本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及生菜作為宿主在表達(dá)生長因子中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

成纖維細(xì)胞生長因子(fgfs)包含參與生長和分化的大家族基因。在無脊椎動物和脊椎動物中發(fā)現(xiàn)均發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生長因子。已經(jīng)證明fgf在各種組織和器官的發(fā)育，代謝和修復(fù)中起著重要的作用。人成纖維細(xì)胞生長因子最初被鑒定為能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖的蛋白質(zhì)，現(xiàn)在已知包含22個成員。由于其潛在的生物學(xué)功能，fgf已被用于再生受損組織，包括皮膚，血管，肌肉，脂肪，腱/韌帶，軟骨，骨骼，牙齒和神經(jīng)。然后，組織再生的fgf的前景來源與重組人fgf家族一起使用。事實上，許多以前的研究將fgfs直接施用于傷口部位，以促進(jìn)傷口愈合。

成纖維細(xì)胞生長因子大家族中研究最廣泛的兩個成員是酸性成纖維細(xì)胞生長因子(fgf-1)以及堿性成纖維細(xì)胞生長因子(fgf-2)。fgf-1也稱為內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，是有絲分裂肽的fgf家族的成員，其目前由至少七種顯示35-55％氨基酸序列保守性的蛋白質(zhì)組成。與其他家族成員不同，fgf-1和fgf-2缺乏信號肽，并且通過除經(jīng)典蛋白質(zhì)分泌途徑以外的機(jī)制顯而易見地分泌。在大腦中大量檢測到fgf-1。已知表達(dá)fgf-1的其他細(xì)胞包括肝細(xì)胞，血管平滑肌細(xì)胞，cns神經(jīng)元，骨骼肌細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，腸柱狀上皮細(xì)胞和垂體嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。與其他fgf一樣，fgf-1顯示出相當(dāng)大的物種交叉反應(yīng)性。fgf-2可以由內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌。它的作用是促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的游走和平滑肌細(xì)胞的增殖，不能使平滑肌細(xì)胞游走。能夠促進(jìn)新血管形成，修復(fù)損害的內(nèi)皮細(xì)胞。fgf1和fgf-2刺激中胚層起源的所有細(xì)胞的增殖，以及許多神經(jīng)外胚層，外胚層和內(nèi)胚層起源的細(xì)胞。

成纖維細(xì)胞生長因子功能強(qiáng)大，具有深層修復(fù)作用，再現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)及外科手術(shù)和美容手術(shù)中發(fā)揮著不可估量的巨大作用，而且可以快速修復(fù)燒傷、刮傷、燙傷、摔傷等新鮮創(chuàng)面；但是成纖維細(xì)胞生長因子在體內(nèi)的半衰期短(2min)，而且容易被蛋白酶降解。fgf的有限來源使得難以滿足體內(nèi)和體外應(yīng)用所需的大量需求。因此，對于如何降低實驗和臨床應(yīng)用的重組fgf的成本和高表達(dá)fgf的生產(chǎn)需求越來越大。在過去幾十年中，包括重組腺相關(guān)病毒(raav)，大腸桿菌，巴斯德畢赤酵母昆蟲細(xì)胞，哺乳動物細(xì)胞，桿狀病毒和轉(zhuǎn)基因植物在內(nèi)的幾種表達(dá)系統(tǒng)試圖產(chǎn)生重組fgf。然而，不溶性，產(chǎn)量低，復(fù)雜加工和低生物活性在滿足市場需求時尤其受到越來越多的細(xì)胞治療和翻譯醫(yī)學(xué)應(yīng)用的限制，嚴(yán)重限制了其應(yīng)用。

