本發(fā)明涉及一種血篩三項多色單管檢測試劑盒，具體涉及hbv、hcv、hiv病毒檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：乙型肝炎病毒簡稱乙肝病毒。是一種dna病毒，屬于嗜肝dna病毒科（hepadnaviridae），乙型肝炎病毒dna是乙肝病毒的脫氧核糖核酸，是乙肝病毒的的核心物質(zhì)和病毒復(fù)制的基礎(chǔ)。在病毒dna攜帶的遺傳基因，乙型肝炎病毒dna分別復(fù)制出新的病毒外殼和dna核心，形成大量的新病毒，釋放出來繼續(xù)感染其他肝細胞，引發(fā)乙型病毒性肝炎疾病。丙型肝炎由丙型肝炎病毒（hcv）感染所致，據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，全球有1.7億人感染hcv。在我國健康人群抗hcv陽性率為0.7%~3.1%，約3800萬人。由于病毒生物學特點和宿主免疫功能等多方面因素，機體免疫往往難以有效清除病毒，致使約50%~80%hcv感染者發(fā)展為慢性肝炎，其中20%~30%將發(fā)展成肝硬化。肝硬化患者中每年有1%~4%發(fā)展成為肝細胞癌癥。人類免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus;abbr:hiv），即艾滋病（aids，獲得性免疫缺陷綜合征）病毒，是造成人類免疫系統(tǒng)缺陷的一種病毒。hiv通過破壞人體的t淋巴細胞，進而阻斷細胞免疫和體液免疫過程，導致免疫系統(tǒng)癱瘓，從而致使各種疾病在人體內(nèi)蔓延，最終導致艾滋病。由于hiv的變異極其迅速，難以生產(chǎn)特異性疫苗，至今無有效治療方法，對人類健康造成極大威脅。這三種病毒都能經(jīng)過血液傳播，在血液需求量如此巨大的現(xiàn)代醫(yī)療中，血液安全是一項具有重大意義的指標。所以尋求一種快速、簡便、準確檢測血液安全性的方法對于臨床診治十分必要。目前，市面上的hbv、hcv、hiv病毒檢測試劑盒一般使用的是普通熒光探針，普通探針存在著檢測靈敏度低，特異性差等缺點，容易導致檢測出假陰性和假陽性結(jié)果。同時市面上已有的檢測試劑盒,普遍使用的各項目單獨檢測，并使用熱啟動酶反應(yīng)體系，啟動時間長，檢測過程耗費的時間非常長而且過程繁瑣。技術(shù)實現(xiàn)要素：為解決上述市面上普通hbv、hcv和hiv病毒檢測試劑盒檢測靈敏度低，特異性差以及檢測時間長、過程繁瑣等問題。本發(fā)明的目的在于提供一種血篩三項多色單管檢測試劑盒。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種血篩三項多色單管檢測試劑盒，包括快速擴增酶系統(tǒng)和血篩三項檢測的引物探針，所述血篩三項檢測的引物探針由針對hbv、hcv和hiv血篩三項設(shè)計的特異性引物及對應(yīng)的熒光探針組成，檢測hbv上游引物和下游引物的序列分別為seq1和seq4、探針序列為seq7，檢測hcv上游引物和下游引物的序列分別為seq10和seq13、探針序列為seq16,檢測hiv上游引物和下游引物的序列分別為seq19和seq22、探針序列為seq25,所述檢測hbv、hcv、hiv的探針，其5＇端均標記有熒光報告基團，其3＇端均標記有非熒光淬滅基團和mgb基團。進一步的，所述hbv、hcv、hiv的檢測探針，其5＇端標記的熒光報告基團選自下列基團：fam、vic、texasred、cy5、rox。進一步的，所述檢測hbv、hcv、hiv的探針，其5＇端各標記有一種熒光報告基團，其標記的熒光報告基團互不相同。進一步的，所述檢測hbv、hcv、hiv的探針，其3＇端連接的mgb基團數(shù)量均可為2~10。進一步的，所述需用到的總引物和探針的量比例為：上游引物：下游引物：探針為（8~10）：（8~10）：（3~5）。進一步的，所述快速擴增酶系統(tǒng)包括dntps（u）、ung酶、快速taq酶、逆轉(zhuǎn)錄酶。進一步的，所述dntps（u）中各種成分比例為：datp：dttp：dctp:dgtp：dutp=10：（1~3）：10：10：10。進一步的，所述ung酶、快速taq酶、逆轉(zhuǎn)錄酶的用量分別為0.3u~1u、1u~5u、1u~5u。