本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及植物作為宿主在表達(dá)溶血蛋白中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

t-pa(組織型纖溶酶原激活劑)，tnkase(替奈譜酶)，r-pa(瑞替譜酶)是fda批準(zhǔn)治療心血管疾病，急性大體積肺栓塞以及心肌梗死的最佳藥物。其中，t-pa是治療急性中風(fēng)的唯一有效藥物。tnkase是t-pa的多點(diǎn)變異體，主要是治療急性心肌梗塞。r-pa是t-pa的缺失突變體，這些突變導(dǎo)致半衰期延長(zhǎng)，從而使瑞替普酶可用靜脈注射法給藥，適用于急性心肌梗急性心肌梗死、肺栓塞、缺血性腦卒中等。商業(yè)化t-pa以及tnkase主要是利用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(cho)生產(chǎn)，r-pa是利用重組大腸桿菌生產(chǎn)。

現(xiàn)階段有利用動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)t-pa(組織型纖溶酶原激活劑)，tnkase(替奈譜酶)的報(bào)道。但是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)需要價(jià)格昂貴的培養(yǎng)液，嚴(yán)格的廠房條件，操作復(fù)雜，時(shí)間周期至少兩周，而且動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)能力低，造成成本極高。有時(shí)候動(dòng)物細(xì)胞所帶的病毒可以侵染人類，造成安全性低。

現(xiàn)階段有利用大腸桿菌生產(chǎn)r-pa(瑞替譜酶)的專利。但是大腸桿菌是低等生物，不能進(jìn)行表達(dá)后的蛋白修飾過(guò)程。而且表達(dá)產(chǎn)品大多為包涵體形式，沒(méi)有生物活性。蛋白復(fù)性過(guò)程操作復(fù)雜，使得最終純化產(chǎn)品生產(chǎn)能力低，造成成本極高。

以細(xì)菌作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白具有快速以及高產(chǎn)的特點(diǎn)，但由于細(xì)菌屬于原核生物，不具備真核生物的蛋白質(zhì)合成與加工系統(tǒng)，而一些蛋白質(zhì)的生物活性是依靠蛋白質(zhì)的修飾來(lái)達(dá)到的，所以，它的應(yīng)用受到了限制。而且好多在細(xì)菌中表達(dá)的蛋白是以包涵體形式存在，變性復(fù)性過(guò)程都極大的增加了成本。利用動(dòng)物細(xì)胞，如cho，表達(dá)人體醫(yī)用蛋白活性比較高，但是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的成本極高，大規(guī)模生產(chǎn)需要巨大的投資，對(duì)廠房的要求極高，而且動(dòng)物細(xì)胞如果污染病毒，可以侵染人類，造成安全隱患。由于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)不易，造成其生產(chǎn)的重組蛋白價(jià)格昂貴，在醫(yī)藥上的應(yīng)用也受到限制。因而急需一個(gè)高效、安全的表達(dá)系統(tǒng)來(lái)滿足巨大的市場(chǎng)需求。

利用植物系統(tǒng)，比如煙草，生產(chǎn)重組蛋白具有表達(dá)水平高，生產(chǎn)的重蛋白具有活性，生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢(shì)，但是煙草含有尼古丁，煙堿，各種有毒酚類物質(zhì)，造成下游純化工藝?yán)щy，不易純化，成本高本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供植物作為宿主在表達(dá)溶血蛋白中的應(yīng)用。本發(fā)明采用水稻儲(chǔ)藏醇溶谷蛋白gt13a為胚乳特異性表達(dá)的啟動(dòng)子和信號(hào)肽，采用農(nóng)桿菌作為轉(zhuǎn)基因載體，采用粳稻品種臺(tái)北309種子成熟的胚乳為遺傳轉(zhuǎn)化的受體，采用雙農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將t-pa、tnkase或r-pa分別導(dǎo)入水稻種子中，獲得的轉(zhuǎn)基因水稻種子重組蛋白具有溶栓活性。本發(fā)明所得的重組人溶血蛋白具有表達(dá)體系穩(wěn)定、表達(dá)效率高、成本低，規(guī)?；a(chǎn)容易、生物活性高、無(wú)病原菌污染等優(yōu)點(diǎn)?？梢源笠?guī)模生產(chǎn)來(lái)滿足市場(chǎng)需求。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了植物作為宿主在表達(dá)溶血蛋白中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述溶血蛋白選自t-pa、tnkase或r-pa。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述植物選自水稻、小麥、大豆、玉米、煙草或高粱。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了水稻種子作為宿主在表達(dá)t-pa(組織型纖溶酶原激活劑)中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了植物種子尤其是水稻種子作為宿主在表達(dá)tnkase(替奈譜酶)或r-pa(瑞替譜酶)中的應(yīng)用。

種子表達(dá)體系是目前規(guī)模化生產(chǎn)較為成熟的表達(dá)體系之一。種子能夠提供一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，使重組蛋白表達(dá)積累到一個(gè)較高水平；同時(shí)，種子是最佳的“天然容器”，重組蛋白在常溫下儲(chǔ)藏2～3年而不喪失生物活性，并且由于重組蛋白貯藏在一個(gè)很小的空間，產(chǎn)品運(yùn)輸十分便利。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述植物的器官為種子、葉片或根莖。

較好的種子表達(dá)體系是利用水稻進(jìn)行表達(dá)和生產(chǎn)。水稻是我國(guó)乃至亞洲的主要糧食作物，亞洲種植面積占全球的92％；在我國(guó)具有5000多年的栽培歷史，我國(guó)種植面積為4.4億畝，產(chǎn)量占世界水稻產(chǎn)量的31％，水稻學(xué)名為oryzasatival.sp，俗名為水稻，水稻屬于禾本科、稻屬，兩個(gè)為栽培種即亞洲栽培稻oryza.sativa和非洲栽培oryza.glaberrima，普通栽培稻(oryzasativa)可以種植。在栽培稻種又分為秈稻和粳稻兩個(gè)亞種。臺(tái)北309是我國(guó)臺(tái)灣育成的品種。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中所述水稻的品種為粳稻品種臺(tái)北309。

