本發(fā)明屬于細胞培養(yǎng)技術領域，具體涉及一種黑素細胞與角質形成細胞共培養(yǎng)用培養(yǎng)基。

背景技術：

人類皮膚顏色的形成主要是黑素細胞產生并分泌的黑素小體到達角質形成細胞，并在角質形成細胞中重新分布。建立人表皮黑素細胞與角質形成細胞共培養(yǎng)模型可以為研究皮膚色素發(fā)生發(fā)展機制提供研究平臺。生理情況下，黑素細胞可以通過樹突與周圍角質形成細胞發(fā)生接觸和聯(lián)系，角質形成細胞通過直接的細胞間連接控制黑素細胞的生長、形態(tài)、樹突形成和抗原表達。

黑素細胞與角質形成細胞直接接觸共培養(yǎng)分為單層細胞共培養(yǎng)和重建三位表皮結構的共培養(yǎng)，前者比較簡便，能為研究黑素細胞和角質形成細胞提供較理想的體外模型，因而被大多數學者所采用，但這種模型并不能形成類似于皮膚的細胞復層化結構，與皮膚正常生理結構存在一定的差距。后者能夠準確的模擬表皮黑素單元，為體外研究黑素細胞與角質形成細胞相互作用，色素的轉移與分布提供了良好的模型基礎。

目前含黑素重組人工皮膚存在的問題有基底層黑素細胞貼壁不牢，組織銀染切片顯示基底層黑素細胞缺失或黑素細胞量少，本應存在于基底層的黑素細胞漂移至角質層，導致重組出的人工皮膚與正常人皮膚黑素細胞存在位置不一致，雖然形成的重組人工皮膚有色素沉積的表觀顏色，但不能形成類似于正常人皮膚的表皮黑素單元，為研究黑素細胞與角質形成細胞之間相互作用及色素轉移等方面造成障礙。

cn03134539.5可調節(jié)色素分泌的組織工程皮膚及其構建方法、cn201510795792.0一種含黑色素的體外皮膚測試模型及其制備方法、美國專利us2009/0239254a1功能性色素沉積皮膚評價、日本專利jp2008029342(a)表皮黑素形成能力等同物的制備方法和用途，以及法國專利ep2103687b1功能性色素沉積皮膚替代物和韓國專利kr20130056956含黑素細胞的皮膚等同物的制備，以上專利均使用了黑素細胞和角質形成細胞共培養(yǎng)構建體外重組皮膚，但以上的培養(yǎng)基中均加入了血清，含血清有可能造成細胞污染，影響角質細胞生長，加速角質細胞分化，導致模型整體存活時限縮短。另一方面由于血清和成分不明的蛋白的存在，對細胞生物學、毒理學、病理學等基礎研究形成干擾。

cn201410045511.5含黑色素細胞的皮膚模型、其構建方法及用途專利中并未對所用到的黑素細胞與角質形成細胞共培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分做詳細介紹。

技術實現要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題在于針對上述現有技術的不足，提供一種用于黑素細胞與角質形成細胞共培養(yǎng)的培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基中含有的整合素α3β1和12-o-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯具有快速促進黑素細胞在基底膜上貼壁的作用，使黑素細胞固定存在于基底層，并與基底角質形成細胞以固定比例排列于基底層的特點。該培養(yǎng)基可使兩種細胞均迅速增殖，黑素細胞樹突多為3～5個，黑色素細胞在皮膚基底層內散在分布，細胞突起伸入到角質形成細胞之間，銀染法染色顯示黑素細胞內及重組皮膚切面有大量色素顆粒存在，黑素細胞增殖狀態(tài)良好。

為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案是：一種用于黑素細胞與角質形成細胞共培養(yǎng)用培養(yǎng)基，其特征在于，包括角質細胞無血清培養(yǎng)基，每500ml角質細胞無血清培養(yǎng)基中添加有2μg～10μg胰島素、10μg～500μg氫化可的松、10mg～100mg牛腦垂體提取物、20μg～1000μg上表皮生長因子、0.1μg～5μg堿性成纖維生長因子、5μg～10μg角質細胞生長因子和10ng～100ng12-o-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯，以及整合素α3β1，所述整合素α3β1的添加量為每1e6細胞添加20μl～50μl。

上述的一種黑素細胞與角質形成細胞共培養(yǎng)用培養(yǎng)基，其特征在于，每500ml角質細胞無血清培養(yǎng)基中添加有3μg～6μg胰島素、100μg～300μg氫化可的松、20mg～50mg牛腦垂體提取物、100μg～600μg上表皮生長因子、1μg～2μg堿性成纖維生長因子、6μg～8μg角質細胞生長因子和20ng～50ng12-o-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯，所述整合素α3β1的添加量為每1e6細胞添加25μl～35μl。

上述的一種黑素細胞與角質形成細胞共培養(yǎng)用培養(yǎng)基，其特征在于，每500ml角質細胞無血清培養(yǎng)基中添加有5μg胰島素、250μg氫化可的松、35mg牛腦垂體提取物、500μg上表皮生長因子、1.25μg堿性成纖維生長因子、7μg角質細胞生長因子和40ng12-o-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯，所述整合素α3β1的添加量為每1e6細胞添加30μl。

