本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種采用分子生物學(xué)手段檢測微生物耐藥基因的方法，具體為一種用于檢測葡萄球菌磺胺類藥物耐藥基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：隨著動物養(yǎng)殖業(yè)向規(guī)?；?、集約化方向發(fā)展，飼養(yǎng)密度提高，應(yīng)激因素增多，為疾病的流行提供了有利條件，導(dǎo)致動物細(xì)菌性疾病的危害加重。國內(nèi)外大量資料表明，多年來由于臨床抗生素廣泛及不合理的使用，給細(xì)菌帶來了選擇壓力，其最終結(jié)果是選擇性保留了耐藥能力強(qiáng)的致病菌，給感染性疾病的治療帶來了嚴(yán)重的危機(jī)。細(xì)菌耐藥性已成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)。我國已成為世界上細(xì)菌耐藥性最嚴(yán)重的國家之一。1997年解放軍總醫(yī)院報道大腸埃希菌對環(huán)丙沙星的耐藥率從1994年的41.9％上升至1997年的60.4％。王紅寧、朱力軍、高松等的研究表明，雞源、豬源大腸桿菌對常用抗菌藥如氨基糖苷類、氯霉素類、磺胺類等產(chǎn)生的耐藥率在38～95％，并且有70.2％以上的菌株是多重耐藥；郝秀紅、馬聰?shù)葘εR床病原菌的研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌、沙門氏菌以及金葡萄球菌對慶大霉素、頭孢唑啉、青霉素的平均耐藥率超過50.0％。分子生物學(xué)方法在細(xì)菌耐藥性方面的應(yīng)用非常廣泛，與傳統(tǒng)的表型檢測相比，它更能準(zhǔn)確反映耐藥性的傳播和流行趨勢。綜合比較幾種基因檢測方法，pcr方法因其操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，在現(xiàn)有技術(shù)條件下，該方法在臨床上的應(yīng)用前景將會非常廣闊。但是單基因pcr方法的最大不足之處在于檢測的指標(biāo)過于單一，而多重pcr具有高效性，即在同一pcr反應(yīng)管內(nèi)同時檢出多種病原微生物，或?qū)τ卸鄠€目標(biāo)基因進(jìn)行分型，特別是用一滴血就能檢測多種病原體。同時，多重pcr方法經(jīng)濟(jì)簡便，多種病原體在同一反應(yīng)管內(nèi)同時檢出，將大大的節(jié)省時間，節(jié)省試劑，節(jié)約經(jīng)費(fèi)開支，為臨床提供更多更準(zhǔn)確的診斷信息。pcr檢測試劑盒能快速、準(zhǔn)確地對細(xì)菌耐藥性進(jìn)行檢測，但目前國內(nèi)還未見動物源細(xì)菌耐藥性檢測試劑盒的研究和報道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，獲得一種快速、穩(wěn)定的動物源細(xì)菌耐藥性的檢測方法，本發(fā)明提供了一種用于檢測葡萄球菌磺胺類藥物耐藥基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。技術(shù)方案：一種用于檢測葡萄球菌磺胺類藥物耐藥基因的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。優(yōu)選的，所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5，端進(jìn)行氨基化修飾并附加10個堿基t。表1分子標(biāo)記序列名稱序列(5，-3，)seqidno.p1-fnh2-t(10)catcattttcggcatcgtc1p1-rtcttgcggtttctttcagc2p2-fnh2-t(10)agatgtgattgatttgggagc3p2-rtagttgtttctggattagagcct4p3-fnh2-t(10)cattgcctggttgcttcat5p3-ratccgactcgcagcattt6所述分子標(biāo)記在制備檢測葡萄球菌磺胺類藥物耐藥基因試劑盒中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。優(yōu)選的，所述試劑盒檢測葡萄球菌磺胺類藥物耐藥基因的步驟包括：(1)取樣：選取純化后的葡萄球菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個菌落，向無菌ep管中加入10～60μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋200～500倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋10～100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。優(yōu)選的，所述pcr擴(kuò)增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。優(yōu)選的，所述第一輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。優(yōu)選的，所述第二輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃，5min。優(yōu)選的，所述第三輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環(huán)；72℃，4min。有益效果：(1)本發(fā)明所述分子標(biāo)記具有良好的敏感性、特異性和重復(fù)性，具有敏感、特異、快速的優(yōu)點(diǎn)，為我國動物源細(xì)菌磺胺類藥物耐藥基因的檢測及流行病學(xué)調(diào)查提供新的技術(shù)手段；(2)本發(fā)明所述分子標(biāo)記的應(yīng)用方式，無需質(zhì)粒dna的提取，且經(jīng)過三輪pcr可準(zhǔn)確檢測動物源性葡萄球菌磺胺類藥物的耐藥基因。附圖說明圖1是實(shí)施例1～3檢測結(jié)果圖；其中，1為分子量為1500bp的maker；3為實(shí)施例1pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果；4為實(shí)施例2pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果；5為實(shí)施例3pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果。具體實(shí)施方式實(shí)施例1一種用于檢測葡萄球菌磺胺類藥物耐藥基因的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5，端進(jìn)行氨基化修飾并附加10個堿基t。所述分子標(biāo)記在制備檢測葡萄球菌磺胺類藥物耐藥基因試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。所述試劑盒檢測葡萄球菌磺胺類藥物耐藥基因的步驟包括：(1)取樣：選取純化后的葡萄球菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個菌落，向無菌ep管中加入10μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋200倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋10倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述pcr擴(kuò)增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。所述第一輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。所述第二輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃，5min。所述第三輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環(huán)；72℃，4min。實(shí)施例2一種用于檢測葡萄球菌磺胺類藥物耐藥基因的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5，端進(jìn)行氨基化修飾并附加10個堿基t。所述分子標(biāo)記在制備檢測葡萄球菌磺胺類藥物耐藥基因試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。所述試劑盒檢測葡萄球菌磺胺類藥物耐藥基因的步驟包括：(1)取樣：選取純化后的葡萄球菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個菌落，向無菌ep管中加入30μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋350倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋50倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述pcr擴(kuò)增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。所述第一輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。所述第二輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃，5min。所述第三輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環(huán)；72℃，4min。實(shí)施例3一種用于檢測葡萄球菌磺胺類藥物耐藥基因的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5，端進(jìn)行氨基化修飾并附加10個堿基t。所述分子標(biāo)記在制備檢測葡萄球菌磺胺類藥物耐藥基因試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。所述試劑盒檢測葡萄球菌磺胺類藥物耐藥基因的步驟包括：(1)取樣：選取純化后的葡萄球菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個菌落，向無菌ep管中加入60μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋500倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述pcr擴(kuò)增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。所述第一輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。所述第二輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃，5min。所述第三輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環(huán)；72℃，4min。sequencelisting<110>蘇州喬納森新材料科技有限公司<120>一種用于檢測葡萄球菌磺胺類藥物耐藥基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用<130><160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列<400>1catcattttcggcatcgtc19<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列<400>2tcttgcggtttctttcagc19<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列<400>3agatgtgattgatttgggagc21<210>4<211>23<212>dna<213>人工序列<400>4tagttgtttctggattagagcct23<210>5<211>19<212>dna<213>人工序列<400>5cattgcctggttgcttcat19<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列<400>6atccgactcgcagcattt18當(dāng)前第1頁12