本發(fā)明涉及免疫學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測受體正確表達(dá)的方法，尤其涉及一種檢測嵌合抗原受體或基因修飾的t細(xì)胞受體表達(dá)的方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腫瘤的免疫療法分為兩大類：一種是解除腫瘤對免疫的耐受或屏蔽作用，讓免疫細(xì)胞重新“認(rèn)識”腫瘤細(xì)胞，然后對腫瘤發(fā)起攻擊，例如pd-1抗體、pd-l1抗體、ctla-4抗體等；另一種是把腫瘤的特征“告訴”免疫細(xì)胞，隨后免疫細(xì)胞進(jìn)行搜索定位，殺傷腫瘤，例如嵌合抗原受體的t細(xì)胞(car-t)、t細(xì)胞受體基因修飾的t細(xì)胞(tcr-t)、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(til)、腫瘤抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(dc-ctl)等。其中，嵌合抗原受體的t細(xì)胞(car-t)和t細(xì)胞受體基因修飾的t細(xì)胞(tcr-t)是當(dāng)今過繼性細(xì)胞治療(act)療法中的兩大最新技術(shù)，發(fā)展非常迅速，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了從基礎(chǔ)免疫學(xué)機(jī)制研究到臨床免疫治療應(yīng)用的轉(zhuǎn)換。上述兩種技術(shù)的共同點(diǎn)是通過基因改造的手段提高t細(xì)胞對特異性癌細(xì)胞抗原的識別和進(jìn)攻能力，因此統(tǒng)稱為“t細(xì)胞受體重新定向”技術(shù)(tcellreceptorredirection)。t細(xì)胞通過與腫瘤細(xì)胞的接觸識別殺傷腫瘤細(xì)胞，因此嵌合抗原受體(car)和t細(xì)胞受體(tcr)基因在t細(xì)胞表面的正確表達(dá)無疑具有重要的位置。目前，對car或tcr是否表達(dá)的方法主要有兩種：一種是用pcr檢測car或tcr序列中的特異性基因，另一種是用流式細(xì)胞術(shù)檢測car或tcr結(jié)構(gòu)中的特定片段(如fab片段等)。cn106119411a公開了一種car-t細(xì)胞病毒感染效率的檢測方法，包括如下步驟：將病毒侵染car-t細(xì)胞；待細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，抽提car-t細(xì)胞的全基因組dna；運(yùn)用熒光定量pcr技術(shù)檢測整合到全基因組dna中的病毒拷貝數(shù)；數(shù)據(jù)處理：按poisson分布規(guī)律，計(jì)算該病毒的感染效率；其中感染效率公式：p(k)＝1-p(0)；其中，p(0)＝e-m；e為自然常數(shù)；m為moi值，即感染復(fù)數(shù)。該方法雖然能計(jì)算病毒感染的效率，但上述兩種方法都不能證明已經(jīng)表達(dá)的car或tcr能否與相應(yīng)的腫瘤抗原特異性結(jié)合，對于腫瘤的實(shí)際殺傷效力并不能準(zhǔn)確預(yù)測。因此，如何準(zhǔn)確檢測嵌合抗原受體或基因修飾的t細(xì)胞受體的表達(dá)就顯得尤為重要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種檢測嵌合抗原受體或基因修飾的t細(xì)胞受體表達(dá)的方法和應(yīng)用，不但能判定car或tcr是否正確表達(dá)，還能證明已表達(dá)的car或tcr能否與相應(yīng)的腫瘤抗原特異性結(jié)合。為達(dá)此目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：第一方面，本發(fā)明提供了一種檢測car或tcr表達(dá)的方法，包括以下步驟：(1)將包裝好的car或tcr慢病毒侵染貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞，獲得表達(dá)car或tcr的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞；(2)將貼壁細(xì)胞鋪板，待貼壁細(xì)胞的融合度達(dá)到70-90％時(shí)，加入懸浮細(xì)胞；(3)繼續(xù)培養(yǎng)并收集上清，對懸浮在上清中的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并觀察懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞結(jié)合現(xiàn)象；當(dāng)car或tcr靶向的腫瘤抗原表達(dá)于懸浮細(xì)胞時(shí)，步驟(2)所述貼壁細(xì)胞為步驟(1)所述的表達(dá)car或tcr的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的貼壁細(xì)胞，所述懸浮細(xì)胞為car或tcr靶向的腫瘤抗原表達(dá)的懸浮細(xì)胞；當(dāng)car或tcr靶向的腫瘤抗原表達(dá)于貼壁細(xì)胞時(shí)，步驟(2)所述貼壁細(xì)胞為car或tcr靶向的腫瘤抗原表達(dá)的貼壁細(xì)胞，所述懸浮細(xì)胞為步驟(1)所述的表達(dá)car或tcr的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的懸浮細(xì)胞。