植物作為藥物蛋白質(zhì)的表達(dá)和生產(chǎn)系統(tǒng)，已經(jīng)研究了近三十年。除了低成本和產(chǎn)量高等的優(yōu)點外，基于植物的表達(dá)系統(tǒng)還降低了人和動物病原體從產(chǎn)生蛋白質(zhì)的過程中傳播到人類的風(fēng)險。此外，植物真核蛋白內(nèi)膜表達(dá)系統(tǒng)和分泌途徑類似于哺乳動物細(xì)胞。植物表達(dá)系統(tǒng)可大量生產(chǎn)大分子量以及多亞基的藥物蛋白質(zhì)，且大大優(yōu)于原核生物表達(dá)系統(tǒng)，比如大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。如需要翻譯后修飾的，糖基化的蛋白，以及需要組裝的單克隆抗體，其不能用原核系統(tǒng)實現(xiàn)。利用植物生產(chǎn)的藥用蛋白作為生物試劑已經(jīng)商業(yè)化，或用作家禽的疫苗添加劑。2012年，美國食品和藥物管理局(fda)批準(zhǔn)了用于治療遺傳疾病1型戈謝病的蛋白elelyso^tm(taliglucerasealfa)，而這種蛋白是利用胡蘿卜生產(chǎn)的。在過去十年中，人們對藥物蛋白質(zhì)的需求急劇增加，所以fda批準(zhǔn)用于臨床試驗的植物藥用蛋白質(zhì)的數(shù)量也在不斷增加。

植物瞬時表達(dá)系統(tǒng)可以大量生產(chǎn)重組蛋白用于臨床研究或者應(yīng)對突發(fā)性疾病。2014年，唯一用于有效抵抗埃博拉病毒爆發(fā)的抗體治療藥物，zmapptm，就是農(nóng)桿菌滲透方法在煙草葉片中生產(chǎn)。zmapp的功效和安全性為推動植物制藥業(yè)的行業(yè)開辟了道路。目前，煙草瞬間蛋白表達(dá)最常見的宿主植物，并且已經(jīng)開發(fā)了各種載體和農(nóng)桿菌滲透方法，用于在短時間內(nèi)進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。然而，煙草具有高纖維含量和潛在的有毒化合物，如生物堿尼古丁，顯著增加了下游純化過程中的成本，極大地阻礙了植物外源蛋白藥物的進(jìn)一步發(fā)展。與煙葉系統(tǒng)相比，生菜中含有更少的酚類和有毒化合物，因此，將生菜作為宿主在表達(dá)生長因子具有重要的現(xiàn)實意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供生菜作為宿主在表達(dá)生長因子中的應(yīng)用。本發(fā)明利用生菜作為重組蛋白生產(chǎn)的有效平臺，消除了植物生長周期，大大節(jié)省了前期培育植物的時間。本發(fā)明用生菜系統(tǒng)表達(dá)了fgf-1以及fgf-2，并且在溫和的條件下成功分離出有活性的外源蛋白，證明生菜表達(dá)平臺可以用來生產(chǎn)fgf成纖維細(xì)胞生長因子。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了生菜作為宿主在表達(dá)生長因子中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述生長因子選自fgf-1或fgf-2。

本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，包括生長因子的核苷酸序列和雙元植物載體。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述表達(dá)載體中所述生長因子包括fgf-1或fgf-2。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述表達(dá)載體的構(gòu)建方法包括如下步驟：

步驟1：在生長因子的核苷酸序列的5’末端分別加入xbal限制性酶切位點和kpnl限制性酶切位點，在3’末端分別加入sacl限制性酶切位點和pacl限制性酶切位點；所述生長因子包括fgf-1或fgf-2；

步驟2：由thermofisher克隆，分別獲得17abrz5p_fgf1_pma-t克隆載體或17abrz4p_fgf2_pma-t克隆載體；

步驟3：通過kpnl/sacl分別從步驟2所得的克隆載體中獲得基因片段fgf-1或fgf-2，克隆至雙元植物載體pcam35s，分別獲得表達(dá)載體-fgf1或-fgf2。

