物9(gibh-lra002)在100μm以內(nèi)對細(xì)胞活性影響很小。如圖5所示，同時(shí)通過流式檢測cd4+t細(xì)胞的激活標(biāo)志物cd25即cd4+cd25+(如圖5a所示)，cd4+cd69+(如圖5c所示)和cd4+ccr5+(如圖5e所示)，cd3+cd25+(如圖5b所示)，cd69+cd3+(如圖5d所示)和ccr5+cd3+(如圖5f所示)，發(fā)現(xiàn)gibh-lra002也不會(huì)引起t細(xì)胞的非特異性激活，表現(xiàn)為上述激活標(biāo)記物(cd25，cd69，ccr5)沒有表達(dá)上升，而陽性刺激物(pma+iono)可刺激這些激活標(biāo)記物的大幅度上升。

申請人聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的吡喃并吲哚類化合物及其制備方法和應(yīng)用，但本發(fā)明并不局限于上述實(shí)施例，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述實(shí)施例才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進(jìn)，對本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。