本發(fā)明涉及一種表達(dá)豬生長(zhǎng)激素基因的重組短短芽孢桿菌及構(gòu)建方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：短短芽孢桿菌是一種安全、無(wú)毒性的益生菌，同時(shí)具有蛋白分泌能力強(qiáng)和胞外蛋白酶活性低的特點(diǎn)，因此特別適合做為胞外分泌蛋白表達(dá)系統(tǒng)。豬生長(zhǎng)激素是由豬腦垂體前葉嗜酸性細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)類(lèi)單鏈激素，由191個(gè)氨基酸組成，分子量22kda，等電點(diǎn)6，在豬基因組中該基因?yàn)閱慰截惢?，無(wú)其他相似序列。豬生長(zhǎng)激素可促進(jìn)機(jī)體蛋白質(zhì)合成及組織對(duì)循環(huán)系統(tǒng)中氨基酸的利用，增加肌肉組織蛋白含量，降低脂肪含量，促進(jìn)骨骼發(fā)育，提高豬生長(zhǎng)速度，同時(shí)生長(zhǎng)激素對(duì)廣泛的生理功能都有調(diào)節(jié)作用，可影響幾乎所有的組織和細(xì)胞，是畜牧業(yè)生產(chǎn)中非常重要的激素之一。因此使用基因工程技術(shù)表達(dá)豬生長(zhǎng)激素用于豬養(yǎng)殖業(yè)，可產(chǎn)生重大的經(jīng)濟(jì)效益。同時(shí)豬生長(zhǎng)基因?qū)ψ胸i、小豬、生長(zhǎng)豬、母豬都有作用，長(zhǎng)期注射豬生長(zhǎng)激素可顯著提高各階段豬體重，且對(duì)哺乳母豬泌乳量的提高也有作用。豬生長(zhǎng)激素是蛋白類(lèi)激素，是不親脂性物質(zhì)，不會(huì)儲(chǔ)存在脂肪組織內(nèi)，半衰期短，因此不會(huì)存在藥物殘留，但這也給豬生物激素的使用帶來(lái)新的問(wèn)題，由于半衰期短，目前需要對(duì)豬生長(zhǎng)激素每天注射、口服、皮下包埋，才能產(chǎn)生較好的效果，這顯然給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成了巨大的困難。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明其目的就在于提供一種表達(dá)豬生長(zhǎng)激素基因的重組短短芽孢桿菌及構(gòu)建方法與應(yīng)用，本發(fā)明有效解決了生長(zhǎng)激素半衰期短的問(wèn)題，達(dá)到了長(zhǎng)效的效果。為實(shí)現(xiàn)上述目的而采取的技術(shù)方案是，一種表達(dá)豬生長(zhǎng)激素基因的重組短短芽孢桿菌，所述短短芽孢桿菌為sp3。一種表達(dá)豬生長(zhǎng)激素基因的重組短短芽孢桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：（1）對(duì)ncbi上公布的豬生長(zhǎng)激素序列根據(jù)短短芽孢桿菌密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化得到pgh基因和pncm02質(zhì)粒；（2）用限制性?xún)?nèi)切酶xbai和clai對(duì)上述pgh基因和pncm02質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切；（3）回收雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌jm109感受態(tài)細(xì)胞，使用氨芐西林抗性篩選轉(zhuǎn)化子，獲得重組質(zhì)粒pgh-pncm02；（4）提取重組質(zhì)粒并電轉(zhuǎn)化短短芽孢桿菌sp3，使用新霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子，獲得重組短短芽孢桿菌，表達(dá)豬生長(zhǎng)激素。一種表達(dá)豬生長(zhǎng)激素基因的重組短短芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于，所述使用白油佐劑將短短芽孢桿菌表達(dá)并純化的豬生長(zhǎng)激素蛋白乳化后對(duì)仔豬皮下注射，有效解決了生長(zhǎng)激素半衰期短的問(wèn)題，達(dá)到了長(zhǎng)效的效果。