具體的，本發(fā)明提供的表達(dá)載體的構(gòu)建方法為：將人fgf-1(genbankaccession號：nm_001257210.1)以及fgf-2(genbankaccession號：m27968.1)密碼子優(yōu)化為植物偏好的密碼子，由geneart^tmgeneoptimizer^tm(thermofisher)設(shè)計并合成。在優(yōu)化的fgf-1以及fgf-2序列5’末端加入xbal以及kpnl限制性酶切位點，在3’末端加入sacl和pacl位點，并由thermofisher克隆到17abrz5p_fgf1_pma-t以及17abrz4p_fgf2_pma-t載體中。生長因子基因片段fgf-1以及fgf-2通過kpnl/sacl從17abrz5p_fgf1_pma-t以及17abrz4p_fgf2_pma-t中分離，并克隆到雙元植物載體pcam35s，分別產(chǎn)生瞬時表達(dá)載體p35s-fgf1以及p35s-fgf2。將兩種植物表達(dá)構(gòu)建體分別通過用multiporator(eppendorf，hamburg，germany)電穿孔轉(zhuǎn)化到根癌土壤桿菌gv3101中。將所得菌株均勻地鋪展在含有卡那霉素抗生素(50mg/l)的選擇性lb平板上。在黑暗中28℃孵育2d后，挑取單菌落接種到0.5lyeb(酵母提取物肉湯，5g/l蔗糖，5g/l胰蛋白胨，6g/l酵母提取物，0.24g/lmgso4，ph7.2)并補(bǔ)充抗生素液體培養(yǎng)基(50mg/l卡那霉素)。將接種的培養(yǎng)物在振蕩器(220rpm)中以25～28℃孵育72h。通過添加yeb培養(yǎng)基測量od600值并調(diào)節(jié)至3.5～4.5。然后收集培養(yǎng)液，離心(4500轉(zhuǎn)速)10min。將農(nóng)桿菌細(xì)胞重懸在滲透培養(yǎng)基(10mmmes，10mmmgso4)中至o.d.600為0.5。所述克隆fgf-1以及fgf-2基因片段(圖1a，b)，并且構(gòu)建兩種基于雙元植物表達(dá)載體p35s-fgf1和p35s-fgf2(圖2)。在完成構(gòu)建體后，用特異性限制酶消化證實基因片段是完整的。

在本發(fā)明中，fgf-1cdna序列(genbank:nm_001257210.1)如seqidno.1所示；fgf-1氨基酸序列如seqidno.2所示；fgf-2cdna序列(genbank:m27968.1)如seqidno.3所示；fgf-2氨基酸序列如seqidno.4所示；密碼子優(yōu)化后的fgf-1cdna序列如seqidno.5所示；密碼子優(yōu)化后的fgf-2cdna序列如seqidno.6所示。

本發(fā)明還提供了所述表達(dá)載體在表達(dá)生長因子中的應(yīng)用。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述生長因子包括fgf-1或fgf-2。

本發(fā)明還提供了一種生菜作為宿主表達(dá)生長因子的方法，將所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)真空滲透入生菜組織后，提取、分離蛋白質(zhì)，獲得生長因子。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述方法中所述生長因子包括fgf-1或fgf-2。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述農(nóng)桿菌介導(dǎo)真空滲透包括如下步驟：

步驟1：抽真空25～45s；

步驟2：保持真空(-95kpa)壓力30～60s；

步驟3：釋放壓力使得滲透液滲入所述植物組織；

重復(fù)上述步驟2～3次，避光處理4d。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述農(nóng)桿菌為根癌土壤桿菌gv3101。

