本發(fā)明涉及一種表達(dá)豬溶菌酶基因的乳酸克魯維酵母及表達(dá)方法。
背景技術(shù)：
：溶菌酶(lysozyme)又稱n-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，專一的破壞細(xì)菌細(xì)胞壁中肽聚糖的n-乙酰胞壁酸和n-乙酰氨基葡糖之間的β-1,4糖苷鍵，從而使細(xì)胞壁破裂而溶解細(xì)菌。溶菌酶是一種蛋白質(zhì)類的抗菌酶，它不同于抗生素，在殺死致病菌的同時(shí)不易產(chǎn)生耐藥性，因此正逐步發(fā)展成為新型的抗生素替代品。乳酸克魯維酵母是一種優(yōu)秀的畜禽用益生菌，可分泌多種消化酶類，促進(jìn)動(dòng)物腸道健康，同時(shí)乳酸克魯維酵母營(yíng)養(yǎng)要求極其簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)旺盛、生物量大、生長(zhǎng)溫度適應(yīng)范圍廣、分泌蛋白能力強(qiáng),不產(chǎn)生內(nèi)毒素，是一種安全級(jí)的微生物。同時(shí)超強(qiáng)的分泌能力使得乳酸克魯維酵母已成功地應(yīng)用于多種蛋白的表達(dá)，相比其它酵母，乳酸克魯維酵母擁有諸多優(yōu)點(diǎn)，如良好的大規(guī)模發(fā)酵特性、超強(qiáng)的整合表達(dá)能力等,其做為表達(dá)系統(tǒng)已顯示出巨大的潛力。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明其目的就在于提供一種表達(dá)豬溶菌酶基因的乳酸克魯維酵母及表達(dá)方法，具有工藝簡(jiǎn)單、易操作的特點(diǎn)。為實(shí)現(xiàn)上述目的而采取的技術(shù)方案是，一種表達(dá)豬溶菌酶基因的乳酸克魯維酵母，所述乳酸克魯維酵母為gg779。一種表達(dá)豬溶菌酶基因的乳酸克魯維酵母的表達(dá)方法，包括以下步驟：（1）以乳酸克魯維酵母密碼子偏好性優(yōu)化并合成豬溶菌酶基因，基因兩端同時(shí)引入ncoi與ecori兩個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；（2）使用ncoi與ecori同時(shí)對(duì)該基因與乳酸克魯維酵母質(zhì)粒pklac2進(jìn)行雙酶切；（3）回收酶切產(chǎn)物，4℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌jm109感受態(tài)細(xì)胞中；（4）pcr擴(kuò)增鑒定疑似陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并測(cè)序，同時(shí)提取疑似陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，得到正確的重組質(zhì)粒；（5）提取重組質(zhì)粒lys-pklac2并使用sacii酶切線性化，線性化的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化乳酸克魯維酵母gg779,經(jīng)pcr擴(kuò)增鑒定，獲得重組乳酸克魯維酵母lys-pklac2-gg779。有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有工藝簡(jiǎn)單、易操作的特點(diǎn)。附圖說(shuō)明以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述。圖1為豬溶菌酶基因與pklac2質(zhì)粒連接的陽(yáng)性克隆子電泳圖（引物lys-f和lys-r，產(chǎn)物約420bp）；圖2為乳酸克魯維酵母gg779表達(dá)lys蛋白的westernbolt圖（蛋白大小在15kd左右）；圖3為pklac2質(zhì)粒圖譜；圖4為pklac2質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)圖譜。具體實(shí)施方式一種表達(dá)豬溶菌酶基因的乳酸克魯維酵母，所述乳酸克魯維酵母為gg779。包含權(quán)利要求1所述豬溶菌酶基基因的質(zhì)粒，所述質(zhì)粒為乳酸克魯維酵母質(zhì)粒pklac2。所述豬溶菌酶基因是按乳酸克魯維酵母密碼子偏好性優(yōu)化并合成的。一種表達(dá)豬溶菌酶基因的乳酸克魯維酵母的表達(dá)方法，如圖1-4所示，包括以下步驟：（1）以乳酸克魯維酵母密碼子偏好性優(yōu)化并合成豬溶菌酶基因，基因兩端同時(shí)引入ncoi與ecori兩個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；（2）使用ncoi與ecori同時(shí)對(duì)該基因與乳酸克魯維酵母質(zhì)粒pklac2進(jìn)行雙酶切；（3）回收酶切產(chǎn)物，4℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌jm109感受態(tài)細(xì)胞中；（4）pcr擴(kuò)增鑒定疑似陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并測(cè)序，同時(shí)提取疑似陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，得到正確的重組質(zhì)粒；（5）提取重組質(zhì)粒lys-pklac2并使用sacii酶切線性化，線性化的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化乳酸克魯維酵母gg779,經(jīng)pcr擴(kuò)增鑒定，獲得重組乳酸克魯維酵母lys-pklac2-gg779。