本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，包括雙元植物載體以及上述應(yīng)用中的溶血蛋白的核苷酸序列。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述載體包括包含目的基因的農(nóng)桿菌和包含標(biāo)記基因的農(nóng)桿菌。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述標(biāo)記基因?yàn)槌泵顾亓姿徂D(zhuǎn)移酶基因。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述載體為農(nóng)桿菌lba4404。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體的構(gòu)建方法包括如下步驟：

步驟1：分別將t-pa、tnkase或r-pa的密碼子優(yōu)化為水稻密碼子，獲得優(yōu)化后的序列，分別記為優(yōu)化后的t-pa核苷酸序列、優(yōu)化后的tnkase核苷酸序列或優(yōu)化后的r-pa核苷酸序列；

所述優(yōu)化后的t-pa核苷酸序列如seqidno.2所示；

所述優(yōu)化后的tnkase核苷酸序列如seqidno.4所示；

所述優(yōu)化后的r-pa核苷酸序列如seqidno.6所示。

步驟2：在所述優(yōu)化后的t-pa核苷酸序列、優(yōu)化后的tnkase核苷酸序列或優(yōu)化后的r-pa核苷酸序列的5’末端分別加入mlyl限制性酶切位點(diǎn)，在3’末端分別加入xhol限制性酶切位點(diǎn)，克隆到puc57載體中，分別獲得克隆載體puc-tpa、puc-tnkase或puc-rpa；

步驟3：通過(guò)mlyl/xhol從分別所述puc-tpa，puc-tnkase或puc-rpa克隆載體中獲得基因片段tpa、tnkase或r-pa，并克隆至雙元植物載體pcam-gt13a中，獲得表達(dá)載體pcam-tpa、pcam-tnkase或pcam-rpa。

具體的，本發(fā)明提供的表達(dá)載體的構(gòu)建方法具體為：

基于drugbank(t-pa，accessionno：db00015；r-pa，accessionno：db00015以及tnkase，accessionno：d6070)全長(zhǎng)氨基酸序列，通過(guò)反翻譯軟件，并且將密碼子優(yōu)化為水稻密碼子(見(jiàn)氨基酸序列如seqidno.1、seqidno.3、seqidno.5所示以及優(yōu)化的dna序列如seqidno.2、seqidno.4、seqidno.6所示)。將限制性位點(diǎn)mlyl以及xhol位點(diǎn)分別添加到優(yōu)化序列片段的5'末端以及3'末端，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆到puc57載體中(圖1)，得到克隆載體puc-tpa，puc-tnkase以及puc-rpa。通過(guò)mlyl以及xhol從puc-tpa，puc-tnkase以及puc-rpa中分離出tpa，tnkase，以及r-pa基因片段，并克隆入植物雙元載體pcam-gt13a中，以生成植物表達(dá)載體pcam-tpa，pcam-tnkase以及pcam-rpa(圖2)。隨后將植物表達(dá)載體通過(guò)multiporator(eppendorf，hamburg，germany)電穿孔轉(zhuǎn)化到根癌土壤桿菌lba4404中，用于水稻種子成熟胚愈傷組織的基因轉(zhuǎn)化。

本發(fā)明還提供了所述的表達(dá)載體在表達(dá)溶血蛋白中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種植物作為宿主表達(dá)溶血蛋白的方法，以植物作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體，采用載體介導(dǎo)的遺傳共轉(zhuǎn)化方法，通過(guò)表達(dá)載體將溶血蛋白的基因?qū)胫参镏?，使基因重組后的植物表達(dá)蛋白，獲得重組溶血蛋白。

具體的，本發(fā)明提供的方法是以水稻的種子成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體，采用載體介導(dǎo)的遺傳共轉(zhuǎn)化方法，將t-pa、tnkase或r-pa基因?qū)胨局?，使基因重組后的水稻種子表達(dá)重組人溶血蛋白。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括雙元植物載體以及上述應(yīng)用中的溶血蛋白的核苷酸序列。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述載體包括包含目的基因的農(nóng)桿菌和包含標(biāo)記基因的農(nóng)桿菌。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述標(biāo)記基因?yàn)槌泵顾亓姿徂D(zhuǎn)移酶基因。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述載體為農(nóng)桿菌lba4404。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體的構(gòu)建方法包括如下步驟：

步驟1：分別將t-pa、tnkase或r-pa的密碼子優(yōu)化為水稻密碼子，獲得優(yōu)化后的序列，分別記為優(yōu)化后的t-pa核苷酸序列、優(yōu)化后的tnkase核苷酸序列或優(yōu)化后的r-pa核苷酸序列；所述優(yōu)化后的t-pa核苷酸序列如seqidno.2所示；所述優(yōu)化后的tnkase核苷酸序列如seqidno.4所示；所述優(yōu)化后的r-pa核苷酸序列如seqidno.6所示。步驟2：在所述優(yōu)化后的t-pa核苷酸序列、優(yōu)化后的tnkase核苷酸序列或優(yōu)化后的r-pa核苷酸序列的5’末端分別加入mlyl限制性酶切位點(diǎn)，在3’末端分別加入xhol限制性酶切位點(diǎn)，克隆到puc57載體中，分別獲得克隆載體puc-tpa、puc-tnkase或puc-rpa；步驟3：通過(guò)mlyl/xhol從分別所述puc-tpa，puc-tnkase或puc-rpa克隆載體中獲得基因片段tpa、tnkase或r-pa，并克隆至雙元植物載體pcam-gt13a中，獲得表達(dá)載體pcam-tpa、pcam-tnkase或pcam-rpa。作為優(yōu)選，所述溶血蛋白選自t-pa、tnkase或r-pa。作為優(yōu)選，所述植物選自水稻、小麥、大豆、玉米、煙草或高粱。作為優(yōu)選，所述植物的器官為種子、葉片或根莖。作為優(yōu)選，所述水稻的品種為粳稻品種臺(tái)北309。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述遺傳共轉(zhuǎn)化方法包括如下步驟：