具體來講，上述方法包括兩種情況：(1)car或tcr靶向的腫瘤抗原表達(dá)于懸浮細(xì)胞：將包裝好的car或tcr慢病毒侵染貼壁細(xì)胞，獲得表達(dá)car或tcr的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞；然后將穩(wěn)轉(zhuǎn)株鋪板，待貼壁細(xì)胞的融合度達(dá)到70-90％時(shí)，加入car或tcr靶向的腫瘤抗原表達(dá)的懸浮細(xì)胞；繼續(xù)培養(yǎng)并收集上清，對懸浮在上清中的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并觀察懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞結(jié)合現(xiàn)象。所述貼壁細(xì)胞為293t細(xì)胞，由于所述293t細(xì)胞侵染效率高，容易獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)株，所述貼壁細(xì)胞株為293t-car或293t-tcr。如果所設(shè)計(jì)的car或tcr能夠正確表達(dá)在293t細(xì)胞的膜上，形成正確的構(gòu)象，那么它就會(huì)與相應(yīng)的腫瘤抗原或者mhc-多肽復(fù)合物結(jié)合，將兩細(xì)胞固定在一起；最終表現(xiàn)為培養(yǎng)基中的懸浮細(xì)胞減少，通過顯微鏡觀察可以看到這些細(xì)胞粘附在貼壁細(xì)胞上。(2)car或tcr靶向的腫瘤抗原表達(dá)于貼壁細(xì)胞：將包裝好的car或tcr慢病毒侵染懸浮細(xì)胞，獲得表達(dá)car或tcr的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞；然后將car或tcr靶向的腫瘤抗原表達(dá)的貼壁細(xì)胞鋪板，待貼壁細(xì)胞的融合度達(dá)到70-90％時(shí)，加入穩(wěn)定表達(dá)car或tcr的懸浮細(xì)胞；繼續(xù)培養(yǎng)并收集上清，對懸浮在上清中的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并觀察懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞結(jié)合現(xiàn)象。所述貼壁細(xì)胞為sup-t1細(xì)胞，由于所述sup-t1細(xì)胞侵染效率高，容易獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)株，而且其不表達(dá)內(nèi)源性tcr，所述懸浮細(xì)胞株為sup-t1-car或sup-t1-tcr。如果所設(shè)計(jì)的car或tcr能夠正確表達(dá)在懸浮細(xì)胞的膜上，形成正確的構(gòu)象，那么它就會(huì)與相應(yīng)的腫瘤抗原或者mhc-多肽復(fù)合物結(jié)合，將兩細(xì)胞固定在一起；最終表現(xiàn)為培養(yǎng)基中的懸浮細(xì)胞減少，通過顯微鏡觀察可以看到這些細(xì)胞粘附在貼壁細(xì)胞上。本發(fā)明中，所述car為嵌合抗原受體，所述tcr為基因修飾的t細(xì)胞受體。在本發(fā)明中，貼壁細(xì)胞融合度達(dá)到70-90％時(shí)，即可以滿足所加入的懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞有比較大的接觸幾率，若融合度小于70％則接觸幾率過低；但若融合度大于90％，貼壁細(xì)胞在加入懸浮細(xì)胞后的共培養(yǎng)過程中，因貼壁細(xì)胞繼續(xù)增殖導(dǎo)致融合度過大而脫落，影響上清液中細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，所述穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的293t細(xì)胞的融合度為75-85％，例如可以是75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％或85％，優(yōu)選為80％。