本發(fā)明屬于組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黑素細(xì)胞均勻生長的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

隨著體外檢測的發(fā)展，3d皮膚模型已經(jīng)成為了體外檢測的主要研究工具。目前市場上已經(jīng)有epiderm(mattekcorporation)和episkin(episkinsnc)已經(jīng)完成正式的體外皮膚刺激性檢測驗(yàn)證，并納入oecdtg439指南。并且隨著市場的需要，不同類型的皮膚模型也被開發(fā)，例如：含黑素的表皮皮膚模型，雙層皮膚模型等。

美白祛斑化妝品是化妝品研究中的重要方向之一。目前對于美白化妝品的安全以及功效評價(jià)都是基于動物模型如豚鼠進(jìn)行驗(yàn)證，但是隨著歐盟對動物實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)令禁止，美白化妝品的安全與功效評價(jià)成為的化妝品上市前的一大難題。如果有一款黑素皮膚模型的認(rèn)證成功就可以解決美白化妝品的上市難題。但是黑色素細(xì)胞僅占表皮細(xì)胞數(shù)量的1％左右，而且其貼壁能力差，生長緩慢，增殖能力極為有限，容易聚集，所以提高黑素細(xì)胞的貼壁能力以及降低聚集能力是黑色素細(xì)胞培養(yǎng)的重點(diǎn)，同時(shí)也解決了黑素模型構(gòu)建過程中的膚色不均的難題。

現(xiàn)有技術(shù)中，促進(jìn)黑色素細(xì)胞生長主要是在黑素細(xì)胞的培養(yǎng)液中添加一定濃度的tpa(12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate)和霍亂毒素。但是tpa具有潛在的致癌作用，從而使上述培養(yǎng)方法在臨床上受到了限制。堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bfgf）和二丁酰環(huán)腺苷酸（dcamp）作為添加劑替代tpa進(jìn)行原代培養(yǎng)則解決了上述技術(shù)問題，該技術(shù)可以使促進(jìn)黑色素細(xì)胞生長，并且規(guī)避了tpa具有潛在的致癌的風(fēng)險(xiǎn)。黑素細(xì)胞一般在24h才能夠完全貼壁，而目前解決的黑素細(xì)胞的貼壁方式主要是采用預(yù)培養(yǎng)的方式，在接種或是共培養(yǎng)前，將黑素細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)5h～10h，然后在接種其他細(xì)胞構(gòu)建模型或是細(xì)胞膜片用于體外檢測以及臨床。這樣的技術(shù)雖然解決了黑素細(xì)胞的貼壁問題，但是時(shí)間過長導(dǎo)致成本增高。

從黑素皮膚模型的研究現(xiàn)狀可以看出，黑素皮膚模型的表觀有的呈現(xiàn)黑素顆粒的點(diǎn)狀聚集，有的呈現(xiàn)黑素的片狀聚集。因此對于黑素皮膚模型的黑素細(xì)胞的快速貼壁以解決黑素細(xì)胞在載體上的均勻分布是解決模型構(gòu)建中黑色素聚集的關(guān)鍵問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種黑素細(xì)胞均勻生長的培養(yǎng)方法。該方法既可以保證黑素細(xì)胞的活性，又能使黑素細(xì)胞快速貼壁并能均勻生長，采用該方法培養(yǎng)的黑素細(xì)胞貼壁率提高了25%～40%。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種黑素細(xì)胞均勻生長的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一、收集黑素細(xì)胞，用m254液體培養(yǎng)基培養(yǎng)收集的黑素細(xì)胞；

步驟二、用多聚賴氨酸溶液對培養(yǎng)小室底膜進(jìn)行過夜包被處理，然后將包被處理后的培養(yǎng)小室置于孔板中，每個小室底膜滴加200μl多聚賴氨酸溶液進(jìn)行包被，最后將孔板封閉，于37℃培養(yǎng)箱過夜，得到預(yù)處理的培養(yǎng)板；