步驟1：獲得所述植物誘導(dǎo)的愈傷組織20～30d；

步驟2：通過(guò)所述載體轉(zhuǎn)染所述表達(dá)載體，在含有50μg/ml的潮霉素b的選擇培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷組織45d；

步驟3：將所述愈傷組織分化成幼小植株，然后將所述幼小植株轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)15～20d。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述遺傳共轉(zhuǎn)化方法包括如下步驟：

步驟1：獲得種子成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織20～30d；

步驟2：取農(nóng)桿菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在含有50μg/ml的潮霉素b的選擇培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷組織45d；

步驟3：將所述愈傷組織分化成幼小植株，然后將所述幼小植株轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)15～20d。

將上述成型的完整的植株，轉(zhuǎn)到溫室生長(zhǎng)發(fā)育成熟的種子，此為含有溶血蛋白的t1種子。

具體的，遺傳共轉(zhuǎn)化方法為：

種子成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織：水稻品種臺(tái)北309種子，脫去谷殼后，經(jīng)20％次氯酸鈉消毒20min，經(jīng)無(wú)菌水漂洗3次，每次10min，然后放在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上經(jīng)20～30d的誘導(dǎo)，產(chǎn)生愈傷組織。將0.5μg的質(zhì)粒pospmp105和0.5μg具有選擇性標(biāo)記質(zhì)粒pospmp5的dna放入愈傷組織中，在室溫(20～25℃)下反應(yīng)30min，用酒精洗三次，然后采用農(nóng)桿菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)染，目的基因和選擇性標(biāo)記基因載體隨機(jī)整合到臺(tái)北309愈傷組織的細(xì)胞中。在含有50μg/ml的潮霉素b的選擇培養(yǎng)基上經(jīng)45d的篩選，繼續(xù)生長(zhǎng)的愈傷組織為抗潮霉素b的陽(yáng)性愈傷組織。將潮霉素b抗性的愈傷組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上，在光照下經(jīng)20d左右的誘導(dǎo)，愈傷組織分化成綠色的小植株，然后將幼小植株轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上，經(jīng)15～20d的誘導(dǎo)，形成完整的植株，最后轉(zhuǎn)到溫室生長(zhǎng)發(fā)育成熟的種子。此為t1種子。

當(dāng)t1種子收獲后，從水稻成熟胚乳中提取蛋白。轉(zhuǎn)基因水稻樣品用攪拌器攪拌，并用體積比為1:1比例的提取緩沖液(100mmkpi，ph7.8；5mmedta；10mmβ-巰基乙醇)攪拌機(jī)中高速勻漿1～2min。將勻漿物調(diào)節(jié)至ph為8.0，用紗布過(guò)濾，過(guò)濾物在4℃以10，000g離心15min以除去細(xì)胞碎片。收集上清液，與硫酸銨(50％)混合，并在冰上搖動(dòng)孵育60min。通過(guò)離心機(jī)(10，000g)在4℃下再次分離15min。將得到的上清液進(jìn)行第二輪硫酸銨(70％)沉淀，冰上搖動(dòng)懸浮60min，再次在4℃下以10，000g離心15min。然后，棄去上清液，將處理樣品沉淀蛋白質(zhì)溶于5ml緩沖液(20mmkpi，ph7.8；2mmedta；10mmβ-巰基乙醇)中并在-20℃下儲(chǔ)存。取樣品(5μl)熱變性(95℃)加載緩沖液(biorad，hercules，ca，usa)在4～12％bis-trisplussds-變性凝膠(thermofisherscientific，waltham，ma，usa)跑電泳，然后用考馬斯藍(lán)g250(biorad)染色后再次對(duì)凝膠進(jìn)行拍照。

克隆了雙元植物表達(dá)載體pcam-tpa，pcam-tnkase以及pcam-rpa。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法，成功的獲得t-pa，tnkase以及r-pa的轉(zhuǎn)基因植株。重組蛋白經(jīng)過(guò)sds-page分離(圖3)。在泳道中觀察到t-pa，tnkase以及r-pa分子量大約為55，55，40kda的條帶。在陽(yáng)性對(duì)照泳道中有對(duì)應(yīng)條帶，符合對(duì)重組蛋白大小的預(yù)期。

經(jīng)纖維蛋白溶解活性測(cè)定：將瓊脂糖(0.2g)置于40ml的磷酸鹽緩沖鹽水(1xpbs)中，通過(guò)在微波中煮沸然后冷卻至約40℃。凝膠固化之前，將32mg人纖維蛋白原(sigma-aldrich，st.louis，mo，usa)，10單位人纖溶酶原(rpeptidellc，bogart，ga，usa)和10單位人類凝血酶(biopharmlaboratoriesllc，bluffdale，ut，usa)加入到凝膠中并輕微旋轉(zhuǎn)混合以防止引入氣泡。然后將混合物倒入培養(yǎng)皿中并使其在室溫下固化。隨后在固化凝膠中制成孔(3mm直徑)。將10μl濃縮樣品(1μg/μl)稀釋在40μl的1xpbs緩沖液中，裝入凝膠孔中，并在室溫下孵育過(guò)夜。使用購(gòu)買的標(biāo)準(zhǔn)的t-pa，tnkase，以及r-pa作為陽(yáng)性對(duì)照(10μg)，測(cè)量清晰暈圈的實(shí)際直徑(mm)。

t-pa，tnkase，以及r-pa可以將纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，導(dǎo)致纖維蛋白溶解以及溶解血栓。在本發(fā)明中，纖維蛋白平板測(cè)定顯示植物來(lái)源的重組蛋白具有明顯溶解纖維蛋白的活性(圖4)。在商用以及重組t-pa，tnkase，以及r-pa蛋白的周圍顯示半透明的暈圈區(qū)。商用以及重組的溶解區(qū)域直徑大小一致，明重組蛋白活性與商用蛋白活性基本一致。