進一步的，僅需在單個pcr反應(yīng)管內(nèi)即可同時檢測是否存在病毒hbv、hcv、hiv。優(yōu)選的，所述需用到的總引物和探針的比例為：上游引物：下游引物：探針為8：8：3。優(yōu)選的，所述dntps（u）中各種成分比例為：datp：dttp：dctp:dgtp：dutp=10：1：10：10：10。優(yōu)選的，所述ung酶、快速taq酶、逆轉(zhuǎn)錄酶的用量分別為0.5u、3u、3u。優(yōu)選的，上述血篩三項多色單管檢測試劑盒中使用的引物和探針的序列如下：其中，x代表熒光報告基團，eclipse代表非熒光淬滅基團，zip代表mgb基團。本發(fā)明的有益效果是：1）本發(fā)明的檢測方法能夠在單管反應(yīng)中同時完成hbv、hcv、hiv三個項目的檢測。2)本發(fā)明中mgb探針的淬滅基團采用非熒光淬滅基團(non-fluorescentquencher),本身不產(chǎn)生熒光,可以大大降低本底信號的強度，同時探針上還連接有mgb(minorgroovebinder)修飾基團,可以將探針的tm值提高10°c左右.因此為了獲得同樣的tm值,mgb探針可以比普通taqman探針設(shè)計得更短,既降低了合成成本,也使得探針設(shè)計的成功率大為提高，因為在模板的dna堿基組成不理想的情況下,短的探針比長的更容易設(shè)計，這更好的提高了檢測的靈敏度。3)當mgb探針和模板全部特異性結(jié)合時，反應(yīng)能夠順利進行，原則上mgb探針與模板之間只要有一個堿基錯配，mgb探針就會檢測到(mgb探針將不會與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號)，大大提高了檢測的特異性。4)本發(fā)明的檢測方法中使用快速taq酶，快速taq酶啟動反應(yīng)的時間只需5分鐘，比普通熱啟動酶快了3倍，同時快速taq酶延伸的效率非常高，只需15秒就能完成相當于普通taq酶1min的工作量?？焖賢aq酶系統(tǒng)的應(yīng)用，使整個反應(yīng)的時間由普通反應(yīng)體系的2小時30分鐘縮短到30分鐘。附圖說明圖1是本發(fā)明使用單管多色pcr檢測試劑盒同時存在hbv、hcv、hiv病毒感染結(jié)果示意圖；圖2是本發(fā)明使用的mgb探針的工作原理圖；圖3是本發(fā)明檢測過程出現(xiàn)熒光信號增長情況的示意圖；圖4是本發(fā)明檢測過程不出現(xiàn)熒光信號增長情況的示意圖；圖5是本發(fā)明檢測hbv假病毒mgb探針系統(tǒng)與普通探針系統(tǒng)的pcr擴增反應(yīng)結(jié)果比較圖；圖6是本發(fā)明檢測hcv假病毒mgb探針系統(tǒng)與普通探針系統(tǒng)的pcr擴增反應(yīng)結(jié)果比較圖；圖7是本發(fā)明檢測hiv假病毒mgb探針系統(tǒng)與普通探針系統(tǒng)的pcr擴增反應(yīng)結(jié)果比較圖；圖8是本發(fā)明使用快速taq酶的pcr反應(yīng)結(jié)果圖；圖9是本發(fā)明使用普通熱啟動酶的pcr反應(yīng)結(jié)果圖；圖10是本發(fā)明使用單管多色pcr檢測試劑盒同時存在hbv、hcv、hiv病毒感染結(jié)果示意圖。具體實施方式實施例1：一種血篩三項多色單管檢測試劑盒的操作步驟1)核酸樣本提?。号涮讖V州和實生物核酸提取試劑（磁珠法）提取試劑使用，嚴格按照說明書操作，進行核酸自動化提取。2）陽性質(zhì)控品的準備：分別構(gòu)建含有hiv、hbv和hcv特異性擴增片段的假病毒作為陽性質(zhì)控品，構(gòu)建方法參考文獻《耐核糖核酸酶內(nèi)含長片段嵌合體rna的病毒樣顆粒的構(gòu)建和表達(2008)》進行；hiv、hbv和hcv三種病毒的陰性質(zhì)控品均為h2o。3)配制pcr反應(yīng)體系：把3u的快速taq酶，3u逆轉(zhuǎn)錄酶，12mmtris-hcl，45mmkcl，0.5u的ung酶，0.25mmdntps（u），2.5mmmgcl2，seq1、seq4、seq10、seq13、seq19、seq22各10pm，seq7、seq16、seq25各3pm混合，其中seq7、seq16、seq25為mgb探針。