優(yōu)選地，步驟(2)所述鋪板為將貼壁細(xì)胞鋪于酶標(biāo)板中，加培養(yǎng)基培養(yǎng)；優(yōu)選地，所述酶標(biāo)板為6孔酶標(biāo)板、12孔酶標(biāo)板或24孔酶標(biāo)板中的任意一種或至少兩種的組合，例如可以是6孔酶標(biāo)板、12孔酶標(biāo)板、6孔酶標(biāo)板和12孔酶標(biāo)板的組合或6孔酶標(biāo)板、12孔酶標(biāo)板和24孔酶標(biāo)板的組合，優(yōu)選為6孔酶標(biāo)板；優(yōu)選地，所述酶標(biāo)板中貼壁細(xì)胞的數(shù)量為(3-8)×105個(gè)/孔，例如可以是3×105個(gè)/孔、4×105個(gè)/孔、5×105個(gè)/孔、6×105個(gè)/孔、7×105個(gè)/孔或8×105個(gè)/孔，優(yōu)選為5×105個(gè)/孔；所述培養(yǎng)基為dmem培養(yǎng)基與胎牛血清的混合溶液；優(yōu)選地，所述胎牛血清的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5-15％，例如可以是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％，優(yōu)選為8-12％，進(jìn)一步優(yōu)選為10％。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)的條件為co2濃度為3-10％，例如可以是3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％，優(yōu)選為5-7％。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)的溫度為30-42℃，例如可以是30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃或42℃，優(yōu)選為35-40℃，進(jìn)一步優(yōu)選為37℃。優(yōu)選地，步驟(2)所述懸浮細(xì)胞的加入量為(0.5-3)×106個(gè)/孔，例如可以是0.5×106個(gè)/孔、1×106個(gè)/孔、1.5×106個(gè)/孔、2×106個(gè)/孔、2.5×106個(gè)/孔或3×106個(gè)/孔，優(yōu)選為1×106個(gè)/孔。優(yōu)選地，步驟(3)所述培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為1640培養(yǎng)基與胎牛血清的混合溶液；優(yōu)選地，所述胎牛血清的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5-15％，例如可以是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％，優(yōu)選為8-12％，進(jìn)一步優(yōu)選為10％；優(yōu)選地，步驟(3)所述繼續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間為6-7h，例如可以是6.1h、6.2h、6.3h、6.4h、6.5h、6.6h、6.7h、6.8h、6.9h或7h，優(yōu)選為6h。優(yōu)選地，步驟(3)所述計(jì)數(shù)為用血球計(jì)數(shù)板和/或自動(dòng)計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)。作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述方法包括如下步驟：(1)用包裝好的car或tcr的慢病毒侵染貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞，獲得表達(dá)car或tcr的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞；(2)將貼壁細(xì)胞在六孔酶標(biāo)板上進(jìn)行鋪板，數(shù)量為(3-8)×105個(gè)/孔，加入dmem培養(yǎng)基與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5-15％胎牛血清，在co2濃度3-10％、溫度30-42℃條件下培養(yǎng)；當(dāng)貼壁細(xì)胞的融合度達(dá)到70-90％時(shí)，去除培養(yǎng)基，加入(0.5-3)×106個(gè)/孔的懸浮細(xì)胞的1640培養(yǎng)基與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5-15％胎牛血清；(4)繼續(xù)培養(yǎng)6-7h并收集上清，對上清中的細(xì)胞采用血球計(jì)數(shù)板和/或自動(dòng)計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)；當(dāng)car或tcr靶向的腫瘤抗原表達(dá)于懸浮細(xì)胞時(shí)，步驟(2)所述貼壁細(xì)胞為步驟(1)所述的表達(dá)car或tcr的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的貼壁細(xì)胞，所述懸浮細(xì)胞為car或tcr靶向的腫瘤抗原表達(dá)的懸浮細(xì)胞；當(dāng)car或tcr靶向的腫瘤抗原表達(dá)于貼壁細(xì)胞時(shí)，步驟(2)所述貼壁細(xì)胞為car或tcr靶向的腫瘤抗原表達(dá)的貼壁細(xì)胞，所述懸浮細(xì)胞為步驟(1)所述的表達(dá)car或tcr的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的懸浮細(xì)胞。