本發(fā)明提供了一種以水稻種子為生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組t-pa(組織型纖溶酶原激活劑，阿替普酶，reteplase或者alteplase),tnkase(替奈譜酶，tenecteplase)，r-pa(瑞替譜酶，reteplase)的方法，將水稻的種子成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體，采用載體介導(dǎo)的遺傳共轉(zhuǎn)化方法，將t-pa,tnkase，r-pa基因?qū)胨局?，使基因重組后的水稻種子表達(dá)重組人溶血蛋白。同大腸桿菌相比較，水稻種子可以自動(dòng)表達(dá)活性的重組蛋白，不穿變性復(fù)性過(guò)程。同時(shí)，水稻種子里面也不含有煙草所具有的有尼古丁，煙堿，等各種有毒酚類物質(zhì)。同動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)比較，水稻本身不帶有可以侵染人類的病毒，產(chǎn)品安全性較高，而且水稻可以大規(guī)模種植，對(duì)廠房條件不高，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。

圖1示puc57質(zhì)粒圖譜；

圖2(a)示t-pa植物雙元表達(dá)載體pcam-tpa構(gòu)建流程；利用限制性內(nèi)切酶(mlyl/xhol)雙酶切，從克隆載體puc-tpa切下t-pa片段，連接入pcam-gt13a的mlyl/xhol位點(diǎn)，生成水稻植物雙元表達(dá)載體pcam-tpa；其中，35s，具有煙草花葉病毒(tmv)5‘utr的camv35s啟動(dòng)子；hptii，潮霉素抗性基因；nos3’，終止子；gt13a為胚乳特異性表達(dá)的啟動(dòng)子；

圖2(b)示tnkase植物雙元表達(dá)載體pcam-tnkase構(gòu)建流程；利用限制性內(nèi)切酶(mlyl/xhol)雙酶切，從克隆載體puc-tnkase切下tnkase片段，連接入pcam-gt13a的mlyl/xhol位點(diǎn)，生成水稻植物雙元表達(dá)載體pcam-tnkase；其中，35s，具有煙草花葉病毒(tmv)5‘utr的camv35s啟動(dòng)子；hptii，潮霉素抗性基因；nos3’，終止子；gt13a為胚乳特異性表達(dá)的啟動(dòng)子；

圖2(c)示r-pa植物雙元表達(dá)載體pcam-tnkase構(gòu)建流程；利用限制性內(nèi)切酶(mlyl/xhol)雙酶切，從克隆載體puc-rpa切下r-pa片段，連接入pcam-gt13a的mlyl/xhol位點(diǎn)，生成水稻植物雙元表達(dá)載體pcam-rpa；其中，35s，具有煙草花葉病毒(tmv)5‘utr的camv35s啟動(dòng)子；hptii，潮霉素抗性基因；nos3’，終止子；gt13a為胚乳特異性表達(dá)的啟動(dòng)子；

圖3示利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)檢測(cè)純化的重組t-pa，tnkase，r-pa；其中，泳道1：純化重組t-pa(5μg)；泳道2：純化重組tnkase(5μg)；泳道3：純化重組r-pa(5μg)；泳道4:陽(yáng)性對(duì)照t-pa(5μg)；泳道5：陽(yáng)性對(duì)照tnkase(5μg)；泳道6：陽(yáng)性對(duì)照r-pa(5μg)；

圖4示纖維蛋白平板測(cè)定重組t-pa(a)，tnkase(b)以及r-pa(c)的活性；其中，t-pa，tnkase以及r-pa是分別從水稻種子中提取的重組純化蛋白，ck-t-pa，ck-tnkase以及ck-r-pa是商業(yè)用蛋白，用于陽(yáng)性對(duì)照；1×pbs為一倍濃度的磷酸鹽緩沖液，用于陰性對(duì)照。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開(kāi)了植物作為宿主在表達(dá)溶血蛋白中的應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明利用dna重組技術(shù)，通過(guò)水稻胚乳特異表達(dá)、蛋白質(zhì)定向儲(chǔ)存和目的基因密碼子優(yōu)化等技術(shù)，在水稻胚乳特異性高效表達(dá)重組人溶栓蛋白t-pa(組織型纖溶酶原激活劑),tnkase(替奈譜酶)，以及r-pa(瑞替譜酶)，提純后的產(chǎn)品活性與商用產(chǎn)品活性基本一致。本發(fā)明所得的重組人溶栓蛋白具有表達(dá)體系穩(wěn)定、表達(dá)效率高、成本低、規(guī)模化生產(chǎn)容易、生物活性高和無(wú)病原菌污染等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所得的重組人溶栓蛋白可廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域、醫(yī)藥產(chǎn)品、生物制藥等。

本發(fā)明提供的植物作為宿主在表達(dá)溶血蛋白中的應(yīng)用中所用原料及試劑均可由市場(chǎng)購(gòu)得。

下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：

實(shí)施例1植物表達(dá)構(gòu)建體

基于drugbank(t-pa，accessionno：db00015；r-pa，accessionno：db00015以及tnkase，accessionno：d6070)全長(zhǎng)氨基酸序列，通過(guò)反翻譯軟件，并且將密碼子優(yōu)化為水稻密碼子(見(jiàn)氨基酸序列如seqidno.1、seqidno.3、seqidno.5所示以及優(yōu)化的dna序列如seqidno.2、seqidno.4、seqidno.6所示)。將限制性位點(diǎn)mlyl以及xhol位點(diǎn)分別添加到優(yōu)化序列片段的5'末端以及3'末端，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆到puc57載體中(圖1)，得到克隆載體puc-tpa，puc-tnkase以及puc-rpa。通過(guò)mlyl以及xhol從puc-tpa，puc-tnkase以及puc-rpa中分離出tpa，tnkase，以及r-pa基因片段，并克隆入植物雙元載體pcam-gt13a中，以生成植物表達(dá)載體pcam-tpa，pcam-tnkase以及pcam-rpa(圖2)。隨后將植物表達(dá)載體通過(guò)multiporator(eppendorf，hamburg，germany)電穿孔轉(zhuǎn)化到根癌土壤桿菌lba4404中，用于水稻種子成熟胚愈傷組織的基因轉(zhuǎn)化。