步驟三、將步驟一中培養(yǎng)收集的黑素細(xì)胞制成細(xì)胞懸液加入步驟二中預(yù)處理的培養(yǎng)板中，晃動使細(xì)胞均勻鋪于培養(yǎng)板上，然后向培養(yǎng)板中加入黑素細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)液，于co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h后取出培養(yǎng)板；所述黑素細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)液以dmem培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加ksfm液體培養(yǎng)基、胎牛血清、l-谷氨酰胺、霍亂毒素、12-o-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯和氯化鈣，黑素細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)液中ksfm液體培養(yǎng)基的體積百分含量為5%～10%，胎牛血清的體積百分含量為5%～15%，l-谷氨酰胺的濃度為6mm～15mm，霍亂毒素的濃度為0.2g/ml～0.8g/ml，12-o-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯的濃度為3nmol/l～13nmol/l，氯化鈣的濃度為4mm～10mm；

步驟四、將步驟三中取出的培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液更換成增殖培養(yǎng)液，于co2培養(yǎng)箱中增殖培養(yǎng)24h～48h；所述增殖培養(yǎng)液以m254液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)液，添加黑素細(xì)胞生長添加因子hmgs和胎牛血清，增殖培養(yǎng)液中黑素細(xì)胞生長添加因子hmgs的體積百分含量為0.5%～5%，胎牛血清的體積百分含量為5%～15%。

上述的一種黑素細(xì)胞均勻生長的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟一中收集黑素細(xì)胞的方法具體為：用75%的酒精對皮膚樣本組織進(jìn)行消毒，去除血跡；然后剝離皮膚樣本組織的皮下疏松結(jié)締組織，接著將皮膚樣本組織裁剪后用dispase消化液消化16h～20h，使表皮層與真皮層分離；再用0.25%胰酶溶液對表皮層消化5min～15min；最后用無菌的200目篩網(wǎng)收集黑素細(xì)胞。

上述的一種黑素細(xì)胞均勻生長的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟二中所述多聚賴氨酸溶液的濃度為25μg/ml～75μg/ml。

上述的一種黑素細(xì)胞均勻生長的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟三中所述黑素細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)液的ph值為8～10。

上述的一種黑素細(xì)胞均勻生長的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟四中所述增殖培養(yǎng)液的ph值為7.2～7.4。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、采用本發(fā)明的培養(yǎng)方法培養(yǎng)的黑素細(xì)胞貼壁時(shí)間由原來的15h～24h縮短到1h左右，細(xì)胞增殖迅速，傳代2～3代后細(xì)胞數(shù)量可以達(dá)到2×106cells/ml～6×106cells/ml，并且黑素細(xì)胞的活力以及分泌黑素顆粒的能力穩(wěn)定。

2、本發(fā)明的方法既可以保證黑素細(xì)胞的活性，又能使黑素細(xì)胞快速貼壁并能均勻生長，采用該方法培養(yǎng)的黑素細(xì)胞貼壁率提高了25%～40%。

3、采用本發(fā)明的方法培養(yǎng)的黑素細(xì)胞可以應(yīng)用于白癜風(fēng)臨床治療中使用的黑素細(xì)胞膜片的制備，也可用于體外檢測黑素模型構(gòu)建過程中保證黑素皮膚模型表觀膚色的均勻度。

4、與已有的黑素細(xì)胞培養(yǎng)方法相比，本發(fā)明的黑素細(xì)胞培養(yǎng)方法提高了原代培養(yǎng)中黑素細(xì)胞的成活率，減少了黑素細(xì)胞的貼壁時(shí)間，降低的黑素細(xì)胞的聚集程度。

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的培養(yǎng)板和對比例取出的孔板中黑素細(xì)胞的貼壁率對比圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2增殖培養(yǎng)24h后黑素細(xì)胞的鏡下形態(tài)照片。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2增殖培養(yǎng)的黑素細(xì)胞傳代到3代后的l-dopa染色照片。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例3增殖培養(yǎng)的黑素細(xì)胞傳代到3代后的銀染照片。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例4增殖培養(yǎng)的黑素細(xì)胞傳代到3代后制備的黑素皮膚模型的表觀圖。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例4增殖培養(yǎng)的黑素細(xì)胞傳代到3代后制備的黑素皮膚模型的銀染圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

