本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種細(xì)胞復(fù)蘇方法。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞復(fù)蘇是將長(zhǎng)期超低溫凍存于液氮中的細(xì)胞，迅速解凍到常溫過(guò)程，同時(shí)確?；謴?fù)細(xì)胞的活性與生物學(xué)特征。細(xì)胞凍存后復(fù)蘇的往往直接影響細(xì)胞復(fù)蘇的質(zhì)量，關(guān)于細(xì)胞復(fù)蘇的方法研究很多，專利號(hào)200510024978.2公開了一種胚胎干細(xì)胞復(fù)蘇方法，申請(qǐng)?zhí)朿n201510800480.4公布了一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇的方法，申請(qǐng)?zhí)朿n201510791550.4公布了一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇方法，申請(qǐng)?zhí)朿n201510791413.0公布了一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇方法。但是，現(xiàn)有的細(xì)胞復(fù)蘇方法，存在步驟使用特殊儀器、復(fù)蘇后細(xì)胞活率低、細(xì)胞易老化，細(xì)胞增殖能力差。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明實(shí)施例提供了一種細(xì)胞復(fù)蘇方法，能夠使復(fù)蘇后細(xì)胞活率高、不易老化、增殖能力好，滿足多種不同細(xì)胞凍存后復(fù)蘇的需要。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明實(shí)施例采用如下技術(shù)方案：本發(fā)明實(shí)施例提供一種細(xì)胞復(fù)蘇方法，所述細(xì)胞復(fù)蘇方法包括以下三個(gè)步驟：步驟一、將凍存的細(xì)胞取出后，放入50℃以下的恒溫水中震蕩溫育50-60s；步驟二、獲取經(jīng)過(guò)步驟一處理后的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)1500rpm離心3分鐘后去上清，加入無(wú)血清的dmem培養(yǎng)基37℃孵育2分鐘，其中，所述dmem培養(yǎng)基中包括濃度為1-15ng/ml的bfgf；步驟三、獲取經(jīng)過(guò)步驟二處理后的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)800rpm離心2分鐘后去上清，加入無(wú)血清的dmem/f12培養(yǎng)基孵育3分鐘。進(jìn)一步地，所述步驟一，具體包括：將凍存的細(xì)胞取出后，先放入42℃恒溫水中震蕩溫育20秒，再放入40℃恒溫水中震蕩溫育10秒，最后放入37℃恒溫水中震蕩溫育20秒。進(jìn)一步地，在所述步驟三執(zhí)行之后，所述細(xì)胞復(fù)蘇方法還包括：將所述細(xì)胞轉(zhuǎn)入正常細(xì)胞培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)。進(jìn)一步地，所述dmem培養(yǎng)基中包括的bfgf的濃度為5-10ng/ml。優(yōu)選的，所述dmem培養(yǎng)基中包括的bfgf的濃度為8ng/ml。進(jìn)一步地，所述細(xì)胞為表皮干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、角膜細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞或者口腔黏膜上皮細(xì)胞。進(jìn)一步地，所述dmem/f12是dmem培養(yǎng)液和f12培養(yǎng)液以體積比3:1的比例混合的。本發(fā)明實(shí)施例提供一種細(xì)胞復(fù)蘇方法，細(xì)胞復(fù)蘇方法包括以下三個(gè)步驟：步驟一、將凍存的細(xì)胞取出后，放入50℃以下的恒溫水中震蕩溫育50-60s；步驟二、獲取經(jīng)過(guò)步驟一處理后的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)1500rpm離心3分鐘后去上清，加入無(wú)血清的dmem培養(yǎng)基37℃孵育2分鐘，其中，所述dmem培養(yǎng)基中包括濃度為1-15ng/ml的bfgf；步驟三、獲取經(jīng)過(guò)步驟二處理后的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)800rpm離心2分鐘后去上清，加入無(wú)血清的dmem/f12培養(yǎng)基孵育3分鐘?；谏鲜鰧?shí)施例的描述，本發(fā)明主要是基于程序快速升溫理念，現(xiàn)在42℃溫育20s、然后是40℃10s、接著37℃20s，既能滿足解凍的要求，又可保護(hù)細(xì)胞，是最佳的要求。接著，是讓凍存細(xì)胞快速適應(yīng)新環(huán)境，采用不用的復(fù)蘇液，無(wú)血清的含1-15ng/mlbfgf的dmem培養(yǎng)基和無(wú)血清的dmem/f12培養(yǎng)基，是一種改良的方式讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)。本發(fā)明所述方法可以應(yīng)用于表皮干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、角膜細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、口腔黏膜上皮細(xì)胞的復(fù)蘇。本發(fā)明的有益效果：復(fù)蘇后的細(xì)胞活率高、細(xì)胞活性高，復(fù)蘇后的細(xì)胞增殖能力好。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的細(xì)胞復(fù)蘇方法復(fù)蘇的細(xì)胞與凍存前細(xì)胞的形態(tài)的示意圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的以現(xiàn)有常規(guī)方法復(fù)蘇的細(xì)胞和以本發(fā)明實(shí)施例提供的細(xì)胞復(fù)蘇方法復(fù)蘇的細(xì)胞的復(fù)蘇率比較圖。