實(shí)施例2水稻基因轉(zhuǎn)化

種子成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織：水稻品種臺(tái)北309種子，脫去谷殼后，經(jīng)20％次氯酸鈉消毒20min，經(jīng)無(wú)菌水漂洗3次，每次10min，然后放在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上經(jīng)20～30d的誘導(dǎo)，產(chǎn)生愈傷組織。將0.5μg的質(zhì)粒pospmp105和0.5μg具有選擇性標(biāo)記質(zhì)粒pospmp5的dna放入愈傷組織中，在室溫(20～25℃)下反應(yīng)30min，用酒精洗三次，然后采用農(nóng)桿菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)染，目的基因和選擇性標(biāo)記基因載體隨機(jī)整合到臺(tái)北309愈傷組織的細(xì)胞中。在含有50μg/ml的潮霉素b的選擇培養(yǎng)基上經(jīng)45d的篩選，繼續(xù)生長(zhǎng)的愈傷組織為抗潮霉素b的陽(yáng)性愈傷組織。將潮霉素b抗性的愈傷組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上，在光照下經(jīng)20d左右的誘導(dǎo)，愈傷組織分化成綠色的小植株，然后將幼小植株轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上，經(jīng)15～20d的誘導(dǎo)，形成完整的植株，最后轉(zhuǎn)到溫室生長(zhǎng)發(fā)育成熟的種子。此為t1種子。

實(shí)施例3利用sds-page凝膠電泳觀察純化重組蛋白的大小

當(dāng)t1種子收獲后，從水稻成熟胚乳中提取蛋白。轉(zhuǎn)基因水稻樣品用攪拌器攪拌，并用體積比為1:1比例的提取緩沖液(100mmkpi，ph7.8；5mmedta；10mmβ-巰基乙醇)攪拌機(jī)中高速勻漿1～2min。將勻漿物調(diào)節(jié)至ph為8.0，用紗布過(guò)濾，過(guò)濾物在4℃以10，000g離心15min以除去細(xì)胞碎片。收集上清液，與硫酸銨(50％)混合，并在冰上搖動(dòng)孵育60min。通過(guò)離心機(jī)(10，000g)在4℃下再次分離15min。將得到的上清液進(jìn)行第二輪硫酸銨(70％)沉淀，冰上搖動(dòng)懸浮60min，再次在4℃下以10，000g離心15min。然后，棄去上清液，將處理樣品沉淀蛋白質(zhì)溶于5ml緩沖液(20mmkpi，ph7.8；2mmedta；10mmβ-巰基乙醇)中并在-20℃下儲(chǔ)存。取樣品(5μl)熱變性(95℃)加載緩沖液(biorad，hercules，ca，usa)在4～12％bis-trisplussds-變性凝膠(thermofisherscientific，waltham，ma，usa)跑電泳，然后用考馬斯藍(lán)g250(biorad)染色后再次對(duì)凝膠進(jìn)行拍照。

克隆了雙元植物表達(dá)載體pcam-tpa，pcam-tnkase以及pcam-rpa。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法，成功的獲得t-pa，tnkase以及r-pa的轉(zhuǎn)基因植株。重組蛋白經(jīng)過(guò)sds-page分離(圖3)。在泳道中觀察到t-pa，tnkase以及r-pa分子量大約為55，55，40kda的條帶。在陽(yáng)性對(duì)照泳道中有對(duì)應(yīng)條帶，符合對(duì)重組蛋白大小的預(yù)期。

實(shí)施例4纖維蛋白溶解活性測(cè)定

將瓊脂糖(0.2g)置于40ml的磷酸鹽緩沖鹽水(1xpbs)中，通過(guò)在微波中煮沸然后冷卻至約40℃。凝膠固化之前，將32mg人纖維蛋白原(sigma-aldrich，st.louis，mo，usa)，10單位人纖溶酶原(rpeptidellc，bogart，ga，usa)和10單位人類凝血酶(biopharmlaboratoriesllc，bluffdale，ut，usa)加入到凝膠中并輕微旋轉(zhuǎn)混合以防止引入氣泡。然后將混合物倒入培養(yǎng)皿中并使其在室溫下固化。隨后在固化凝膠中制成孔(3mm直徑)。將10μl濃縮樣品(1μg/μl)稀釋在40μl的1xpbs緩沖液中，裝入凝膠孔中，并在室溫下孵育過(guò)夜。使用購(gòu)買的標(biāo)準(zhǔn)的t-pa，tnkase，以及r-pa作為陽(yáng)性對(duì)照(10μg)，測(cè)量清晰暈圈的實(shí)際直徑(mm)。

t-pa，tnkase以及r-pa可以將纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，導(dǎo)致纖維蛋白溶解以及溶解血栓。在本發(fā)明中，纖維蛋白平板測(cè)定顯示植物來(lái)源的重組蛋白具有明顯溶解纖維蛋白的活性(圖4)。在商用以及重組t-pa，tnkase，以及r-pa蛋白的周圍顯示半透明的暈圈區(qū)。商用以及重組的溶解區(qū)域直徑大小一致，明重組蛋白活性與商用蛋白活性基本一致。