具體的，農(nóng)桿菌介導(dǎo)真空滲透的方法為：將制備好的農(nóng)桿菌培養(yǎng)懸浮液置于2l燒杯，并置于干燥器中。將本實驗室保存的生菜倒置(核心向上)并輕輕地旋轉(zhuǎn)于細(xì)菌懸浮液中，將干燥器密封。將真空泵(welchvacuum，niles，il，usa)打開以抽空，并且可見滲透液在葉片組織中。保持壓力狀態(tài)30～60s?？焖俅蜷_該系統(tǒng)以釋放壓力，使?jié)B透液滲入組織內(nèi)的空間。該過程重復(fù)2～3次，直到清晰可見滲透液在生菜組織中擴(kuò)散明顯。然后將生菜組織從滲透液中輕輕取出，并用蒸餾水連續(xù)沖洗三次，然后轉(zhuǎn)移到塑料膜覆蓋的容器中。將處理的樣品在黑暗中保持4d。

滲透后，絕大多數(shù)生菜組織在真空浸潤過程中淹沒，除了堅固的中肋區(qū)域外，其余部分均在真空滲透4天后顯示淡黃褐色區(qū)域。為了增加浸入葉組織的土壤農(nóng)桿菌的數(shù)量，使用剪刀將10％的生菜從頭切掉使得生菜葉組織盡可能的浸潤在滲透液中，和釋放。與更長的真空暴露時間相比，該方法減少了葉片組織壞死。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，提取、分離蛋白質(zhì)具體為：

經(jīng)農(nóng)桿菌真空滲透的生菜樣品用攪拌器攪拌，并用體積比為1:1比例的提取緩沖液(100mmkpi，ph7.8；5mmedta；10m-巰基乙醇)攪拌機(jī)中高速勻漿1～2min。將勻漿物調(diào)節(jié)至ph為8.0，用紗布過濾，過濾物在4℃以10,000g離心15min以除去細(xì)胞碎片。收集上清液，與硫酸銨(50％)混合，并在冰上搖動孵育60min。通過離心機(jī)(10,000g)在4℃下再次分離15min。將得到的上清液進(jìn)行第二輪硫酸銨(70％)沉淀，冰上搖動懸浮60min，再次在4℃下以10,000g離心15min。然后，棄去上清液，將處理樣品沉淀蛋白質(zhì)溶于5ml緩沖液(20mmkpi，ph7.8；2mmedta；10m-巰基乙醇)中并在4℃下儲存。

收集從農(nóng)桿菌真空滲透生菜提取的純化蛋白質(zhì)，取樣品(5ìl)熱變性(95℃)加載緩沖液(biorad，hercules，ca，usa)在4～12％bis-trisplussds-凝膠(thermofisherscientific，waltham，ma，usa)跑電泳，然后用考馬斯藍(lán)g250(biorad)染色后再次對凝膠進(jìn)行拍照。對于重組fgf-1以及fgf-2的westernblot蛋白印跡雜交，10ìl的重組樣品以及hfgf-1和hfgf-2標(biāo)準(zhǔn)品(biovision)分別在10～20％bis-trisplus聚丙烯酰胺凝膠上分離，并將其電泳轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上，用抗hfgf-1以及hfgf-2的抗體(abcam)分別進(jìn)行免疫反應(yīng)，稀釋1：10000和辣根過氧化物酶(hrp)標(biāo)記的山羊抗兔igg(beyotime)，稀釋度分別為1:20000，并使用eclplus(amershambiosciences)顯現(xiàn)，對顯示圖像進(jìn)行拍照。

植物來源的重組蛋白質(zhì)的下游加工通常難于并且昂貴，因為纖維素細(xì)胞壁難以裂解以及次級植物代謝產(chǎn)物。本發(fā)明用攪拌機(jī)攪拌勻漿，大大節(jié)省勻漿成本以及工藝。重組fgf-1以及fgf-2經(jīng)過sds-page分離我們在泳道中觀察到估計分子量大約為17kda的條帶(圖3a)，在隱形對照泳道中沒有明顯的對應(yīng)條帶?；赽radford測定法和光密度測定對照組測定純化樣品的蛋白含量為0.58mg/g。另外，western印跡分析也檢測到大約17kda的條帶(圖3b)，觀察到的蛋白分子量(17kda)與陽性對照組一致。