實(shí)施例1豬溶菌酶基因合成ncbi上發(fā)表的豬源溶菌酶序列（accession：p12069），去掉上游18氨基酸信號(hào)肽即為所需表達(dá)的成熟肽序列（序列表中序列1），在序列上游添加6個(gè)組氨酸的核苷酸序列，以便于后期純化重組蛋白，通過(guò)乳酸克魯維酵母的密碼子偏好性表進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并在其上下游分別設(shè)計(jì)ncoi與ecori兩個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)及其保護(hù)性堿基，對(duì)優(yōu)化好的序列進(jìn)行人工合成。序列如序列表中序列2所示。序列1kvydrcefarilkksgmdgyrgvslanwvclakwesnfntkatnynpgsqstdygifqinsrywcndgktpkavnachisckvlldddlsqdiecakrvvrdpqgikawvawkahcqnkdvsqyirgckl序列2catgccatggcatcatcatcatcatcataaggtttacgatagatgtgaattcgctagaattttgaagaagtctggtatggatggttacagaggtgtttctttggctaactgggtttgtttggctaaatgggaatctaatttcaacactaaagctactaactacaacccaggttctcaatctactgattacggtatttttcaaatcaactctagatactggtgtaacgatggtaaaactccaaaagctgttaatgcttgtcatatttcttgtaaggttttgttggatgatgatttgtctcaagatattgaatgtgctaaaagagttgttagagatccacaaggtattaaggcttgggttgcttggaaagctcattgtcaaaacaaggatgtttctcaatacattagaggttgtaaattggaattcgc實(shí)施例2重組質(zhì)粒lys-pklac2的構(gòu)建1、lys基因和pklac2質(zhì)粒的雙酶切反應(yīng)用ncoi與ecori分別對(duì)豬溶菌酶基因和pklac2質(zhì)粒雙酶切，酶切反應(yīng)體系為：ncoi2ul，ecori2ul，豬溶菌酶基因/pklac2質(zhì)粒40ul，bsa1ul，10×hbuffer5ul，共50ul，于37℃溫箱反應(yīng)3h。2、lys基因和pklac2質(zhì)粒的連接反應(yīng)酶切反應(yīng)結(jié)束后，加入10ul的6×loadingbuffer，使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分別跑膠，分別回收豬溶菌酶基因和pklac2質(zhì)粒的酶切片段進(jìn)行連接反應(yīng)，連接體系為：基因7ul，質(zhì)粒10ul，t4dna連接酶1ul，10×buffer2ul，總體積20ul，4℃連接反應(yīng)過(guò)夜。3、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化jm109大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞3.1取出-80℃凍存的大腸桿菌jm109感受態(tài)細(xì)胞（100ul裝），握于手心中15sec快速融化后置于冰上；3.2吸取10ul連接產(chǎn)物輕輕加至大腸桿菌jm109感受態(tài)細(xì)胞底部，冰浴30min；3.342℃水浴熱擊90sec，迅速放置冰上1-2min；3.4加入lb液體培養(yǎng)基900ul，置于37℃搖床培養(yǎng)120rpm緩慢復(fù)蘇40min；3.5復(fù)蘇的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于含氨芐西林100ug/ml的lb固體平板上，37℃培養(yǎng)18h。4、轉(zhuǎn)化子菌落pcr鑒定使用lys-f和lys-r引物對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落pcr擴(kuò)增鑒定,引物序列為：lys-f：ccatggcatcatcatcatcatcataag；lys-r：gaattccaatttacaacctctaatgtapcr體系如下：lys-f5ul，lys-r5ul，dntp5ul，10×buffer5ul，transt-taq酶1ul，轉(zhuǎn)化子菌液1ul，ddh2o28ul，總體積50ulpcr擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性，95℃，5min；變性，95℃，30sec；退火，55℃，30sec；延伸，72℃，1min；總延伸，72℃，5min。