4）加樣：把樣本核酸、三種病毒混合的陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品分別加入3管裝有pcr反應(yīng)體系的pcr反應(yīng)管中，獲得對應(yīng)的樣品反應(yīng)管、陽性反應(yīng)管、陰性反應(yīng)管。5）pcr反應(yīng)：依次分別把上述樣品反應(yīng)管、陽性反應(yīng)管、陰性反應(yīng)管放在熒光pcr儀上進行pcr反應(yīng)，反應(yīng)條件設(shè)置為：①50℃15min；②95℃5min；③95℃5sec；④58℃15sec；步驟③-④循環(huán)45次。6）結(jié)果分析：監(jiān)測反應(yīng)體系的熒光變化，確定是否存在hbv、hcv和hiv病毒感染。若對應(yīng)熒光通道出現(xiàn)信號增長，如附圖3所示，則存在相對應(yīng)的病毒感染。如圖1所示為同時存在hbv、hcv、hiv病毒感染。一種血篩三項多色單管檢測試劑盒的主成分如下：①提取試劑為廣州和實生物核酸提取試劑（磁珠法），其含有裂解液、磁珠、洗滌液1、洗滌液2、洗脫液、蛋白酶k，能自動化提取病毒核酸；②快速酶系統(tǒng)包括：3u的快速taq酶，0.5ul的dntps（u）（25mm），0.5ung酶，3u逆轉(zhuǎn)錄酶；③特異性的引物和探針序列如下：引物探針序列(5’→3’)修飾內(nèi)容hbv上引seq1tgaggcatacttcaaagact普通引物hbv下引seq4gcttggaggcttgaacagta普通引物hbv探針seq7atgattaggcagaggtgaa5'x,3'eclipse+5ziphcv上引seq10ggaaccggtgagtacaccgga普通引物hcv下引seq13tcgcaagcaccctatcaggca普通引物hcv探針seq16tgccaggacgtaccgggtcctttctt5'x,3'eclipse+5ziphiv上引seq19caaatggcagtattcattcaca普通引物hiv下引seq22ctgtccctgtaataaacccga普通引物hiv探針seq25tttaaaagaaaaggggggattg5'x,3'eclipse+5zip優(yōu)選的，所述需用到的總引物和探針的用量比例為：上游引物：下游引物：探針為8：8：3。優(yōu)選的，所述dntps（u）中各種成分比例為：datp：dttp：dctp:dgtp：dutp=10：1：10：10：10。實施例2：本發(fā)明中三種病毒特異性引物探針序列篩選過程1)核酸樣本提?。号涮讖V州和實生物核酸提取試劑（磁珠法）提取試劑使用，嚴格按照說明書操作，進行核酸自動化提取。2）陽性質(zhì)控品的準備：分別構(gòu)建含有hiv、hbv和hcv特異性擴增片段的假病毒作為陽性質(zhì)控品，構(gòu)建方法參考文獻《耐核糖核酸酶內(nèi)含長片段嵌合體rna的病毒樣顆粒的構(gòu)建和表達(2008)》進行；hiv、hbv和hcv三種病毒的陰性質(zhì)控品均為h2o。3）配制pcr反應(yīng)體系：把3u的快速taq酶，3u逆轉(zhuǎn)錄酶，12mmtris-hcl，45mmkcl，0.5u的ung酶，0.25mmdntps（u），2.5mmmgcl2，配套引物各10pm，配套探針各3pm混合，其中配套探針為mgb探針，設(shè)計出的引物探針序列如下：4）加樣：把樣本核酸、三種病毒混合的陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品分別加入3管裝有pcr反應(yīng)體系的pcr反應(yīng)管中，獲得對應(yīng)的樣品反應(yīng)管、陽性反應(yīng)管、陰性反應(yīng)管。5）pcr反應(yīng)：依次分別把上述樣品反應(yīng)管、陽性反應(yīng)管、陰性反應(yīng)管放在熒光pcr儀上進行pcr反應(yīng)，反應(yīng)條件設(shè)置為：①50℃15min；②95℃5min；③95℃5sec；④58℃15sec；步驟③-④循環(huán)45次。