來自小鼠胚胎成纖維細(xì)胞nih/3t3細(xì)胞系在含有10％(v/v)胎牛血清(fbs，gibco)的dulbecco改良的eagle培養(yǎng)基(dmem，gibco)中于37℃，在5％co2中培養(yǎng)。將nih/3t3細(xì)胞在24孔板中生長至100％匯合。血清饑餓細(xì)胞16h，用無菌移液針頭刮傷nih/3t3表面，用pbs洗滌去除細(xì)胞碎片。然后用100ng/ml的劑量用純化的fgf-1和fgf-2以及標(biāo)準(zhǔn)品刺激細(xì)胞48h。使用顯微鏡(尼康)對初始傷口和細(xì)胞在劃傷區(qū)域。

通過細(xì)胞實驗研究純化的hafgf的生物活性。首先，使用純化的重組fgf-1以及fgf-2培養(yǎng)nih/3t3細(xì)胞，使用相同的商業(yè)用fgf-1以及fgf-2標(biāo)準(zhǔn)作為陽性對照。nih/3t3的細(xì)胞增殖可以通過劑量通過使用100ng/ml劑量的純化重組fgf-1以及fgf-2時發(fā)現(xiàn)，在48h的時間點檢查細(xì)胞生長結(jié)果表明，沒有任何處理的nih/3t3細(xì)胞生長較差。相比之下，使用純化的重組fgf-1以及fgf-2hafgf或相等的陽性對照fgf-1以及fgf-2標(biāo)準(zhǔn)處理的nih/3t3細(xì)胞生長良好；它們在劃傷表面拉伸蔓延(圖4)。這些結(jié)果表明，通過生菜系統(tǒng)瞬間表達(dá)的外源fgf-1以及fgf-2具有生物學(xué)活性，生菜系統(tǒng)可能是生物活性重組藥物蛋白質(zhì)批量生產(chǎn)的合適的生物反應(yīng)器。

用于真空農(nóng)桿菌滲透的煙草植物的生長時間通常為4至6周。本發(fā)明利用生菜作為重組蛋白生產(chǎn)的有效平臺，消除了植物生長周期，大大節(jié)省了前期培育植物的時間。本發(fā)明用生菜系統(tǒng)表達(dá)了fgf-1以及fgf-2，并且在溫和的條件下成功分離出有活性的外源蛋白，證明生菜表達(dá)平臺可以用來生產(chǎn)fgf成纖維細(xì)胞生長因子。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1(a)示fgf-1以及fgf-2克隆載體(thermofisher構(gòu)建合成)；

圖1(b)示fgf-1以及fgf-2基因片段酶切(kpni/saci)鑒定；

圖2示植物瞬時表達(dá)載體p35s-fgf1以及p35s-fgf2構(gòu)建流程；利用限制性內(nèi)切酶(kpni/saci)雙酶切，從圖1克隆載體分別切下fgf-1以及fgf-2片段，連接入pcam35s的kpni/saci位點，生成植物瞬時表達(dá)載體p35s-fgf1以及p35s-fgf2；

其中，35s，具有煙草花葉病毒(tmv)5‘utr的camv35s啟動子；nptii，用于卡那霉素抗性的編碼nptii基因的表達(dá)；nos3’，終止子；

圖3(a)示利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)檢測純化的重組成纖維細(xì)胞生長因子；泳道1:純化重組fgf-1(5μg)；泳道2：純化重組fgf-2(5μg)；泳道3：陽性對照fgf-1(5μg)；泳道4：陽性對照fgf-2(5μg)；泳道5：非真空滲透葉片洗脫液陰性對照；

圖3(b)示western印記雜交檢測純化的重組成纖維細(xì)胞生長因子；泳道1:純化重組fgf-1(5μg)；泳道2：純化重組fgf-2(5μg)；3：陽性對照fgf-1(5μg)；泳道4：陽性對照fgf-2(5μg)；泳道5：非真空滲透葉片洗脫液陰性對照；