本實(shí)施例的黑素細(xì)胞均勻生長的培養(yǎng)方法包括以下步驟：

步驟一、用75%的酒精對皮膚樣本組織進(jìn)行消毒，去除血跡；然后剝離皮膚樣本組織的皮下疏松結(jié)締組織，接著將皮膚樣本組織裁剪成9mm×3mm的碎片后用dispase消化液消化20h，使表皮層與真皮層分離；再用0.25%胰酶溶液對表皮層消化15min；用無菌的200目篩網(wǎng)收集黑素細(xì)胞；最后用m254液體培養(yǎng)基培養(yǎng)收集的黑素細(xì)胞；

步驟二、用濃度為50μg/ml的多聚賴氨酸溶液對培養(yǎng)小室底膜進(jìn)行過夜包被處理，然后將包被處理后的培養(yǎng)小室置于96孔板中，每個小室底膜滴加200μl濃度為50μg/ml的多聚賴氨酸溶液進(jìn)行包被，最后將96孔板封閉，于37℃培養(yǎng)箱過夜，得到預(yù)處理的培養(yǎng)板；

步驟三、將步驟一中培養(yǎng)的黑素細(xì)胞制成細(xì)胞懸液加入步驟二中預(yù)處理的培養(yǎng)板中，晃動使細(xì)胞均勻鋪于培養(yǎng)板上，然后向培養(yǎng)板中加入黑素細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h后取出培養(yǎng)板；所述黑素細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)液以dmem培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加ksfm液體培養(yǎng)基、胎牛血清、l-谷氨酰胺、霍亂毒素、12-o-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯和氯化鈣，黑素細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)液中ksfm液體培養(yǎng)基的體積百分含量為5%，胎牛血清的體積百分含量為15%，l-谷氨酰胺的濃度為6mm，霍亂毒素的濃度為0.2g/ml，12-o-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯的濃度為3nmol/l，氯化鈣的濃度為10mm，黑素細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)液的ph值為9。

對比例

步驟一、用75%的酒精對皮膚樣本組織進(jìn)行消毒，去除血跡；然后剝離皮膚樣本組織的皮下疏松結(jié)締組織，接著將皮膚樣本組織裁剪成9mm×3mm的碎片后用dispase消化液消化20h，使表皮層與真皮層分離；再用0.25%胰酶溶液對表皮層消化15min；用無菌的200目篩網(wǎng)收集黑素細(xì)胞；最后用m254液體培養(yǎng)基培養(yǎng)收集的黑素細(xì)胞；

步驟二、將步驟一中培養(yǎng)的黑素細(xì)胞制成細(xì)胞懸液加入96孔板的培養(yǎng)小室中，晃動使細(xì)胞均勻鋪于孔板上，然后向孔板中加入黑素細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h后取出培養(yǎng)板；所述黑素細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)液以dmem培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加ksfm液體培養(yǎng)基、胎牛血清、l-谷氨酰胺、霍亂毒素、12-o-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯和氯化鈣，黑素細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)液中ksfm液體培養(yǎng)基的體積百分含量為5%，胎牛血清的體積百分含量為15%，l-谷氨酰胺的濃度為6mm，霍亂毒素的濃度為0.2g/ml，12-o-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯的濃度為3nmol/l，氯化鈣的濃度為10mm，黑素細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)液的ph值為9。

觀察實(shí)施例1取出的培養(yǎng)板和對比例取出的孔板中黑素細(xì)胞的貼壁情況，并使用mtt法檢測黑素細(xì)胞的貼壁率，結(jié)果如圖1所示，可以看出，采用實(shí)施例1的方法培養(yǎng)的黑素細(xì)胞的貼壁率比對比例提高了30%。

實(shí)施例2

本實(shí)施例的黑素細(xì)胞均勻生長的培養(yǎng)方法包括以下步驟：

步驟一、用75%的酒精對皮膚樣本組織進(jìn)行消毒，去除血跡；然后剝離皮膚樣本組織的皮下疏松結(jié)締組織，接著將皮膚樣本組織裁剪成9mm×3mm的碎片后用dispase消化液消化20h，使表皮層與真皮層分離；再用0.25%胰酶溶液對表皮層消化15min；用無菌的200目篩網(wǎng)收集黑素細(xì)胞；最后用m254液體培養(yǎng)基培養(yǎng)收集的黑素細(xì)胞；