第二方面，本發(fā)明提供如第一方面所述的檢測嵌合抗原受體或基因修飾的t細(xì)胞受體表達(dá)的方法用于制備腫瘤免疫藥物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有以下有益效果：本發(fā)明的檢測嵌合抗原受體或基因修飾的t細(xì)胞受體表達(dá)的方法不但能判定car或tcr是否正確表達(dá)，還能證明已表達(dá)的car或tcr能否與相應(yīng)的腫瘤抗原特異性結(jié)合，進(jìn)一步提高了car或tcr表達(dá)檢測的準(zhǔn)確率，為腫瘤免疫治療提供進(jìn)一步的保障。附圖說明圖1為實(shí)施例1與對比例1在細(xì)胞混合液培養(yǎng)1h、2h、4h時(shí)的上清細(xì)胞數(shù)柱狀圖；圖2為不同時(shí)間點(diǎn)懸浮細(xì)胞粘附在貼壁細(xì)胞上的顯微觀察結(jié)果圖。具體實(shí)施方式為便于理解本發(fā)明，本發(fā)明列舉實(shí)施例如下。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實(shí)施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對本發(fā)明的具體限制。實(shí)施例1選取攜帶cd19分子的car基因的慢病毒(pcdh-car19)的驗(yàn)證，相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞選取表達(dá)cd19的b淋巴瘤細(xì)胞——raji細(xì)胞。(1)用pcdh-car19侵染293t細(xì)胞，獲得表達(dá)嵌合抗原受體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的293t細(xì)胞；(2)將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的293t細(xì)胞進(jìn)行鋪板，加第一培養(yǎng)基(dmem培養(yǎng)基與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的胎牛血清的混合溶液)，在濃度5％的co2條件下，37℃恒溫培養(yǎng)；(3)待穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的293t細(xì)胞的融合度達(dá)到80％時(shí)，去除第一培養(yǎng)基，加入含有raji細(xì)胞的第二培養(yǎng)基(1640培養(yǎng)基與胎牛血清的混合溶液)，得到細(xì)胞混合液；raji細(xì)胞的初始濃度為1.0×106；(4)將細(xì)胞混合液培養(yǎng)1h，2h，4h，6h后，收集上清液；(5)對上清液中的懸液細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，觀察棄去上清液后懸浮細(xì)胞粘附在貼壁細(xì)胞上的狀況。實(shí)施例2與實(shí)施例1相比，除步驟(3)293t細(xì)胞的融合度為60％外，其余與實(shí)施例1相同。實(shí)施例3與實(shí)施例1相比，除步驟(3)293t細(xì)胞的融合度為70％外，其余與實(shí)施例1相同。實(shí)施例4與實(shí)施例1相比，除步驟(3)293t細(xì)胞的融合度為90％外，其余與實(shí)施例1相同。實(shí)施例5選取攜帶cea(癌胚抗原)抗體的car基因的慢病毒(pcdh-car-cea)的驗(yàn)證，相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞選取表達(dá)cea的人胃癌細(xì)胞——mkn-45細(xì)胞。(1)用pcdh-car-cea侵染sup-t1細(xì)胞，獲得表達(dá)嵌合抗原受體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株sup-t1-car；(2)將mkn-45貼壁細(xì)胞進(jìn)行鋪板，加第一培養(yǎng)基(rpmi-1640培養(yǎng)基與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的胎牛血清的混合溶液)，在濃度5％的co2條件下，37℃恒溫培養(yǎng)；(3)待mkn-45貼壁細(xì)胞的融合度達(dá)到80％時(shí)，去除第一培養(yǎng)基，加入含有sup-t1-car的第二培養(yǎng)基(1640培養(yǎng)基與胎牛血清的混合溶液)，得到細(xì)胞混合液；sup-t1-car細(xì)胞的初始濃度為1.0×106；(4)將細(xì)胞混合液培養(yǎng)1h，2h，4h，6h后，收集上清液；(5)對上清液中的懸液細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，觀察棄去上清液后懸浮細(xì)胞粘附在貼壁細(xì)胞上的狀況。