圖4示細(xì)胞增值實驗；使用純化的fgf-1和fgf-2處理劃痕nih/3t3細(xì)胞，進(jìn)行愈合測定；48小時后，重組成纖維細(xì)胞生長因子明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖活性。

具體實施方式

本發(fā)明公開了生菜作為宿主在表達(dá)生長因子中的應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明研究表明，生菜系統(tǒng)可以是有效的表達(dá)平臺，為快速，瞬時表達(dá)重組蛋白質(zhì)提供了方法。真空農(nóng)桿菌滲透方法簡單，快速，減少葉片壞死，而且可以提高重組蛋白產(chǎn)量。生菜可以通過承受真空壓力而增加蛋白質(zhì)產(chǎn)量，并允許每片葉子更完整的滲透。由于生菜易于生長并且可商業(yè)上大量生產(chǎn)，因此比其他瞬時表達(dá)植物，如煙草等更容易獲得并且更便宜。并且由于不需要特殊設(shè)備或液氮，成本效益更高。本發(fā)明證明該方法可以用于短時間內(nèi)大規(guī)模生產(chǎn)fgf-1以及fgf-2重組蛋白質(zhì)。

本發(fā)明提供了生菜作為宿主在表達(dá)生長因子中的應(yīng)用中所用原料及試劑均可由市場購得。

下面結(jié)合實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：

實施例1植物瞬時表達(dá)載體的構(gòu)建

為了提供外援蛋白在植物中的高效表達(dá)，本發(fā)明將人fgf-1(genbankaccession號：nm_001257210.1)以及fgf-2(genbankaccession號：m27968.1)密碼子優(yōu)化為植物偏好的密碼子，由geneart^tmgeneoptimizer^tm(thermofisher)設(shè)計并合成。在優(yōu)化的fgf-1以及fgf-2序列5’末端加入xbal以及kpnl限制性酶切位點，在3’末端加入sacl和pacl位點，并由thermofisher克隆到17abrz5p_fgf1_pma-t以及17abrz4p_fgf2_pma-t載體中。生長因子基因片段fgf-1以及fgf-2通過kpnl/sacl從17abrz5p_fgf1_pma-t以及17abrz4p_fgf2_pma-t中分離，并克隆到雙元植物載體pcam35s，分別產(chǎn)生瞬時表達(dá)載體p35s-fgf1以及p35s-fgf2。將兩種植物表達(dá)構(gòu)建體分別通過用multiporator(eppendorf，hamburg，germany)電穿孔轉(zhuǎn)化到根癌土壤桿菌gv3101中。將所得菌株均勻地鋪展在含有卡那霉素抗生素(50mg/l)的選擇性lb平板上。在黑暗中28℃孵育2d后，挑取單菌落接種到0.5lyeb(酵母提取物肉湯，5g/l蔗糖，5g/l胰蛋白胨，6g/l酵母提取物，0.24g/lmgso4，ph7.2)并補(bǔ)充抗生素液體培養(yǎng)基(50mg/l卡那霉素)。將接種的培養(yǎng)物在振蕩器(220rpm)中以25～28℃孵育72h。通過添加yeb培養(yǎng)基測量od600值并調(diào)節(jié)至3.5～4.5。然后收集培養(yǎng)液，離心(4500轉(zhuǎn)速)10min。將農(nóng)桿菌細(xì)胞重懸在滲透培養(yǎng)基(10mmmes，10mmmgso4)中至o.d.600為0.5。

所述克隆fgf-1以及fgf-2基因片段(圖1a，b)，并且構(gòu)建兩種基于雙因素病毒的植物表達(dá)載體p35s-fgf1和p35s-fgf2(圖2)。在完成構(gòu)建體后，用特異性限制酶消化證實基因片段是完整的。