有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明使用白油佐劑將短短芽孢桿菌表達(dá)并純化的豬生長(zhǎng)激素蛋白乳化后對(duì)仔豬皮下注射，結(jié)果顯示乳化對(duì)豬生長(zhǎng)激素起到緩釋作用，有效解決了生長(zhǎng)激素半衰期短的問(wèn)題，達(dá)到了長(zhǎng)效的效果。附圖說(shuō)明以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述。圖1為pgh-pncm02重組質(zhì)粒的pcr鑒定圖（引物pgh-f和pgh-r，產(chǎn)物為600bp）；圖2為短短芽孢桿菌sp3表達(dá)pgh蛋白的westernblot圖（蛋白大小為22kda）；圖3為pncm02質(zhì)粒圖譜；圖4為pncm02質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)圖譜。具體實(shí)施方式一種表達(dá)豬生長(zhǎng)激素基因的重組短短芽孢桿菌，所述短短芽孢桿菌為sp3。所述的質(zhì)粒為pncm02；一種表達(dá)豬生長(zhǎng)激素基因的重組短短芽孢桿菌的構(gòu)建方法，如圖1-4所示，包括以下步驟：（1）對(duì)ncbi上公布的豬生長(zhǎng)激素序列根據(jù)短短芽孢桿菌密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化得到pgh基因和pncm02質(zhì)粒；（2）用限制性?xún)?nèi)切酶xbai和clai對(duì)上述pgh基因和pncm02質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切；（3）回收雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌jm109感受態(tài)細(xì)胞，使用氨芐西林抗性篩選轉(zhuǎn)化子，獲得重組質(zhì)粒pgh-pncm02；（4）提取重組質(zhì)粒并電轉(zhuǎn)化短短芽孢桿菌sp3，使用新霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子，獲得重組短短芽孢桿菌，表達(dá)豬生長(zhǎng)激素。一種表達(dá)豬生長(zhǎng)激素基因的重組短短芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于，所述使用白油佐劑將短短芽孢桿菌表達(dá)并純化的豬生長(zhǎng)激素蛋白乳化后對(duì)仔豬皮下注射，有效解決了生長(zhǎng)激素半衰期短的問(wèn)題，達(dá)到了長(zhǎng)效的效果。實(shí)施例1豬生長(zhǎng)激素基因的獲得對(duì)ncbi上公布的豬生長(zhǎng)激素序列（aaa31045）如序列表中序列1所示，根據(jù)短短芽孢桿菌密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化，上游添加6個(gè)組氨酸的核苷酸序列，下游添加終止密碼子，并在兩端分別添加xbai和clai兩酶切位點(diǎn)及保護(hù)性堿基，人工合成該序列，見(jiàn)序列表中序列2。序列1fpamplsslfanavlraqhlhqlaadtykeferayipegqrysiqnaqaafcfsetipaptgkdeaqqrsdvellrfsllliqswlgpvqflsrvftnslvfgtsdrvyeklkdleegiqalmreledgspragqilkqtydkfdtnlrsddallknygllscfkkdlhkaetylrvmkcrrfvesscaf序列2gctctagacatcatcatcatcatcatttcccggcaatgccgctgagcagcctgttcgcgaacgcggtgctgcgcgcgcaacacctgcaccagctggcggcagatacgtataaagaattcgaacgcgcgtacatcccggaaggccaacgctatagcatccagaacgcgcaagcggcgttctgcttcagcgagacgatcccggcgccgacgggcaaagatgaagcgcaacagcgcagcgacgtggaactgctgcgcttcagcctgctgctgatccaaagctggctgggcccggtccagtttctgagccgcgtcttcacgaacagcctggtgtttggcacgagcgaccgcgtgtatgaaaaactgaaagacctggaggaaggcatccaggcgctgatgcgcgaactggaagacggcagcccgcgcgcaggccaaatcctgaaacagacgtatgacaaattcgatacgaacctgcgcagcgacgacgcgctgctgaaaaactacggcctgctgagctgctttaaaaaagatctgcacaaagcggagacgtacctgcgcgtcatgaaatgccgccgcttcgtggaaagcagctgcgcgttttaaatcgatcc實(shí)施例2構(gòu)建短短芽孢桿菌重組質(zhì)粒pgh-pncm021、pgh基因和pncm02質(zhì)粒的雙酶切反應(yīng)用限制性?xún)?nèi)切酶xbai和clai對(duì)實(shí)施案例1中獲得的基因和pncm02質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，雙酶切反應(yīng)體系如下：體系體積（μl）xbai2clai2pgh基因/pncm02質(zhì)粒2010×mbuffer4ddh2o12總體積40于37℃溫箱反應(yīng)3h后，瓊脂糖凝膠回收雙酶切片段。2、pgh基因和pncm02質(zhì)粒的連接反應(yīng)t4連接酶連接反應(yīng)體系如下：體系體積（μl）pgh8pncm028t4210×buffer2總體積20于4℃冰箱中過(guò)夜反應(yīng)。3、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化jm109大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞3.1、取出-80℃凍存的大腸桿菌jm109感受態(tài)細(xì)胞（100μl裝），握于手心中15sec快速融化后置于冰上；3.2、吸取10μl連接產(chǎn)物輕輕加至大腸桿菌jm109感受態(tài)細(xì)胞底部，冰浴30min；3.3、42℃水浴熱擊90sec，迅速放置冰上1-2min；3.4、加入lb液體培養(yǎng)基900μl，置于37℃搖床培養(yǎng)120rpm緩慢復(fù)蘇40min；3.5、復(fù)蘇的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于含氨芐西林100ug/ml的lb固體平板上，37℃培養(yǎng)18h。4、轉(zhuǎn)化子菌落pcr鑒定使用pgh-f和pgh-r引物對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落pcr擴(kuò)增鑒定,引物序列為：pgh-f：tctagacatcatcatcatcatcattt，pgh-r：atcgatttaaaacgcgcagctgctttccapcr體系為：pgh-f5μl，pgh-r5μl，dntp5μl，10×buffer5μl，transt-taq酶1μl，轉(zhuǎn)化子菌液1μl，ddh2o28μl，總體積50μl。pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性，95℃，5min；變性，95℃，30sec；退火，55℃，30sec；延伸，72℃，1min；總延伸，72℃，5min。其中，變性，退火，延伸，30cycle。pcr擴(kuò)增完成后，pcr原液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，于600bp處有清晰條帶，pcr原液同時(shí)測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與合成基因一致。實(shí)施例3構(gòu)建重組短短芽孢桿菌1、相關(guān)培養(yǎng)基及試劑的配制t2液體培養(yǎng)基：葡萄糖1.0%，蛋白胨1.0%，牛肉膏0.5%，酵母提取物0.2%，ph7.0；t2固體培養(yǎng)基為添加2%瓊脂粉的t2液體培養(yǎng)基。感受態(tài)制備培養(yǎng)基：t2培養(yǎng)基中添加mnso40.001%（w/v，下同），feso40.0001%，znso40.0001%感受態(tài)洗滌液1：蔗糖10%，hepes16mm,cacl21mm，甘油15%，ph7.0。感受態(tài)洗滌液2：peg600015%，hepes1mm，ph7.0。修復(fù)培養(yǎng)基：t2液體培養(yǎng)基中添加20mmmgcl22、短短芽孢桿菌sp3感受態(tài)的制備2.1、在t2固體培養(yǎng)基平板上劃線(xiàn)復(fù)蘇短短芽孢桿菌sp3，37℃倒置培養(yǎng)18；2.2、培養(yǎng)種子液：挑取短短芽孢桿菌sp3單菌落接種于5mlt2液體培養(yǎng)基中，30℃250rpm培養(yǎng)過(guò)夜。