本發(fā)明與現有技術相比具有以下優(yōu)點：

1、本發(fā)明的培養(yǎng)基中含有的整合素α3β1和12-o-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯具有快速促進黑素細胞在基底膜上貼壁的作用，使黑素細胞固定存在于基底層，并與基底角質形成細胞以固定比例排列于基底層的特點。

2、本發(fā)明的培養(yǎng)基不含血清，排除了血清中眾多不明細胞因子，如抗原、抗體、激素等干擾，可提高藥物或因子對表皮細胞影響研究的準確度和精確性，為體外美白測試準確性提供基礎。

3、本發(fā)明的培養(yǎng)基可使兩種細胞均迅速增殖，黑素細胞樹突多為3～5個，黑色素細胞在皮膚基底層內散在分布，細胞突起伸入到角質形成細胞之間，銀染法染色顯示黑素細胞內及重組皮膚切面有大量色素顆粒存在，黑素細胞增殖狀態(tài)良好。

4、本發(fā)明的培養(yǎng)基不含維生素c，對于后期在黑素模型上進行美白評價的準確性具有重要意義。

5、本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)出的重組黑素模型體外存活15天，存活時間較長，可用于化妝品美白功效檢測。

下面結合附圖和實施例，對本發(fā)明的技術方案做進一步的詳細描述。

附圖說明

圖1為采用本發(fā)明實施例1的培養(yǎng)基培養(yǎng)制備的含色素的體外重組人體皮膚表皮模型經蘇木精-伊紅染色的透射電鏡圖。

圖2為對照組培養(yǎng)制備的含色素的體外重組人體皮膚表皮模型經蘇木精-伊紅染色的透射電鏡圖。

圖3為采用本發(fā)明實施例1的培養(yǎng)基培養(yǎng)制備的含色素的體外重組人體皮膚表皮模型經銀染法染色的透射電鏡圖。

圖4為對照組培養(yǎng)制備的含色素的體外重組人體皮膚表皮模型經銀染法染色的透射電鏡圖。

圖5為采用本發(fā)明實施例1的培養(yǎng)基培養(yǎng)制備的含色素的體外重組人體皮膚表皮模型與比色卡的表觀照片。

圖6為對照組培養(yǎng)制備的含色素的體外重組人體皮膚表皮模型與比色卡的表觀照片。

具體實施方式

實施例1

本實施例的黑素細胞與角質形成細胞共培養(yǎng)用培養(yǎng)基，用500ml角質無血清培養(yǎng)基k-sfm為基礎液，添加5μg胰島素、250μg氫化可的松、35mg牛腦垂體提取物、500μg上表皮生長因子、1.25μg堿性成纖維生長因子、7μg角質細胞生長因子和40ng12-o-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯，以及整合素α3β1，所述整合素α3β1的添加量為每1e6細胞添加30μl。

實施例2

本實施例的黑素細胞與角質形成細胞共培養(yǎng)用培養(yǎng)基，用500ml角質無血清培養(yǎng)基k-sfm為基礎液，添加10μg胰島素、500μg氫化可的松、100mg牛腦垂體提取物、1000μg上表皮生長因子、0.1μg堿性成纖維生長因子、5μg角質細胞生長因子和100ng12-o-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯，以及整合素α3β1，所述整合素α3β1的添加量為每1e6細胞添加50μl。

實施例3

本實施例的黑素細胞與角質形成細胞共培養(yǎng)用培養(yǎng)基，用500ml角質無血清培養(yǎng)基k-sfm為基礎液，添加3μg胰島素、300μg氫化可的松、20mg牛腦垂體提取物、100μg上表皮生長因子、2μg堿性成纖維生長因子、6μg角質細胞生長因子和50ng12-o-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯，以及整合素α3β1，所述整合素α3β1的添加量為每1e6細胞添加25μl。

實施例4

本實施例的黑素細胞與角質形成細胞共培養(yǎng)用培養(yǎng)基，用500ml角質無血清培養(yǎng)基k-sfm為基礎液，添加6μg胰島素、100μg氫化可的松、50mg牛腦垂體提取物、600μg上表皮生長因子、1μg堿性成纖維生長因子、8μg角質細胞生長因子和20ng12-o-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯，以及整合素α3β1，所述整合素α3β1的添加量為每1e6細胞添加35μl。

實施例5

本實施例的黑素細胞與角質形成細胞共培養(yǎng)用培養(yǎng)基，用500ml角質無血清培養(yǎng)基k-sfm為基礎液，添加2μg胰島素、10μg氫化可的松、10mg牛腦垂體提取物、20μg上表皮生長因子、5μg堿性成纖維生長因子、10μg角質細胞生長因子和10ng12-o-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯，以及整合素α3β1，所述整合素α3β1的添加量為每1e6細胞添加20μl。

