本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及一種采用分子生物學手段檢測微生物耐藥基因的方法，具體為一種用于檢測肉雞沙門氏菌環(huán)丙沙星耐藥基因的分子標記及其應用。

背景技術：

抗生素類藥物作為預防、治療細菌類疾病的首選藥物在畜牧業(yè)生產(chǎn)中被廣泛使用，但由于使用不當和用藥壓力，出現(xiàn)了耐藥現(xiàn)象。沙門氏菌是一種常見的人獸共患病原菌，對動物和人都有很大的危害。沙門氏菌在長期進化過程中不斷變化，也出現(xiàn)了多重耐藥現(xiàn)象。禽類是沙門氏菌的主要宿主之一，各種日齡的禽類都能被感染。作為重要的食源性病原菌，沙門氏菌可以通過污染的畜禽肉產(chǎn)品、蛋類、奶類、甚至海洋產(chǎn)品等多種渠道感染人類，而感染情況主要取決于細菌血清型和使用者的身體狀況。體質低弱的人群極易感染，感染后有多種臨床表現(xiàn)，主要以急性腸胃炎為主。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是：為了克服現(xiàn)有技術的缺陷，獲得一種能夠快速檢測沙門氏菌的攜帶情況，為研究肉雞屠宰生產(chǎn)鏈沙門氏菌耐藥性與耐藥基因的關系提供參考，本發(fā)明提供了一種用于檢測肉雞沙門氏菌環(huán)丙沙星耐藥基因的分子標記及其應用。

技術方案：一種用于檢測肉雞沙門氏菌環(huán)丙沙星耐藥基因的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。

優(yōu)選的，所述分子標記p1、p2和p3的上游引物5，端進行氨基化修飾并附加10個堿基t。

表1分子標記序列

所述分子標記在制備檢測肉雞沙門氏菌環(huán)丙沙星耐藥基因試劑盒中的應用。

優(yōu)選的，所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應緩沖液、mgcl2、雙蒸水。

優(yōu)選的，所述試劑盒檢測肉雞沙門氏菌環(huán)丙沙星耐藥基因的步驟包括：

(1)取樣：選取純化后的肉雞沙門氏菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個菌落，向無菌ep管中加入10～60μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；

(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；

(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋200～500倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；

(4)取第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，稀釋10～100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；

(5)收集第三輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

優(yōu)選的，所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。

優(yōu)選的，所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。

優(yōu)選的，所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃，5min。

優(yōu)選的，所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環(huán)；72℃，4min。

有益效果：(1)本發(fā)明所述分子標記能夠快速檢測沙門氏菌的攜帶情況，為研究肉雞屠宰生產(chǎn)鏈沙門氏菌耐藥性與耐藥基因的關系提供參考，也為控制肉雞屠宰生產(chǎn)鏈沙門氏菌的耐藥性提供基礎數(shù)據(jù)；(2)本發(fā)明所述分子標記的檢測結果具有穩(wěn)定性高的優(yōu)點。

附圖說明

圖1是實施例1～3檢測結果圖；

其中，m為分子量為2000bp的maker；1為實施例1pcr產(chǎn)物電泳結果；2為實施例2pcr產(chǎn)物電泳結果；3為實施例3pcr產(chǎn)物電泳結果。

具體實施方式

實施例1

一種用于檢測肉雞沙門氏菌環(huán)丙沙星耐藥基因的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。

所述分子標記p1、p2和p3的上游引物5，端進行氨基化修飾并附加10個堿基t。

所述分子標記在制備檢測肉雞沙門氏菌環(huán)丙沙星耐藥基因試劑盒中的應用。

所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應緩沖液、mgcl2、雙蒸水。

所述試劑盒檢測肉雞沙門氏菌環(huán)丙沙星耐藥基因的步驟包括：

(1)取樣：選取純化后的肉雞沙門氏菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個菌落，向無菌ep管中加入10μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；

(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；

(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋200倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；

(4)取第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，稀釋100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；

(5)收集第三輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。

所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。

所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃，5min。

所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環(huán)；72℃，4min。

實施例2

一種用于檢測肉雞沙門氏菌環(huán)丙沙星耐藥基因的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。

所述分子標記p1、p2和p3的上游引物5，端進行氨基化修飾并附加10個堿基t。

所述分子標記在制備檢測肉雞沙門氏菌環(huán)丙沙星耐藥基因試劑盒中的應用。

所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應緩沖液、mgcl2、雙蒸水。

所述試劑盒檢測肉雞沙門氏菌環(huán)丙沙星耐藥基因的步驟包括：

(1)取樣：選取純化后的肉雞沙門氏菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個菌落，向無菌ep管中加入40μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；

(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；

(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋400倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；

(4)取第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，稀釋60倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；

(5)收集第三輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。

所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。

所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃，5min。

所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環(huán)；72℃，4min。

實施例3

一種用于檢測肉雞沙門氏菌環(huán)丙沙星耐藥基因的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。

所述分子標記p1、p2和p3的上游引物5，端進行氨基化修飾并附加10個堿基t。

所述分子標記在制備檢測肉雞沙門氏菌環(huán)丙沙星耐藥基因試劑盒中的應用。

所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應緩沖液、mgcl2、雙蒸水。

所述試劑盒檢測肉雞沙門氏菌環(huán)丙沙星耐藥基因的步驟包括：

(1)取樣：選取純化后的肉雞沙門氏菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個菌落，向無菌ep管中加入60μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；

(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；

(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋500倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；

(4)取第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，稀釋10倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；

(5)收集第三輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。

所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。

所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃，5min。

所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環(huán)；72℃，4min。

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