2.3、20ml感受態(tài)制備培養(yǎng)基中加入200μl過(guò)夜培養(yǎng)種子液，30℃250rpm培養(yǎng)至od600=2.5，4℃2500rpm離心10min，棄上清培養(yǎng)基。2.4、加入20ml預(yù)冷感受態(tài)洗滌液1，緩慢重懸菌體，4℃2500rpm離心10min，棄上清培養(yǎng)基。2.5、加1ml預(yù)冷感受態(tài)洗滌液2，緩慢重懸菌體，分裝成90μl每管，立即電轉(zhuǎn)使用。3、重組質(zhì)粒pgh-pncm02電轉(zhuǎn)短短芽孢桿菌sp3將質(zhì)粒小量提取試劑盒提取的pgh-pncm02重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化短短芽孢桿菌sp3,電轉(zhuǎn)化步驟如下：3.1、90μl短短芽孢桿菌sp3感受態(tài)細(xì)胞中加入10μlpgh-pncm02重組質(zhì)粒，輕輕混勻；3.2、將重組質(zhì)粒和感受態(tài)混合物緩慢加入2mm電轉(zhuǎn)杯底部，冰浴10min；3.3、設(shè)置參數(shù)電壓2000v、電容50uf、電阻200ω，電轉(zhuǎn)完成后迅速加入900μl預(yù)冷的修復(fù)培養(yǎng)基，輕輕混勻后轉(zhuǎn)移至1.5mlep管中，30℃搖床80rpm緩慢復(fù)蘇1h；3.4、復(fù)蘇好的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于含新霉素30ug/ml的t2固體培養(yǎng)基平板上，每個(gè)平板涂200μl,37℃倒置培養(yǎng)15-18h。4、轉(zhuǎn)化子菌落pcr鑒定使用t2液體培養(yǎng)基對(duì)疑似陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，新霉素添加量為30ug/ml,過(guò)夜搖混后常溫2500rpm離心，菌體沉淀加適量溶菌酶緩慢重懸，55℃作用30min以破壞短短芽孢桿菌細(xì)胞壁，再用質(zhì)粒小量提取試劑盒提質(zhì)粒，以所提質(zhì)粒為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增鑒定，測(cè)序鑒定，從而獲得重組短短芽孢桿菌。實(shí)施例4重組短短芽孢桿菌sp3的表達(dá)平板上挑取重組短短芽孢桿菌單菌落接種于含新霉素30ug/ml的3mlt2液體培養(yǎng)基中，30℃120rpm搖床培養(yǎng)48-64h，表達(dá)的豬生長(zhǎng)激素被分泌至培養(yǎng)基上清。實(shí)施例5重組短短芽孢桿菌表達(dá)豬生長(zhǎng)激素的純化1、飽和硫酸銨沉淀培養(yǎng)基上清中的豬生長(zhǎng)激素培養(yǎng)完成的菌液最大轉(zhuǎn)速離心30min，棄菌體沉淀，將等體積的飽和硫酸銨溶液（4.1mol/l，25℃）邊攪拌邊慢慢加入，加完放磁力攪拌器上4℃攪拌過(guò)夜，使豬生長(zhǎng)激素蛋白充分沉淀。10000rpm4℃離心30min，棄上清保留沉淀，將沉淀溶于少量（10-20ml）pbs-0.2g/l疊氮鈉中，使沉淀溶解，再使用透析袋4℃透析48h，每隔6小時(shí)更換透析緩沖液，以徹底去除硫酸銨。2、豬生長(zhǎng)激素蛋白鎳柱純化相關(guān)試劑如下：母液1：29.22g氯化鈉，2.42gtris-base，ddh2o定溶至1l，調(diào)節(jié)ph=8.0母液2：6.06gtris-base，ddh2o定溶至1l，調(diào)節(jié)ph=8.0bindingbuffer：0.1702g咪唑，溶于500ml母液1。elutionbuffer：17.02g咪唑，溶于500ml母液1。washingbuffer:2.3828g咪唑，溶于500ml母液2。先用bindingbuffer平衡鎳離子親和層析柱，然后將待純化的樣品上樣于鎳柱，結(jié)合30min左右，收集留出液flowthrough，用washingbuffer洗3個(gè)柱體積，收集washthrongh，最后用elutionbuffer洗脫蛋白，收集eluent.將bindingbuffer，washthrongh，eluent。將鎳柱收集的蛋白用milipore壓力超濾濃縮裝置通過(guò)30kda超濾膜截留濃縮至10ml左右，將樣品通過(guò)gelfiltrationbuffer平衡過(guò)的superdex200分子篩進(jìn)行分離。