6）結(jié)果分析：監(jiān)測反應(yīng)體系的熒光變化，比較熒光信號增長情況,同一批陽性樣本的檢測，能檢出最低樣品濃度的那一組引物探針的靈敏度最高，同一批陰性樣本檢測，都不產(chǎn)生熒光信號增長（如附圖4所示）的那一組引物探針特異性最強。從而篩選出靈敏度和特異性最高的引物探針組合用于后續(xù)發(fā)明。篩選出靈的敏度和特異性最高的引物探針序列組合如下：引物探針序列(5’→3’)修飾內(nèi)容hbv上引seq1tgaggcatacttcaaagact普通引物hbv下引seq4gcttggaggcttgaacagta普通引物hbv探針seq7atgattaggcagaggtgaa5'x,3'eclipse+5ziphcv上引seq10ggaaccggtgagtacaccgga普通引物hcv下引seq13tcgcaagcaccctatcaggca普通引物hcv探針seq16tgccaggacgtaccgggtcctttctt5'x,3'eclipse+5ziphiv上引seq19caaatggcagtattcattcaca普通引物hiv下引seq22ctgtccctgtaataaacccga普通引物hiv探針seq25tttaaaagaaaaggggggattg5'x,3'eclipse+5zip實施例3：本發(fā)明使用的mgb探針系統(tǒng)和普通探針系統(tǒng)檢測的靈敏度比較。1）陽性質(zhì)控品的準備：分別構(gòu)建含有hiv、hbv和hcv特異性擴增片段的假病毒作為陽性質(zhì)控品，構(gòu)建方法參考文獻《耐核糖核酸酶內(nèi)含長片段嵌合體rna的病毒樣顆粒的構(gòu)建和表達(2008)》進行，所構(gòu)建的假病毒的核酸序列經(jīng)過sanger法測序驗證，可以被前述的3種引物和探針識別；hiv、hbv和hcv三種病毒的陰性質(zhì)控品均為h2o；取上述構(gòu)建好的3種假病毒分別進行濃度校準至混合液中含有每種假病毒的濃度均為1×105iu/ml，分為3份，分別按1：10、1：100、1：1000、的比例用h2o做梯度稀釋，最終獲得待檢陽性對照樣品vb1、vb2、vb3、vc1、vc2、vc3、vi1、vi2、vi3，三種病毒濃度梯度均分別為1×104iu/ml、1×103iu/ml、1×102iu/ml。2）配制pcr反應(yīng)體系：①mgb探針系統(tǒng)把3u的快速taq酶，3u逆轉(zhuǎn)錄酶，12mmtris-hcl，45mmkcl，0.5u的ung酶，0.25mmdntps（u），2.5mmmgcl2，seq1、seq4、seq10、seq13、seq19、seq22各10pm，seq7、seq16、seq25各3pm混合，其中seq7、seq16、seq25為mgb探針；②普通探針系統(tǒng)把3u的快速taq酶，3u逆轉(zhuǎn)錄酶，12mmtris-hcl，45mmkcl，0.5u的ung酶，0.25mmdntps（u），2.5mmmgcl2，seq1、seq4、seq10、seq13、seq19、seq22各10pm，seq7、seq16、seq25各3pm混合，其中seq7、seq16、seq25為普通taqman探針。3）加樣：①mgb探針系統(tǒng)把hbv假病毒稀釋的3個濃度的病毒溶液放進3管含有mgb探針的pcr反應(yīng)液中；把hcv假病毒稀釋的3個濃度的病毒溶液放進另外3管含有mgb探針的pcr反應(yīng)液中；把hiv假病毒稀釋的3個濃度的病毒溶液放進另外3管含有mgb探針的pcr反應(yīng)液中；另在1管含有mgb探針的pcr反應(yīng)液中加入5μlh2o作為陰性對照；②普通探針系統(tǒng)把hbv假病毒稀釋的3個濃度的病毒溶液放進3管含有普通taqman探針的pcr反應(yīng)液中；把hcv假病毒稀釋的3個濃度的病毒溶液放進另外3管含有普通taqman探針的pcr反應(yīng)液中；把hiv假病毒稀釋的3個濃度的病毒溶液放進另外3管含有普通taqman探針的pcr反應(yīng)液中；另在1管含有mgb探針的pcr反應(yīng)液中加入5μlh2o作為陰性對照。4）pcr反應(yīng)：依次分別把上述pcr反應(yīng)管放在熒光pcr儀上進行pcr反應(yīng)，反應(yīng)條件設(shè)置為：①50℃15min；②95℃5min；③95℃5sec；④58℃15sec；步驟③-④循環(huán)45次。