步驟二、用濃度為50μg/ml的多聚賴氨酸溶液對培養(yǎng)小室底膜進(jìn)行過夜包被處理，然后將包被處理后的培養(yǎng)小室置于96孔板中，每個小室底膜滴加200μl濃度為50μg/ml的多聚賴氨酸溶液進(jìn)行包被，最后將96孔板封閉，于37℃培養(yǎng)箱過夜，得到預(yù)處理的培養(yǎng)板；

步驟三、將步驟一中培養(yǎng)的黑素細(xì)胞制成細(xì)胞懸液加入步驟二中預(yù)處理的培養(yǎng)板中，晃動使細(xì)胞均勻鋪于培養(yǎng)板上，然后向培養(yǎng)板中加入黑素細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h后取出培養(yǎng)板；所述黑素細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)液以dmem培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加ksfm液體培養(yǎng)基、胎牛血清、l-谷氨酰胺、霍亂毒素、12-o-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯和氯化鈣，黑素細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)液中ksfm液體培養(yǎng)基的體積百分含量為5%，胎牛血清的體積百分含量為15%，l-谷氨酰胺的濃度為6mm，霍亂毒素的濃度為0.2g/ml，12-o-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯的濃度為3nmol/l，氯化鈣的濃度為10mm，黑素細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)液的ph值為9；

步驟四、將步驟三中取出的培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液更換成增殖培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中增殖培養(yǎng)24h；所述增殖培養(yǎng)液以m254液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)液，添加黑素細(xì)胞生長添加因子hmgs和胎牛血清，增殖培養(yǎng)液中黑素細(xì)胞生長添加因子hmgs的體積百分含量為3%，胎牛血清的體積百分含量為10%，增殖培養(yǎng)液的ph值為7.3。

觀察本實(shí)施例步驟三取出的培養(yǎng)板中黑素細(xì)胞的貼壁情況，并使用mtt法檢測黑素細(xì)胞的貼壁率，黑素細(xì)胞的貼壁率比對比例提高了25%。

本實(shí)施例增殖培養(yǎng)24h后進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)貼壁的黑素細(xì)胞狀態(tài)好，克隆狀態(tài)好，如圖2所示，圖中顯示黑素細(xì)胞具有較好的細(xì)胞狀態(tài)，黑素細(xì)胞胞核透光性好，細(xì)胞樹突分支較少（樹突量≤3個），黑色素細(xì)胞分級為3級，具有較好的細(xì)胞活性及生物學(xué)功能，并且黑素細(xì)胞均勻分布于細(xì)胞板中，匯合度達(dá)到80%左右。

對本實(shí)施例增殖培養(yǎng)的黑素細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行增殖培養(yǎng)，每周換液3次，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%飽和后，對細(xì)胞進(jìn)行消化，回收，重懸，接種進(jìn)行擴(kuò)增傳代，接種密度為5×103cells/cm²，消化的具體步驟為：用pbs清洗，然后加入0.25%胰酶溶液在37℃，5%co2培養(yǎng)箱中消化3min，顯微鏡下觀察到黑素細(xì)胞已經(jīng)從培養(yǎng)板上剝離，即終止消化。1周內(nèi)即可擴(kuò)增傳代到3代，此時(shí)黑素細(xì)胞數(shù)目可以達(dá)到7×106cells/ml，黑素細(xì)胞呈網(wǎng)絡(luò)狀克隆樣增殖，形態(tài)上細(xì)胞體小，呈現(xiàn)2～3個分枝，黑素細(xì)胞的分枝可以彼此相連，對細(xì)胞進(jìn)行多巴染色，結(jié)果見圖3，從圖中可以看出，黑素細(xì)胞呈現(xiàn)灰色且均勻分布。

實(shí)施例3

本實(shí)施例的黑素細(xì)胞均勻生長的培養(yǎng)方法包括以下步驟：

步驟一、用75%的酒精對皮膚樣本組織進(jìn)行消毒，去除血跡；然后剝離皮膚樣本組織的皮下疏松結(jié)締組織，接著將皮膚樣本組織裁剪成9mm×3mm的碎片后用dispase消化液消化16h，使表皮層與真皮層分離；再用0.25%胰酶溶液對表皮層消化5min；用無菌的200目篩網(wǎng)收集黑素細(xì)胞；最后用m254液體培養(yǎng)基培養(yǎng)收集的黑素細(xì)胞；