實施例2農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真空滲透

本發(fā)明優(yōu)化了農(nóng)桿菌真空滲透的方法(圖2)。將制備好的農(nóng)桿菌培養(yǎng)懸浮液置于2l燒杯，并置于干燥器中。將本實驗室保存的生菜倒置(核心向上)并輕輕地旋轉(zhuǎn)于細(xì)菌懸浮液中，將干燥器密封。將真空泵(welchvacuum，niles，il，usa)打開以抽空，并且可見滲透液在葉片組織中。保持壓力狀態(tài)30～60s?？焖俅蜷_該系統(tǒng)以釋放壓力，使?jié)B透液滲入組織內(nèi)的空間。該過程重復(fù)2～3次，直到清晰可見滲透液在生菜組織中擴(kuò)散明顯。然后將生菜組織從滲透液中輕輕取出，并用蒸餾水連續(xù)沖洗三次，然后轉(zhuǎn)移到塑料膜覆蓋的容器中。將處理的樣品在黑暗中保持4d。

滲透后，絕大多數(shù)生菜組織在真空浸潤過程中淹沒，除了堅固的中肋區(qū)域外，其余部分均在真空滲透4天后顯示淡黃褐色區(qū)域。為了增加浸入葉組織的土壤農(nóng)桿菌的數(shù)量，使用剪刀將10％的生菜從頭切掉使得生菜葉組織盡可能的浸潤在滲透液中，和釋放。與更長的真空暴露時間相比，該方法減少了葉片組織壞死。

實施例3蛋白質(zhì)提取和分離

經(jīng)農(nóng)桿菌真空滲透的生菜樣品用攪拌器攪拌，并用體積比為1:1比例的提取緩沖液(100mmkpi，ph7.8；5mmedta；10m-巰基乙醇)攪拌機(jī)中高速勻漿1～2min。將勻漿物調(diào)節(jié)至ph為8.0，用紗布過濾，過濾物在4℃以10,000g離心15min以除去細(xì)胞碎片。收集上清液，與硫酸銨(50％)混合，并在冰上搖動孵育60分鐘。通過離心機(jī)(10,000g)在4℃下再次分離15min。將得到的上清液進(jìn)行第二輪硫酸銨(70％)沉淀，冰上搖動懸浮60min，再次在4℃下以10,000g離心15min。然后，棄去上清液，將處理樣品沉淀蛋白質(zhì)溶于5ml緩沖液(20mmkpi，ph7.8；2mmedta；-巰基乙醇)中并在4℃下儲存。

實施例4sds-page凝膠電泳以及westernblot蛋白印跡雜交

收集從農(nóng)桿菌真空滲透生菜提取的純化蛋白質(zhì)，取樣品(5ìl)熱變性(95℃)加載緩沖液(biorad，hercules，ca，usa)在4～12％bis-trisplussds-凝膠(thermofisherscientific，waltham，ma，usa)跑電泳，然后用考馬斯藍(lán)g250(biorad)染色后再次對凝膠進(jìn)行拍照。對于重組fgf-1以及fgf-2的westernblot蛋白印跡雜交，10ìl的重組樣品以及hfgf-1和hfgf-2標(biāo)準(zhǔn)品(biovision)分別在10～20％bis-trisplus聚丙烯酰胺凝膠上分離，并將其電泳轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上，用抗hfgf-1以及hfgf-2的抗體(abcam)分別進(jìn)行免疫反應(yīng)，稀釋1：10000和辣根過氧化物酶(hrp)標(biāo)記的山羊抗兔igg(beyotime)，稀釋度分別為1:20000，并使用eclplus(amershambiosciences)顯現(xiàn)，對顯示圖像進(jìn)行拍照。