5）結(jié)果分析：監(jiān)測反應(yīng)體系的熒光變化，本次實驗的熒光擴增曲線分別如圖5、圖6和圖7所示，①圖5為hbv假病毒mgb探針系統(tǒng)與普通探針系統(tǒng)的pcr擴增反應(yīng)結(jié)果比較圖，在mgb探針系統(tǒng)中，不同濃度的待檢陽性對照樣品vb1與vb2在熒光檢測過程中均為陽性，vb3在熒光檢測過程中為陰性，表明在樣品濃度1×102iu/ml～1×104iu/ml范圍內(nèi)，mgb探針系統(tǒng)最低檢出限為1×103iu/ml；在普通探針系統(tǒng)中，待檢陽性對照樣品vb1在熒光檢測過程中為陽性，vb3與vb2在熒光檢測過程中呈陰性，表明在樣品濃度1×102iu/ml～1×104范圍內(nèi)，普通探針系統(tǒng)最低檢出限為1×104iu/ml；②圖6為hcv假病毒mgb探針系統(tǒng)與普通探針系統(tǒng)的pcr擴增反應(yīng)結(jié)果比較圖，在mgb探針系統(tǒng)中，不同濃度的待檢陽性對照樣品vc1與vc2在熒光檢測過程中均為陽性，vc3在熒光檢測過程中為陰性，表明在樣品濃度1×102iu/ml～1×104iu/ml范圍內(nèi)，mgb探針系統(tǒng)最低檢出限為1×103iu/ml；在普通探針系統(tǒng)中，待檢陽性對照樣品vc1在熒光檢測過程中為陽性，vc3與vc2在熒光檢測過程中均呈陰性，表明在樣品濃度1×102iu/ml～1×104iu/ml范圍內(nèi)，普通探針系統(tǒng)最低檢出限為1×104iu/ml；③圖7為hiv假病毒mgb探針系統(tǒng)與普通探針系統(tǒng)的pcr擴增反應(yīng)結(jié)果比較圖，在mgb探針系統(tǒng)中，不同濃度的待檢陽性對照樣品vi1與vi2在熒光檢測過程中均為陽性，vi3在熒光檢測過程中為陰性，表明在樣品濃度1×102iu/ml～1×104iu/ml范圍內(nèi)，mgb探針系統(tǒng)最低檢出限為1×103iu/ml；在普通探針系統(tǒng)中，待檢陽性對照樣品vi1在熒光檢測過程中為陽性，vi3與vi2在熒光檢測過程中均呈陰性，表明在樣品濃度1×102iu/ml～1×104iu/ml范圍內(nèi)，普通探針系統(tǒng)最低檢出限為1×104iu/ml；綜上所述，檢測靈敏度的標準為：熒光探針能檢測出的樣品濃度越低，則其檢測的靈敏度越高。而使用mgb探針系統(tǒng)進行hbv、hcv、hiv病毒的檢測比使用普通探針系統(tǒng)能檢出的最低濃度更低，因此使用mgb探針比使用普通探針靈敏度更高。實施例4：本發(fā)明使用的快速taq酶和普通熱啟動酶檢測的反應(yīng)時間比較1)核酸樣本提取：配套廣州和實生物核酸提取試劑（磁珠法）提取試劑使用，嚴格按照說明書操作，進行核酸自動化提取。2）陽性質(zhì)控品的準備：構(gòu)建含有hiv特異性擴增片段的假病毒作為陽性質(zhì)控品，構(gòu)建方法參考文獻《耐核糖核酸酶內(nèi)含長片段嵌合體rna的病毒樣顆粒的構(gòu)建和表達(2008)》進行；陰性質(zhì)控品為h2o。3）配制pcr反應(yīng)體系：①使用快速taq酶：把3u的快速taq酶，3u逆轉(zhuǎn)錄酶，12mmtris-hcl，45mmkcl，0.5u的ung酶，0.25mmdntps（u），2.5mmmgcl2，seq19、seq22各10pm，seq253pm混合，其中seq25為mgb探針。②使用普通熱啟動酶：把3u的普通熱啟動酶，3u逆轉(zhuǎn)錄酶，12mmtris-hcl，45mmkcl，0.5u的ung酶，0.25mmdntps（u），2.5mmmgcl2，seq19、seq22各10pm，seq253pm混合，其中seq25為mgb探針。4）加樣：①使用快速taq酶：把5μl樣本核酸、hiv病毒的陽性質(zhì)控品各5μl、5μl陰性質(zhì)控品分別加入3管裝有快速taq酶的pcr反應(yīng)體系的pcr反應(yīng)管中，獲得對應(yīng)的樣品反應(yīng)管1、陽性反應(yīng)管1、陰性反應(yīng)管1；②使用普通熱啟動酶：把5μl樣本核酸、hiv病毒的陽性質(zhì)控品各5μl、5μl陰性質(zhì)控品分別加入3管裝有普通熱啟動酶的pcr反應(yīng)體系的pcr反應(yīng)管中，獲得對應(yīng)的樣品反應(yīng)管2、陽性反應(yīng)管2、陰性反應(yīng)管2。