步驟二、用濃度為75μg/ml的多聚賴氨酸溶液對培養(yǎng)小室底膜進(jìn)行過夜包被處理，然后將包被處理后的培養(yǎng)小室置于24孔板中，每個小室底膜滴加200μl濃度為75μg/ml的多聚賴氨酸溶液進(jìn)行包被，最后將24孔板封閉，于37℃培養(yǎng)箱過夜，得到預(yù)處理的培養(yǎng)板；

步驟三、將步驟一中培養(yǎng)的黑素細(xì)胞制成細(xì)胞懸液加入步驟二中預(yù)處理的培養(yǎng)板中，晃動使細(xì)胞均勻鋪于培養(yǎng)板上，然后向培養(yǎng)板中加入黑素細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h后取出培養(yǎng)板；所述黑素細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)液以dmem培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加ksfm液體培養(yǎng)基、胎牛血清、l-谷氨酰胺、霍亂毒素、12-o-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯和氯化鈣，黑素細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)液中ksfm液體培養(yǎng)基的體積百分含量為10%，胎牛血清的體積百分含量為5%，l-谷氨酰胺的濃度為15mm，霍亂毒素的濃度為0.8g/ml，12-o-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯的濃度為13nmol/l，氯化鈣的濃度為4mm，黑素細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)液的ph值為10；

步驟四、將步驟三中取出的培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液更換成增殖培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中增殖培養(yǎng)48h；所述增殖培養(yǎng)液以m254液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)液，添加黑素細(xì)胞生長添加因子hmgs和胎牛血清，增殖培養(yǎng)液中黑素細(xì)胞生長添加因子hmgs的體積百分含量為0.5%，胎牛血清的體積百分含量為15%，增殖培養(yǎng)液的ph值為7.2。

觀察本實(shí)施例步驟三取出的培養(yǎng)板中黑素細(xì)胞的貼壁情況，并使用mtt法檢測黑素細(xì)胞的貼壁率，黑素細(xì)胞的貼壁率比對比例提高了40%。

本實(shí)施例增殖培養(yǎng)48h后進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)貼壁的黑素細(xì)胞狀態(tài)好，克隆狀態(tài)好，黑素細(xì)胞具有較好的細(xì)胞狀態(tài)，黑素細(xì)胞胞核透光性好。

對本實(shí)施例增殖培養(yǎng)的黑素細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行增殖培養(yǎng)，每周換液3次，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%飽和后，對細(xì)胞進(jìn)行消化，回收，重懸，接種進(jìn)行擴(kuò)增傳代，接種密度為5×103cells/cm²，消化的具體步驟為：用pbs清洗，然后加入0.25%胰酶溶液在37℃，5%co2培養(yǎng)箱中消化3min，顯微鏡下觀察到黑素細(xì)胞已經(jīng)從培養(yǎng)板上剝離，即終止消化。1周內(nèi)即可擴(kuò)增傳代到3代，傳代到2代時(shí)黑素細(xì)胞數(shù)目可以達(dá)到2×106cells/ml，傳代到3代時(shí)黑素細(xì)胞數(shù)目可以達(dá)到7×106cells/ml，黑素細(xì)胞呈網(wǎng)絡(luò)狀克隆樣增殖，形態(tài)上細(xì)胞體小，呈現(xiàn)2～3個分枝，使用銀染試劑盒對黑素細(xì)胞進(jìn)行染色，結(jié)果見圖4，從圖中可以看出，黑素細(xì)胞具有良好的分泌黑素顆粒的能力。

實(shí)施例4

本實(shí)施例的黑素細(xì)胞均勻生長的培養(yǎng)方法包括以下步驟：

步驟一、用75%的酒精對皮膚樣本組織進(jìn)行消毒，去除血跡；然后剝離皮膚樣本組織的皮下疏松結(jié)締組織，接著將皮膚樣本組織裁剪成9mm×3mm的碎片后用dispase消化液消化18h，使表皮層與真皮層分離；再用0.25%胰酶溶液對表皮層消化10min；用無菌的200目篩網(wǎng)收集黑素細(xì)胞；最后用m254液體培養(yǎng)基培養(yǎng)收集的黑素細(xì)胞；