實(shí)施例6豬生長(zhǎng)激素的westernblot驗(yàn)證1、相關(guān)試劑的配制1.1、tris-hcl緩沖液(1mol/l,ph8.8)、tris-hcl緩沖液(0.5mol/l,ph6.8)購(gòu)于北京諾博萊德科技有限公司1.2、sds-page分離膠（12%）成分體積（ml）ddh2o6.630%丙烯酰胺81.5mtris-hcl（ph=8.8）510%sds0.210%過(guò)硫酸銨0.2temed0.008總體積201.3、sds-page濃縮膠成分體積（ml）ddh2o4.130%丙烯酰胺1.01.0mtris-hcl（ph=6.8）0.7510%sds0.0610%過(guò)硫酸銨0.06temed0.006總體積61.4、sds-page電泳緩沖液（tris-glycine）：9.4g甘氨酸、1.51gtris-base、0.5gsds，ddh2o定容至500ml；1.5、westernblot轉(zhuǎn)膜緩沖液：14.4g甘氨酸、3.03gtris-base、200ml甲醇，ddh2o定容至1000ml；1.6、tbst洗滌液：稱(chēng)取2.42gtris-base、8.8gnacl，量取0.5mltween-20，用ddh2o定容至1l，調(diào)節(jié)至ph=7.4；1.7、封閉液：在洗滌液中加入1%的bsa（牛血清白蛋白第五組分），溶解后4℃保存；2、純化豬生長(zhǎng)激素的westernblot驗(yàn)證將純化的生長(zhǎng)激素中添加sds-pageloadingbuffer，沸水浴15min，進(jìn)行westernblot，步驟如下：2.1、清洗bio-rad玻璃板，干燥后安裝，按上配方配制分離膠，1mm膠板中加入2ml分離膠液體，至梳齒下1.5cm，覆蓋少量ddh2o，待凝固后倒掉覆蓋的ddh2o，用濾紙吸凈殘留的ddh2o；2.2、同樣的方法按上配方配制濃縮膠，灌制于分離膠之上，立即插入1mm膠梳，室溫下凝固；2.3、待濃縮膠制備完成，拔下膠梳，立即將膠板固定于電泳裝置上，電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，排盡凝膠底部玻璃板間的氣泡；2.4、每孔加樣20μl,接通電源，設(shè)定電壓80v/cm，待染料進(jìn)入濃縮膠后，調(diào)節(jié)電壓至120v/cm，至溴酚蘭染料距膠底部2cm處停止電泳；2.5、拆下凝膠放于轉(zhuǎn)膜緩沖液中待用，同時(shí)將濾紙，nc膜，纖維墊放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中。2.6、按正極-纖維墊-濾紙-nc膜-凝膠-濾紙-纖維墊的順序安裝膜轉(zhuǎn)移裝置，趕走氣泡，注意兩層濾紙的面積要小于凝膠和nc膜，100v電泳4h；2.7、轉(zhuǎn)膜完成后卸下轉(zhuǎn)膜裝置，用tbst洗滌液清洗膜3次，每次5min；2.8、將膜放在封閉液中，4℃封閉過(guò)夜，棄去封閉液，用洗滌液清洗3次，每次5min；2.9、使用tbst1:5000稀釋his-tag單抗，室溫?fù)u床孵育2h，洗滌液洗滌3次，每次5min；孵育羊抗鼠lgg-hrp二抗30min，tbst洗滌5次，每次5min；使用hrp-dab底物顯色試劑盒進(jìn)行顯色，結(jié)果見(jiàn)圖2。實(shí)施例7重組豬生長(zhǎng)激素的豬體試驗(yàn)1、豬生長(zhǎng)激素蛋白的乳化將已知濃度的純化豬生長(zhǎng)激素蛋白和白油按1：1比例進(jìn)行混合，使用乳化器無(wú)菌乳化，最終蛋白濃度為5mg-20mg/ml。2、重組豬生長(zhǎng)激素的豬體試驗(yàn)取16頭21日齡健康斷奶仔豬，平均體重7.21kg，隨機(jī)分為4組，每組4頭，對(duì)照組1每頭皮下注射生理鹽水1ml，連續(xù)注射20日；對(duì)照組2每頭皮下注射白油1ml，僅注射1次；試驗(yàn)組1每頭皮下注射250ug重組豬生長(zhǎng)激素1ml，連續(xù)注射20日；試驗(yàn)組2每頭皮下注射白油乳化的重組豬生長(zhǎng)激素5mg，僅注射1次。第21日稱(chēng)重，通過(guò)體重來(lái)評(píng)價(jià)重組豬生長(zhǎng)激素對(duì)豬生長(zhǎng)的作用。試驗(yàn)結(jié)果如下表所示：組別對(duì)照組1試驗(yàn)組1對(duì)照組2試驗(yàn)組2試驗(yàn)后平均體重（kg）16.13a21.54b16.36a19.89b注：同行肩標(biāo)字母不同者表示差異顯著（p<0.05）。結(jié)果顯示，注射1次乳化的豬生長(zhǎng)激素和連接注射20天豬生長(zhǎng)激素的仔豬體重并無(wú)顯著性差異，且與對(duì)照組相比，可顯著提高21日齡斷奶仔豬增重33.5%和21.6%。當(dāng)前第1頁(yè)12