5）pcr反應(yīng)：①使用快速taq酶：依次分別把上述樣品反應(yīng)管1、陽性反應(yīng)管1、陰性反應(yīng)管1放在熒光pcr儀上進行pcr反應(yīng)，反應(yīng)條件設(shè)置為：①50℃15min；②95℃5min；③95℃5sec；④58℃15sec；步驟③-④循環(huán)45次；②使用普通熱啟動酶：依次分別把上述樣品反應(yīng)管2、陽性反應(yīng)管2、陰性反應(yīng)管2放在熒光pcr儀上進行pcr反應(yīng)，反應(yīng)條件設(shè)置為：①50℃15min；②95℃15min；③95℃5sec；④58℃60sec；步驟③-④循環(huán)45次。6）結(jié)果分析：監(jiān)測反應(yīng)體系的熒光變化，檢測結(jié)果如圖8和圖9所示，圖8為使用快速taq酶的pcr反應(yīng)結(jié)果圖，圖9為使用普通熱啟動酶的pcr反應(yīng)結(jié)果圖，在pcr反應(yīng)這一步驟中，使用快速taq酶的反應(yīng)時間設(shè)置比普通熱啟動酶短得多，可是同時檢測hiv病毒的結(jié)果是快速taq酶與普通熱啟動酶在熒光檢測過程中均為陽性，快速taq酶檢測出hiv病毒對應(yīng)的ct值卻比普通熱啟動酶檢測出hiv病毒對應(yīng)的ct值快了2個ct值。因此，使用快速taq酶比使用普通熱啟動酶反應(yīng)時間短了許多并且檢測效果更優(yōu)。實施例5：本發(fā)明各組分含量有效性驗證1)核酸樣本提取：配套廣州和實生物核酸提取試劑（磁珠法）提取試劑使用，嚴格按照說明書操作，進行核酸自動化提取。2）陽性質(zhì)控品的準備：分別構(gòu)建含有hiv、hbv和hcv特異性擴增片段的假病毒作為陽性質(zhì)控品，構(gòu)建方法參考文獻《耐核糖核酸酶內(nèi)含長片段嵌合體rna的病毒樣顆粒的構(gòu)建和表達(2008)》進行；hiv、hbv和hcv三種病毒的陰性質(zhì)控品均為h2o。3)配制pcr反應(yīng)體系：把1u的快速taq酶，1u逆轉(zhuǎn)錄酶，12mmtris-hcl，45mmkcl，0.3u的ung酶，0.25mmdntps（u），2.5mmmgcl2，seq1、seq4、seq10、seq13、seq19、seq22各8pm，seq7、seq16、seq25各3pm混合，其中seq7、seq16、seq25為mgb探針，dntps（u）中各種成分比例為：datp：dttp：dctp:dgtp：dutp=10：1：10：10：10，上游引物：下游引物：探針用量比例為8：8：3，檢測hbv、hcv、hiv的探針，其3＇端連接的mgb基團數(shù)量均為2。4）加樣：把樣本核酸、三種病毒混合的陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品分別加入3管裝有pcr反應(yīng)體系的pcr反應(yīng)管中，獲得對應(yīng)的樣品反應(yīng)管、陽性反應(yīng)管、陰性反應(yīng)管。5）pcr反應(yīng)：依次分別把上述樣品反應(yīng)管、陽性反應(yīng)管、陰性反應(yīng)管放在熒光pcr儀上進行pcr反應(yīng)，反應(yīng)條件設(shè)置為：①50℃15min；②95℃5min；③95℃5sec；④58℃15sec；步驟③-④循環(huán)45次。6）結(jié)果分析：監(jiān)測反應(yīng)體系的熒光變化，如圖10所示，能同時檢測出hbv、hcv和hiv病毒感染，表明上述組分含量有效。以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關(guān)的
技術(shù)領(lǐng)域：