實(shí)施例5

對(duì)照組1：利用動(dòng)物生產(chǎn)溶血蛋白(t-pa，tnkase以及r-pa)；

對(duì)照組2：利用煙葉生產(chǎn)溶血蛋白(t-pa，tnkase以及r-pa)；

實(shí)驗(yàn)組：本發(fā)明提供的植物生產(chǎn)溶血蛋白(t-pa，tnkase以及r-pa)；

表1溶血蛋白

^*示與對(duì)照組1相比p≤0.05；^**示與對(duì)照組1相比p≤0.01；

^#示與對(duì)照組2相比p≤0.05；^**示與對(duì)照組2相比p≤0.01；

由表1可知，與對(duì)照組1的動(dòng)物系統(tǒng)相比，本發(fā)明提供的水稻種子瞬時(shí)表達(dá)溶血蛋白(t-pa，tnkase以及r-pa)極顯著(p≤0.01)提高了蛋白含量，簡(jiǎn)化了蛋白純化的難易程度，極顯著(p≤0.01)降低了生產(chǎn)成本。

與對(duì)照組2的煙草種子系統(tǒng)相比，水稻種子瞬時(shí)表達(dá)溶血蛋白(t-pa，tnkase以及r-pa)顯著(p≤0.05)提高了蛋白含量，簡(jiǎn)化了蛋白純化的難易程度，極顯著(p≤0.01)降低了生產(chǎn)成本。

對(duì)照組2與對(duì)照組1相比，煙草種子瞬時(shí)表達(dá)溶血蛋白(t-pa，tnkase以及r-pa)比動(dòng)物系統(tǒng)顯著(p≤0.05)提高了蛋白含量，簡(jiǎn)化了蛋白純化的難易程度，極顯著(p≤0.01)降低了生產(chǎn)成本。

綜合上述試驗(yàn)結(jié)果表明，植物系統(tǒng)尤其是水稻種子是更加經(jīng)濟(jì)、高效的表達(dá)平臺(tái)。能夠快速瞬時(shí)表達(dá)重組蛋白質(zhì)，可以在短時(shí)間內(nèi)大規(guī)模生產(chǎn)溶血蛋白(t-pa，tnkase以及r-pa)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