采用本發(fā)明的培養(yǎng)基作為試驗組的液下培養(yǎng)基進行黑素細胞與角質形成細胞共培養(yǎng)，以常規(guī)培養(yǎng)基作為對照組的液下培養(yǎng)基進行黑素細胞與角質形成細胞共培養(yǎng)，所述常規(guī)培養(yǎng)基用角質無血清培養(yǎng)基k-sfm500ml為基礎液，再加入5μg胰島素，250μg氫化可的松，35mg牛腦垂體提取物，500μg上表皮生長因子，1.25μg堿性成纖維生長因子，7μg角質細胞生長因子；所用細胞的獲取方式如下：

1、原代黑色素細胞的獲取及傳代培養(yǎng)：黑素細胞可來源于包皮環(huán)切術的正常皮膚組織，其獲取及傳代詳見“構建含黑色素細胞組織工程皮膚的研究”,《中國修復重建外科雜志》,2003,17(6):501-503。

2、角質形成細胞的獲取及傳代培養(yǎng)：角質形成細胞可來源于包皮環(huán)切術的正常皮膚組織，其獲取及傳代詳見“人表皮干細胞的分離、純化培養(yǎng)及鑒定”,《中國實驗診斷學》,2009,13(2):143-145。

將體外培養(yǎng)的角質形成細胞和黑素細胞以液下培養(yǎng)基為溶液配置成細胞懸液，按黑素細胞與角質形成細胞1:5～1:10的比例混合，將混合的細胞懸液按2.0×105個/cm2的密度接種于生物重組材料支撐膜表面，生物重組材料支撐膜的制備參照專利cn201019018002.2完成，加入共培養(yǎng)培養(yǎng)基使液面淹沒支撐膜表面，培養(yǎng)2天，每天換液，形成皮膚雛形；再加入黑素細胞與角質形成細胞共培養(yǎng)的氣液面培養(yǎng)基進行氣液面培養(yǎng)皮膚雛形，培養(yǎng)13天，培養(yǎng)期間每天換液，最后一天收取皮膚模型完成含色素的體外重組人體皮膚表皮模型的制備；

對制備的含色素的體外重組人體皮膚表皮模型采用蘇木精-伊紅染色，透射電鏡和免疫組織化學分析法檢測制備的含色素的體外重組人體皮膚表皮模型的結構分層以及分化狀態(tài)，實驗結果見圖1和圖2。圖1為采用本發(fā)明實施例1的培養(yǎng)基培養(yǎng)制備的含色素的體外重組人體皮膚表皮模型，從圖1中可以看出，使用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)制備的含色素的體外重組人體皮膚表皮模型的結構完整，表皮各層分化明顯，具有顯著的基底細胞層、棘層細胞層、顆粒細胞層的區(qū)分，角質細胞層分化完全，細胞排列緊密，成緊湊的編花籃狀交叉分布，與天然皮膚結構類似；圖2為對照組培養(yǎng)制備的含色素的體外重組人體皮膚表皮模型，從圖2中可以看出，采用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)制備的含色素的體外重組人體皮膚表皮模型雖然也具有表皮復層化結構，但基底層可見有細胞缺失空泡。

對制備的含色素的體外重組人體皮膚表皮模型采用銀染法染色，透射電鏡和免疫組織化學分析法檢測制備的含色素的體外重組人體皮膚表皮模型的黑素分布狀態(tài)，實驗結果見圖3和圖4。圖3為采用本發(fā)明實施例1的培養(yǎng)基培養(yǎng)制備的含色素的體外重組人體皮膚表皮模型，從圖3中可以看出，使用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)制備的含色素的體外重組人體皮膚表皮模型的黑素細胞均勻緊密的排布在基底層，黑素小體在整個切面均勻分布，并在角質層分布較多。圖4為對照組培養(yǎng)制備的含色素的體外重組人體皮膚表皮模型，從圖4中可以看出，使用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)的含色素的體外重組人體皮膚表皮模型的黑素細胞基本在基底層沒有分布，并且基底層有細胞缺失空泡，黑素小體在角質層有分布。

使用比色卡對制備的含色素的體外重組人體皮膚表皮模型進行表觀拍照，拍照結果見圖5和圖6。圖5為采用本發(fā)明實施例1的培養(yǎng)基培養(yǎng)制備的含色素的體外重組人體皮膚表皮模型，從圖中可以看出，模型表面顏色均勻，表觀完整，肉眼觀察模型表面無明顯的黑素細胞聚集；圖6為對照組培養(yǎng)制備的含色素的體外重組人體皮膚表皮模型，從圖中可以看出，使用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)的黑素模型表面具有色素沉積，但黑素分布不均勻并且整體亮度高于圖5，存在色素分泌不足的現象。

綜上所述，制備的含色素的體外重組人體皮膚表皮模型通過2天的液下及13天的氣液面共15天的培養(yǎng)后觀察表皮he切片，結果顯示，表皮層分層結構層次清晰，銀染法染色顯示基底層黑素細胞與支撐材料膜結合緊密，黑色素細胞內及重組皮膚切面有大量色素顆粒存在，黑色素細胞增殖狀態(tài)良好，皮膚模型表面顏色黑褐色，可用于化妝品美白功效檢測。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明做任何限制，凡是根據發(fā)明技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、變更以及等效結構變化，均仍屬于本發(fā)明技術方案的保護范圍內。