步驟二、用濃度為25μg/ml的多聚賴氨酸溶液對培養(yǎng)小室底膜進(jìn)行過夜包被處理，然后將包被處理后的培養(yǎng)小室置于48孔板中，每個小室底膜滴加200μl濃度為25μg/ml的多聚賴氨酸溶液進(jìn)行包被，最后將48孔板封閉，于37℃培養(yǎng)箱過夜，得到預(yù)處理的培養(yǎng)板；

步驟三、將步驟一中培養(yǎng)的黑素細(xì)胞制成細(xì)胞懸液加入步驟二中預(yù)處理的培養(yǎng)板中，晃動使細(xì)胞均勻鋪于培養(yǎng)板上，然后向培養(yǎng)板中加入黑素細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h后取出培養(yǎng)板；所述黑素細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)液以dmem培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加ksfm液體培養(yǎng)基、胎牛血清、l-谷氨酰胺、霍亂毒素、12-o-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯和氯化鈣，黑素細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)液中ksfm液體培養(yǎng)基的體積百分含量為8%，胎牛血清的體積百分含量為10%，l-谷氨酰胺的濃度為10mm，霍亂毒素的濃度為0.5g/ml，12-o-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯的濃度為10nmol/l，氯化鈣的濃度為6mm，黑素細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)液的ph值為8；

步驟四、將步驟三中取出的培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液更換成增殖培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中增殖培養(yǎng)36h；所述增殖培養(yǎng)液以m254液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)液，添加黑素細(xì)胞生長添加因子hmgs和胎牛血清，增殖培養(yǎng)液中黑素細(xì)胞生長添加因子hmgs的體積百分含量為5%，胎牛血清的體積百分含量為5%，增殖培養(yǎng)液的ph值為7.4。

觀察本實(shí)施例步驟三取出的培養(yǎng)板中黑素細(xì)胞的貼壁情況，并使用mtt法檢測黑素細(xì)胞的貼壁率，黑素細(xì)胞的貼壁率比對比例提高了35%。

本實(shí)施例增殖培養(yǎng)36h后進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)貼壁的黑素細(xì)胞狀態(tài)好，克隆狀態(tài)好，黑素細(xì)胞具有較好的細(xì)胞狀態(tài)，黑素細(xì)胞胞核透光性好。

對本實(shí)施例增殖培養(yǎng)的黑素細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行增殖培養(yǎng)，每周換液3次，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%飽和后，對細(xì)胞進(jìn)行消化，回收，重懸，接種進(jìn)行擴(kuò)增傳代，接種密度為5×103cells/cm²，消化的具體步驟為：用pbs清洗，然后加入0.25%胰酶溶液在37℃，5%co2培養(yǎng)箱中消化3min，顯微鏡下觀察到黑素細(xì)胞已經(jīng)從培養(yǎng)板上剝離，即終止消化。1周內(nèi)即可擴(kuò)增傳代到3代，此時(shí)黑素細(xì)胞數(shù)目可以達(dá)到6×106cells/ml，黑素細(xì)胞呈網(wǎng)絡(luò)狀克隆樣增殖，形態(tài)上細(xì)胞體小，呈現(xiàn)2～3個分枝，將黑素細(xì)胞消化，制成細(xì)胞懸液，按照常規(guī)黑素皮膚模型構(gòu)建過程接種于黑素皮膚模型的培養(yǎng)裝置中，經(jīng)氣液面培養(yǎng)后的黑素皮膚模型表觀見圖5，從圖中可以看出，黑素皮膚模型表觀顏色均一，沒有明顯的黑素顆粒聚集。對黑素皮膚模型進(jìn)行組織切片銀染，結(jié)果見圖6，從圖中可以看出，黑素細(xì)胞均勻的分布于表皮的基底層。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對本發(fā)明做任何限制，凡是根據(jù)發(fā)明技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、變更以及等效結(jié)構(gòu)變化，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍內(nèi)。