植物來源的重組蛋白質(zhì)的下游加工通常難于并且昂貴，因為纖維素細(xì)胞壁難以裂解以及次級植物代謝產(chǎn)物。我們用攪拌機(jī)攪拌勻漿，大大節(jié)省勻漿成本以及工藝。重組fgf-1以及fgf-2經(jīng)過sds-page分離我們在泳道中觀察到估計分子量大約為17kda的條帶(圖3a)，在隱形對照泳道中沒有明顯的對應(yīng)條帶?；赽radford測定法和光密度測定對照組測定純化樣品的蛋白含量為0.58mg/g。另外，western印跡分析也檢測到大約17kda的條帶(圖3b)，觀察到的蛋白分子量(17kda)與陽性對照組一致。

實施例5細(xì)胞增值實驗

來自小鼠胚胎成纖維細(xì)胞nih/3t3細(xì)胞系在含有10％(v/v)胎牛血清(fbs，gibco)的dulbecco改良的eagle培養(yǎng)基(dmem，gibco)中于37℃，在5％co2中培養(yǎng)。將nih/3t3細(xì)胞在24孔板中生長至100％匯合。血清饑餓細(xì)胞16h，用無菌移液針頭刮傷nih/3t3表面，用pbs洗滌去除細(xì)胞碎片。然后用100ng/ml的劑量用純化的fgf-1和fgf-2以及標(biāo)準(zhǔn)品刺激細(xì)胞48h。使用顯微鏡(尼康)對初始傷口和細(xì)胞在劃傷區(qū)域。

通過細(xì)胞實驗研究純化的hafgf的生物活性。首先，使用純化的重組fgf-1以及fgf-2培養(yǎng)nih/3t3細(xì)胞，使用相同的商業(yè)用fgf-1以及fgf-2標(biāo)準(zhǔn)作為陽性對照。nih/3t3的細(xì)胞增殖可以通過劑量通過使用100ng/ml劑量的純化重組fgf-1以及fgf-2時發(fā)現(xiàn)，在48h的時間點檢查細(xì)胞生長結(jié)果表明，沒有任何處理的nih/3t3細(xì)胞生長較差。相比之下，使用純化的重組fgf-1以及fgf-2hafgf或相等的陽性對照fgf-1以及fgf-2標(biāo)準(zhǔn)處理的nih/3t3細(xì)胞生長良好；它們在劃傷表面拉伸蔓延(圖4)。這些結(jié)果表明，通過生菜系統(tǒng)瞬間表達(dá)的外源fgf-1以及fgf-2具有生物學(xué)活性，生菜系統(tǒng)可能是生物活性重組藥物蛋白質(zhì)批量生產(chǎn)的合適的生物反應(yīng)器。

實施例6

對照組：利用煙葉生產(chǎn)pd-1和pd-l1抗體；

實驗組：本發(fā)明提供的生菜生產(chǎn)pd-1和pd-l1抗體；

表1人酸性以及堿性成纖維細(xì)胞生長因子

^*示與對照組相比p≤0.05；^#示與對照組相比p≤0.01；

由表1可知，與對照組的煙葉系統(tǒng)相比，生菜瞬時表達(dá)人酸性成纖維細(xì)胞生長因子(fgf-1)以及堿性成纖維細(xì)胞生長因子(fgf-2)，顯著(p≤0.05)縮短了生產(chǎn)周期，顯著(p≤0.05)提高了蛋白含量，顯著(p≤0.05)提高了蛋白活性，簡化了蛋白純化的難易程度，極顯著(p≤0.01)降低了生產(chǎn)成本。

綜合上述試驗結(jié)果表明，植物系統(tǒng)尤其是生菜系統(tǒng)是更加經(jīng)濟(jì)、高效的表達(dá)平臺。能夠快速瞬時表達(dá)重組蛋白質(zhì)，可以在短時間內(nèi)大規(guī)模生產(chǎn)人酸性以及堿性成纖維細(xì)胞生長因子。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

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<110>深圳惠升生物科技有限公司

<120>生菜作為宿主在表達(dá)生長因子中的應(yīng)用

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