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)地描述。在細(xì)胞保存領(lǐng)域，一直有一種“緩凍快溶”的說(shuō)法。“快溶”就是指復(fù)蘇盡可能的快。但是在復(fù)蘇過(guò)程，往往溫度太高會(huì)造成細(xì)胞損傷，尤其是長(zhǎng)期凍存后的細(xì)胞比較脆弱。如何在復(fù)蘇的溫度和解凍速率找一個(gè)平衡，是本發(fā)明的關(guān)鍵。本發(fā)明實(shí)施例提供一種細(xì)胞復(fù)蘇方法，首先，將同等數(shù)量的表皮干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、口腔黏膜混入無(wú)血清商業(yè)化凍存液dmem/f12后，冰箱4℃1天、-20℃兩天、-80℃3天，然后放入液氮凍存。其次，對(duì)上述放入液氮凍存6個(gè)月的表皮細(xì)胞，按照以下步驟對(duì)細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇：步驟一、將凍存的細(xì)胞取出后，放入50℃以下的恒溫水中震蕩溫育50-60s；步驟二、獲取經(jīng)過(guò)步驟一處理后的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)1500rpm離心3分鐘后去上清，加入無(wú)血清的dmem培養(yǎng)基37℃孵育2分鐘，其中，所述dmem培養(yǎng)基中包括濃度為1-15ng/ml的bfgf；步驟三、獲取經(jīng)過(guò)步驟二處理后的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)800rpm離心2分鐘后去上清，加入無(wú)血清的dmem/f12培養(yǎng)基孵育3分鐘。示例性的，本發(fā)明實(shí)施例提供的細(xì)胞復(fù)蘇方法可以包括：步驟1、將凍存的細(xì)胞取出后放入42℃恒溫水中震蕩溫育20秒、40℃恒溫水中震蕩溫育10秒、37℃恒溫水中震蕩溫育20秒；步驟2、將步驟1的產(chǎn)物1500rpm離心3分鐘后去上清，加入無(wú)血清的含1、8或者15ng/mlbfgf的dmem培養(yǎng)基37℃孵育2分鐘；或者將步驟1的產(chǎn)物1500rpm離心3分鐘后去上清，加入無(wú)血清的含8ng/mlbfgf的dmem培養(yǎng)基37℃孵育2分鐘；或者將步驟1的產(chǎn)物1500rpm離心3分鐘后去上清，加入無(wú)血清的含15ng/mlbfgf的dmem培養(yǎng)基37℃孵育2分鐘；步驟3、將步驟2的產(chǎn)物800rpm離心2分鐘后去上清，加入無(wú)血清的dmem/f12培養(yǎng)基孵育3分鐘。將上述步驟復(fù)蘇的細(xì)胞與凍存前細(xì)胞的形態(tài)作對(duì)比，結(jié)果如圖1。從圖1可以看出，用本發(fā)明復(fù)蘇方法復(fù)蘇的細(xì)胞與凍存前細(xì)胞形態(tài)非常相近，幾乎沒(méi)有變化，說(shuō)明本發(fā)明復(fù)蘇方法對(duì)細(xì)胞起到很好地保護(hù)作用。同時(shí)，將液氮凍存6個(gè)月后的細(xì)胞以現(xiàn)有常規(guī)方法在42℃水域中復(fù)蘇2分鐘，800rpm離心2分鐘后去上清，加入無(wú)血清的dmem/f12培養(yǎng)基孵育3分鐘。將其與以本發(fā)明實(shí)施例提供的細(xì)胞復(fù)蘇方法復(fù)蘇的細(xì)胞的復(fù)蘇率作對(duì)比，結(jié)果具體見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，本發(fā)明提供的復(fù)蘇方法，細(xì)胞的復(fù)蘇率高于現(xiàn)有常規(guī)方法。對(duì)以現(xiàn)有常規(guī)方法復(fù)蘇的細(xì)胞和以本發(fā)明實(shí)施例提供的細(xì)胞復(fù)蘇方法復(fù)蘇的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，觀察細(xì)胞開始老化代次，具體結(jié)果見(jiàn)表1。表1本發(fā)明現(xiàn)有復(fù)蘇方法表皮干細(xì)胞p13p7成纖維細(xì)胞p18p13脂肪干細(xì)胞p15p11黑色素細(xì)胞p16p13口腔黏膜模型p21p18通過(guò)表1，可以看出，以本發(fā)明實(shí)施例提供的細(xì)胞復(fù)蘇方法復(fù)蘇的細(xì)胞在復(fù)蘇后開始老化代次明顯要大于以現(xiàn)有常規(guī)方法復(fù)蘇的細(xì)胞，說(shuō)明本發(fā)明提供的復(fù)蘇方法復(fù)蘇的細(xì)胞活性或性能優(yōu)于現(xiàn)有復(fù)蘇方法的細(xì)胞。本發(fā)明實(shí)施例提供一種細(xì)胞復(fù)蘇方法，細(xì)胞復(fù)蘇方法包括以下三個(gè)步驟：步驟一、將凍存的細(xì)胞取出后，放入50℃以下的恒溫水中震蕩溫育50-60s；步驟二、獲取經(jīng)過(guò)步驟一處理后的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)1500rpm離心3分鐘后去上清，加入無(wú)血清的dmem培養(yǎng)基37℃孵育2分鐘，其中，所述dmem培養(yǎng)基中包括濃度為1-15ng/ml的bfgf；步驟三、獲取經(jīng)過(guò)步驟二處理后的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)800rpm離心2分鐘后去上清，加入無(wú)血清的dmem/f12培養(yǎng)基孵育3分鐘?；谏鲜鰧?shí)施例的描述，復(fù)蘇后的細(xì)胞活率高、細(xì)胞活性高，復(fù)蘇后的細(xì)胞增殖能力好。以上所述，僅為本申請(qǐng)的具體實(shí)施方式，但本申請(qǐng)的保護(hù)范圍并不局限于此，任何在本申請(qǐng)揭露的技術(shù)范圍內(nèi)的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本申請(qǐng)的保護(hù)范圍應(yīng)以所述權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁(yè)12