實(shí)施例6與實(shí)施例5相比，除步驟(3)mkn-45貼壁細(xì)胞的融合度為60％外，其余與實(shí)施例1相同。實(shí)施例7與實(shí)施例5相比，除步驟(3)mkn-45貼壁細(xì)胞的融合度為70％外，其余與實(shí)施例5相同。實(shí)施例8與實(shí)施例5相比，除步驟(3)mkn-45貼壁細(xì)胞的融合度為90％外，其余與實(shí)施例5相同。對比例1與實(shí)施例1相比，除將pcdh-car19替換成pcdh-gfp之外，其它與實(shí)施例1相同。對比例2與實(shí)施例1相比，除步驟(3)293t細(xì)胞的融合度為30％外，其余與實(shí)施例1相同。對比例3與實(shí)施例1相比，除步驟(3)293t細(xì)胞的融合度為40％外，其余與實(shí)施例1相同。對比例4與實(shí)施例1相比，除步驟(3)293t細(xì)胞的融合度為50％外，其余與實(shí)施例1相同。對比例5與實(shí)施例1相比，除步驟(3)293t細(xì)胞的融合度為98％外，其余與實(shí)施例1相同。對實(shí)施例1-8及對比例1-5的上清液中的懸液細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果如表1所示。表1實(shí)施例1-8及對比例1-5的上清液中的懸液細(xì)胞數(shù)(單位：×105)1h2h4h6h實(shí)施例18.06.44.73.0實(shí)施例28.16.24.43.3實(shí)施例37.96.34.73.1實(shí)施例48.2.6.44.63.1實(shí)施例57.96.74.73.1實(shí)施例67.86.24.43.4實(shí)施例78.16.74.43.3實(shí)施例88.06.64.53.3對比例110.811.712.216.0對比例210.28.97.86.0對比例310.08.77.45.3對比例49.38.57.04.7對比例510.38.68.19.1從表1可以看出，實(shí)施例1-8的上清液中的懸浮細(xì)胞數(shù)量在1h時(shí)少于原始數(shù)量，而對比例1大于原始數(shù)量，對比例2-5稍高于原始數(shù)量。隨著時(shí)間的延長，實(shí)施例1-8的上清液中懸浮細(xì)胞的數(shù)量呈明顯下降的趨勢，對比例1呈明顯上升的趨勢，而對比例2-5呈微弱下降的趨勢。相比于對比例2-5，實(shí)施例1-4通過將步驟(3)中貼壁細(xì)胞的融合度控制在70-90％，進(jìn)一步增強(qiáng)t細(xì)胞受體的特異性，因此，實(shí)施例1-4的方法不但能判定car19是否正確表達(dá)，還能證明已表達(dá)的car19能否與相應(yīng)的腫瘤抗原特異性結(jié)合，進(jìn)一步提高了car19表達(dá)檢測的準(zhǔn)確率，為腫瘤免疫治療提供進(jìn)一步的保障。當(dāng)步驟(3)中貼壁細(xì)胞的融合度不在本發(fā)明的范圍內(nèi)時(shí)，上清中懸浮細(xì)胞的數(shù)量不能正確反映兩種細(xì)胞的特異性結(jié)合，可能會(huì)導(dǎo)致對結(jié)果的誤判，不適于檢測car或者tcr是否正確表達(dá)。圖1為實(shí)施例1(即pcdh-car19組)和對比例1(即pcdh-gfp組)在細(xì)胞混合液培養(yǎng)1h、2h、4h、6h時(shí)的上清細(xì)胞數(shù)量柱狀圖；可以明顯地看出本發(fā)明的方法篩選的t細(xì)胞受體對于raji細(xì)胞有明顯的粘附作用，特異性極強(qiáng)；而對比例1的上清中raji細(xì)胞不但沒有減少，反而有所增加，可見其沒有特異性結(jié)合。上述表格和圖片說明實(shí)施例1-4的方法對于檢測car19的正確表達(dá)有明顯的效果，而對比例1制備的t細(xì)胞對于raji細(xì)胞沒有特異性，對比例2-5制備的t細(xì)胞的融合度對raji細(xì)胞的粘附較少。圖2為實(shí)施例1和對比例1的上清液棄去后，懸浮細(xì)胞粘附在貼壁細(xì)胞上狀況的顯微鏡觀察結(jié)果圖，可以看出，在培養(yǎng)6h后，實(shí)施例1中明顯有較多的細(xì)胞貼附在培養(yǎng)板底部的貼壁細(xì)胞上，而對比例1中基本沒有細(xì)胞貼附在貼壁細(xì)胞上。申請人聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程才能實(shí)施。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進(jìn)，對本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12