sequencelisting

<110>深圳惠升生物科技有限公司

<120>植物作為宿主在表達(dá)溶血蛋白中的應(yīng)用

<130>mp1711333

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>527

<212>prt

<213>阿替普酶（t-pa）氨基酸序列

<400>1

sertyrglnvalilecysargaspglulysthrglnmetiletyrgln

151015

glnhisglnsertrpleuargprovalleuargserasnargvalglu

202530

tyrcystrpcysasnserglyargalaglncyshisservalproval

354045

lyssercyssergluproargcyspheasnglyglythrcysglngln

505560

alaleutyrpheseraspphevalcysglncysprogluglypheala

65707580

glylyscyscysgluileaspthrargalathrcystyrgluaspgln

859095

glyilesertyrargglythrtrpserthralagluserglyalaglu

100105110

cysthrasntrpasnserseralaleualaglnlysprotyrsergly

115120125

argargproaspalaileargleuglyleuglyasnhisasntyrcys

130135140

argasnproaspargaspserlysprotrpcystyrvalphelysala

145150155160

glylystyrsersergluphecysserthrproalacysserglugly

165170175

asnseraspcystyrpheglyasnglyseralatyrargglythrhis

180185190

serleuthrgluserglyalasercysleuprotrpasnsermetile

195200205

leuileglylysvaltyrthralaglnasnproseralaglnalaleu

210215220

glyleuglylyshisasntyrcysargasnproaspglyaspalalys

225230235240

protrpcyshisvalleulysasnargargleuthrtrpglutyrcys

245250255

aspvalprosercysserthrcysglyleuargglntyrserglnpro

260265270

glnpheargilelysglyglyleuphealaaspilealaserhispro

275280285

trpglnalaalailephealalyshisargargserproglygluarg

290295300

pheleucysglyglyileleuilesersercystrpileleuserala

305310315320

alahiscyspheglngluargpheproprohishisleuthrvalile

325330335

leuglyargthrtyrargvalvalproglygluglugluglnlysphe

340345350

gluvalglulystyrilevalhislysglupheaspaspaspthrtyr

355360365

aspasnaspilealaleuleuglnleulysseraspserserargcys

370375380

alaglngluserservalvalargthrvalcysleuproproalaasp

385390395400

leuglnleuproasptrpthrglucysgluleuserglytyrglylys

405410415

hisglualaleuserprophetyrsergluargleulysglualahis

420425430

valargleutyrproserserargcysthrserglnhisleuleuasn

435440445

argthrvalthraspasnmetleucysalaglyaspthrargsergly

450455460

glyproglnalaasnleuhisaspalacysglnglyaspserglygly

465470475480

proleuvalcysleuasnaspglyargmetthrleuvalglyileile

485490495

sertrpglyleuglycysglyglnlysaspvalproglyvaltyrthr

500505510

lysvalthrasntyrleuasptrpileargaspasnmetargpro

515520525

<210>2

<211>1601

<212>dna

<213>優(yōu)化后的阿替普酶（t-pa）

<400>2

gagtctagcgagctaccaggtgatctgccgcgacgagaagacccagatgatctaccagca60

gcaccagagctggctccgcccggtgctccgcagcaaccgcgtggagtactgctggtgcaa120

cagcggccgcgcccagtgccacagcgtgccggtgaagagctgcagcgagccgcgctgctt180

caacggcggcacctgccagcaggccctctacttcagcgacttcgtgtgccagtgcccgga240

gggcttcgccggcaagtgctgcgagatcgacacccgcgccacctgctacgaggaccaggg300

catcagctaccgcggcacctggagcaccgccgagagcggcgccgagtgcaccaactggaa360

cagcagcgccctcgcccagaagccgtacagcggccgccgcccggacgccatccgcctcgg420

cctcggcaaccacaactactgccgcaacccggaccgcgacagcaagccgtggtgctacgt480

gttcaaggccggcaagtacagcagcgagttctgcagcaccccggcctgcagcgagggcaa540

cagcgactgctacttcggcaacggcagcgcctaccgcggcacccacagcctcaccgagag600

cggcgccagctgcctcccgtggaacagcatgatcctcatcggcaaggtgtacaccgccca660

gaacccgagcgcccaggccctcggcctcggcaagcacaactactgccgcaacccggacgg720

cgacgccaagccgtggtgccacgtgctcaagaaccgccgcctcacctgggagtactgcga780

cgtgccgagctgcagcacctgcggcctccgccagtacagccagccgcagttccgcatcaa840

gggcggcctcttcgccgacatcgccagccacccgtggcaggccgccatcttcgccaagca900

ccgccgcagcccgggcgagcgcttcctctgcggcggcatcctcatcagcagctgctggat960

cctcagcgccgcccactgcttccaggagcgcttcccgccgcaccacctcaccgtgatcct1020

cggccgcacctaccgcgtggtgccgggcgaggaggagcagaagttcgaggtggagaagta1080

catcgtgcacaaggagttcgacgacgacacctacgacaacgacatcgccctcctccagct1140

caagagcgacagcagccgctgcgcccaggagagcagcgtggtgcgcaccgtgtgcctccc1200

gccggccgacctccagctcccggactggaccgagtgcgagctcagcggctacggcaagca1260

cgaggccctcagcccgttctacagcgagcgcctcaaggaggcccacgtgcgcctctaccc1320

gagcagccgctgcaccagccagcacctcctcaaccgcaccgtgaccgacaacatgctctg1380

cgccggcgacacccgcagcggcggcccgcaggccaacctccacgacgcctgccagggcga1440

cagcggcggcccgctcgtgtgcctcaacgacggccgcatgaccctcgtgggcatcatcag1500

ctggggcctcggctgcggccagaaggacgtgccgggcgtgtacaccaaggtgaccaacta1560

cctcgactggatccgcgacaacatgcgcccgtgagctcgag1601

<210>3

<211>355

<212>prt

<213>瑞替譜酶(r-pa)氨基酸序列

<400>3

sertyrglnglyasnseraspcystyrpheglyasnglyseralatyr

151015

argglythrhisserleuthrgluserglyalasercysleuprotrp

202530

asnsermetileleuileglylysvaltyrthralaglnasnproser

354045

alaglnalaleuglyleuglylyshisasntyrcysargasnproasp

505560

glyaspalalysprotrpcyshisvalleulysasnargargleuthr

65707580

trpglutyrcysaspvalprosercysserthrcysglyleuarggln

859095

tyrserglnproglnpheargilelysglyglyleuphealaaspile

100105110

alaserhisprotrpglnalaalailephealalyshisargargser

115120125

proglygluargpheleucysglyglyileleuilesersercystrp

130135140

ileleuseralaalahiscyspheglngluargpheproprohishis

145150155160

leuthrvalileleuglyargthrtyrargvalvalproglygluglu

165170175

gluglnlysphegluvalglulystyrilevalhislysglupheasp

180185190

aspaspthrtyraspasnaspilealaleuleuglnleulysserasp

195200205

serserargcysalaglngluserservalvalargthrvalcysleu

210215220

proproalaaspleuglnleuproasptrpthrglucysgluleuser

225230235240

glytyrglylyshisglualaleuserprophetyrsergluargleu

245250255

lysglualahisvalargleutyrproserserargcysthrsergln

260265270

hisleuleuasnargthrvalthraspasnmetleucysalaglyasp

275280285

thrargserglyglyproglnalaasnleuhisaspalacysglngly

290295300

aspserglyglyproleuvalcysleuasnaspglyargmetthrleu

305310315320

valglyileilesertrpglyleuglycysglyglnlysaspvalpro

325330335

glyvaltyrthrlysvalthrasntyrleuasptrpileargaspasn

340345350

metargpro

355

<210>4

<211>1085

<212>dna

<213>優(yōu)化后的瑞替譜酶(r-pa)