，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。sequencelisting<110>廣州和實生物技術(shù)有限公司<120>一種血篩三項多色單管檢測試劑盒<130>2017<160>27<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1tgaggcatacttcaaagact20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2gaacctctatgtttccctct20<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列<400>3actgcacttgtattcccat19<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4gcttggaggcttgaacagta20<210>5<211>19<212>dna<213>人工序列<400>5gccctacgaaccactgaac19<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6ccctacgaaccactgaacaa20<210>7<211>19<212>dna<213>人工序列<400>7atgattaggcagaggtgaa19<210>8<211>22<212>dna<213>人工序列<400>8ttgctgtacaaaaccttcggac22<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列<400>9catcatcctgggctttcgcaa21<210>10<211>21<212>dna<213>人工序列<400>10ggaaccggtgagtacaccgga21<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<400>11accgggtcctttcttggatc20<210>12<211>19<212>dna<213>人工序列<400>12ctttcttggatcaacccgc19<210>13<211>21<212>dna<213>人工序列<400>13tcgcaagcaccctatcaggca21<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列<400>14gcaagcaccctatcaggcag20<210>15<211>22<212>dna<213>人工序列<400>15ctcgcaagcaccctatcaggca22<210>16<211>26<212>dna<213>人工序列<400>16tgccaggacgtaccgggtcctttctt26<210>17<211>21<212>dna<213>人工序列<400>17cccgctcaatgcctggagatt21<210>18<211>23<212>dna<213>人工序列<400>18atgcctggagatttgggcgtgcc23<210>19<211>22<212>dna<213>人工序列<400>19caaatggcagtattcattcaca22<210>20<211>20<212>dna<213>人工序列<400>20taagacagcagtacagatgg20<210>21<211>20<212>dna<213>人工序列<400>21gaaaatcataggacaggtaa20<210>22<211>21<212>dna<213>人工序列<400>22ctgtccctgtaataaacccga21<210>23<211>20<212>dna<213>人工序列<400>23tgctattatgtctattattc20<210>24<211>21<212>dna<213>人工序列<400>24attctttagtttgtatgtctg21<210>25<211>22<212>dna<213>人工序列<400>25tttaaaagaaaaggggggattg22<210>26<211>20<212>dna<213>人工序列<400>26cattcacaattttaaaagaa20<210>27<211>21<212>dna<213>人工序列<400>27caggctgaacatcttaagaca21當前第1頁12