<400>4

gagtctagcgagctaccagggcaacagcgactgctacttcggcaacggcagcgcctaccg60

cggcacccacagcctcaccgagagcggcgccagctgcctcccgtggaacagcatgatcct120

catcggcaaggtgtacaccgcccagaacccgagcgcccaggccctcggcctcggcaagca180

caactactgccgcaacccggacggcgacgccaagccgtggtgccacgtgctcaagaaccg240

ccgcctcacctgggagtactgcgacgtgccgagctgcagcacctgcggcctccgccagta300

cagccagccgcagttccgcatcaagggcggcctcttcgccgacatcgccagccacccgtg360

gcaggccgccatcttcgccaagcaccgccgcagcccgggcgagcgcttcctctgcggcgg420

catcctcatcagcagctgctggatcctcagcgccgcccactgcttccaggagcgcttccc480

gccgcaccacctcaccgtgatcctcggccgcacctaccgcgtggtgccgggcgaggagga540

gcagaagttcgaggtggagaagtacatcgtgcacaaggagttcgacgacgacacctacga600

caacgacatcgccctcctccagctcaagagcgacagcagccgctgcgcccaggagagcag660

cgtggtgcgcaccgtgtgcctcccgccggccgacctccagctcccggactggaccgagtg720

cgagctcagcggctacggcaagcacgaggccctcagcccgttctacagcgagcgcctcaa780

ggaggcccacgtgcgcctctacccgagcagccgctgcaccagccagcacctcctcaaccg840

caccgtgaccgacaacatgctctgcgccggcgacacccgcagcggcggcccgcaggccaa900

cctccacgacgcctgccagggcgacagcggcggcccgctcgtgtgcctcaacgacggccg960

catgaccctcgtgggcatcatcagctggggcctcggctgcggccagaaggacgtgccggg1020

cgtgtacaccaaggtgaccaactacctcgactggatccgcgacaacatgcgcccgtgagc1080

tcgag1085

<210>5

<211>527

<212>prt

<213>替奈譜酶(tnkase)氨基酸序列

<400>5

sertyrglnvalilecysargaspglulysthrglnmetiletyrgln

151015

glnhisglnsertrpleuargprovalleuargserasnargvalglu

202530

tyrcystrpcysasnserglyargalaglncyshisservalproval

354045

lyssercyssergluproargcyspheasnglyglythrcysglngln

505560

alaleutyrpheseraspphevalcysglncysprogluglypheala

65707580

glylyscyscysgluileaspthrargalathrcystyrgluaspgln

859095

glyilesertyrargglyasntrpserthralagluserglyalaglu

100105110

cysthrasntrpglnserseralaleualaglnlysprotyrsergly

115120125

argargproaspalaileargleuglyleuglyasnhisasntyrcys

130135140

argasnproaspargaspserlysprotrpcystyrvalphelysala

145150155160

glylystyrsersergluphecysserthrproalacysserglugly

165170175

asnseraspcystyrpheglyasnglyseralatyrargglythrhis

180185190

serleuthrgluserglyalasercysleuprotrpasnsermetile

195200205

leuileglylysvaltyrthralaglnasnproseralaglnalaleu

210215220

glyleuglylyshisasntyrcysargasnproaspglyaspalalys

225230235240

protrpcyshisvalleulysasnargargleuthrtrpglutyrcys

245250255

aspvalprosercysserthrcysglyleuargglntyrserglnpro

260265270

glnpheargilelysglyglyleuphealaaspilealaserhispro

275280285

trpglnalaalailephealaalaalaalaalaserproglygluarg

290295300

pheleucysglyglyileleuilesersercystrpileleuserala

305310315320

alahiscyspheglngluargpheproprohishisleuthrvalile

325330335

leuglyargthrtyrargvalvalproglygluglugluglnlysphe

340345350

gluvalglulystyrilevalhislysglupheaspaspaspthrtyr

355360365

aspasnaspilealaleuleuglnleulysseraspserserargcys

370375380

alaglngluserservalvalargthrvalcysleuproproalaasp

385390395400

leuglnleuproasptrpthrglucysgluleuserglytyrglylys

405410415

hisglualaleuserprophetyrsergluargleulysglualahis

420425430

valargleutyrproserserargcysthrserglnhisleuleuasn

435440445

argthrvalthraspasnmetleucysalaglyaspthrargsergly

450455460

glyproglnalaasnleuhisaspalacysglnglyaspserglygly

465470475480

proleuvalcysleuasnaspglyargmetthrleuvalglyileile

485490495

sertrpglyleuglycysglyglnlysaspvalproglyvaltyrthr

500505510

lysvalthrasntyrleuasptrpileargaspasnmetargpro

515520525

<210>6

<211>1601

<212>dna

<213>優(yōu)化后的替奈譜酶(tnkase)

<400>6

gagtctagcgagctaccaggtgatctgccgcgacgagaagacccagatgatctaccagca60

gcaccagagctggctccgcccggtgctccgcagcaaccgcgtggagtactgctggtgcaa120

cagcggccgcgcccagtgccacagcgtgccggtgaagagctgcagcgagccgcgctgctt180

caacggcggcacctgccagcaggccctctacttcagcgacttcgtgtgccagtgcccgga240

gggcttcgccggcaagtgctgcgagatcgacacccgcgccacctgctacgaggaccaggg300

catcagctaccgcggcaactggagcaccgccgagagcggcgccgagtgcaccaactggca360

gagcagcgccctcgcccagaagccgtacagcggccgccgcccggacgccatccgcctcgg420

cctcggcaaccacaactactgccgcaacccggaccgcgacagcaagccgtggtgctacgt480

gttcaaggccggcaagtacagcagcgagttctgcagcaccccggcctgcagcgagggcaa540

cagcgactgctacttcggcaacggcagcgcctaccgcggcacccacagcctcaccgagag600

cggcgccagctgcctcccgtggaacagcatgatcctcatcggcaaggtgtacaccgccca660

gaacccgagcgcccaggccctcggcctcggcaagcacaactactgccgcaacccggacgg720

cgacgccaagccgtggtgccacgtgctcaagaaccgccgcctcacctgggagtactgcga780

cgtgccgagctgcagcacctgcggcctccgccagtacagccagccgcagttccgcatcaa840

gggcggcctcttcgccgacatcgccagccacccgtggcaggccgccatcttcgccgccgc900

cgccgccagcccgggcgagcgcttcctctgcggcggcatcctcatcagcagctgctggat960

cctcagcgccgcccactgcttccaggagcgcttcccgccgcaccacctcaccgtgatcct1020

cggccgcacctaccgcgtggtgccgggcgaggaggagcagaagttcgaggtggagaagta1080

catcgtgcacaaggagttcgacgacgacacctacgacaacgacatcgccctcctccagct1140

caagagcgacagcagccgctgcgcccaggagagcagcgtggtgcgcaccgtgtgcctccc1200

gccggccgacctccagctcccggactggaccgagtgcgagctcagcggctacggcaagca1260

cgaggccctcagcccgttctacagcgagcgcctcaaggaggcccacgtgcgcctctaccc1320

gagcagccgctgcaccagccagcacctcctcaaccgcaccgtgaccgacaacatgctctg1380

cgccggcgacacccgcagcggcggcccgcaggccaacctccacgacgcctgccagggcga1440

cagcggcggcccgctcgtgtgcctcaacgacggccgcatgaccctcgtgggcatcatcag1500

ctggggcctcggctgcggccagaaggacgtgccgggcgtgtacaccaaggtgaccaacta1560

cctcgactggatccgcgacaacatgcgcccgtgagctcgag1601