其中，變性，退火，延伸，30cycle。擴(kuò)增完成后加入10ul6×loadingbuffer，0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，疑似陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子有420bp的目的條帶；將疑似陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的pcr原液送北京奧科生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與目的基因序列比對(duì)一致。實(shí)施例3重組乳酸克魯維酵母lys-pklac2-gg779的構(gòu)建1、重組質(zhì)粒lys-pklac2轉(zhuǎn)化乳酸克魯維酵母gg779使用sacii對(duì)重組質(zhì)粒lys-pklac2進(jìn)行酶切線性化，酶切反應(yīng)體系為：sacii2ul，lys-pklac2重組質(zhì)粒34ul，10×hbuffer4ul，共40ul。于37℃溫箱反應(yīng)3h，酶切完成后，回收線性化質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化乳酸克魯維酵母gg779感受態(tài)細(xì)胞，乳酸克魯維酵母gg779感受態(tài)細(xì)胞過(guò)程及轉(zhuǎn)化步驟如下：1.1于ypd平板上劃線分離乳酸克魯維酵母gg799，30℃培養(yǎng)48-64h；1.2挑取乳酸克魯維酵母gg799單菌落接種于50mlypd液體培養(yǎng)基，250rpm30℃過(guò)夜培養(yǎng)種子液；1.3取50ul過(guò)夜培養(yǎng)的種子液，接種于100mlypd液體培養(yǎng)基，250rpm，30℃培養(yǎng)至od600=0.8-1.0；1.44℃4000rpm離心5min，收集菌體，用預(yù)冷的無(wú)菌水25ml緩慢重懸；1.54℃4000rpm離心5min，收集菌體，加1ml100mm的氯化鋰，轉(zhuǎn)入1.5mlep管中，12000rpm離心30sec；1.6用400ul100mm氯化鋰緩慢重懸菌體，50ul/管分裝；1.7取一管新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞，依次加入50%peg3350240ul、1m氯化鋰36ul、2mg/ml單鏈鮭魚精dna25ul、10ug/50ul線性化質(zhì)粒，劇烈渦旋；1.830℃培養(yǎng)30min，再于42℃培養(yǎng)20min；1.94℃4000rpm收集菌體，用1mlypd液體培養(yǎng)基緩慢重懸菌體，30℃120rpm4h；1.104℃4000rpm收集菌體，用1ml無(wú)菌水緩慢重懸，涂布于添加5mm乙酰胺的ycb平板，30℃靜置3-5天。2、pcr擴(kuò)增鑒定轉(zhuǎn)化子使用酵母基因組提取試劑盒提取疑似陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的基因組，以該基因組為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增鑒定，pcr反應(yīng)體系和擴(kuò)增體系與jm109轉(zhuǎn)化子鑒定相同，從而獲得重組乳酸克魯維酵母lys-pklac2-gg779。實(shí)施例4重組乳酸克魯維酵母lys-pklac2-gg779的表達(dá)于ypd平板上劃線分離重組乳酸克魯維酵母lys-pklac2-gg779，30℃培養(yǎng)48-64h，挑取乳酸克魯維酵母gg799單菌落接種于10mlypd液體培養(yǎng)基，250rpm30℃過(guò)夜培養(yǎng)種子液，取5ml過(guò)夜培養(yǎng)的種子液，接種于500mlypg液體培養(yǎng)基（1%酵母提取物；2%蛋白胨；2%半乳糖），250rpm，30℃培養(yǎng)48h，5000rpm離心10min，所得上清液即為溶菌酶酶液。實(shí)施例5重組豬溶菌酶的純化1、飽和硫酸銨沉淀培養(yǎng)基上清中的豬溶菌酶培養(yǎng)完成的菌液最大轉(zhuǎn)速離心30min，棄菌體沉淀，將等體積的飽和硫酸銨溶液（4.1mol/l，25℃）邊攪拌邊慢慢加入，加完放磁力攪拌器上4℃攪拌過(guò)夜，使蛋白充分沉淀。10000rpm4℃離心30min，棄上清保留沉淀，將沉淀溶于少量（10-20ml）pbs-0.2g/l疊氮鈉中，使沉淀溶解，再使用透析袋4℃透析48h，每隔6小時(shí)更換透析緩沖液，以徹底去除硫酸銨。2、豬溶菌酶蛋白鎳柱純化相關(guān)試劑如下：母液1：29.22g氯化鈉，2.42gtris-base，ddh2o定溶至1l，調(diào)節(jié)ph=8.0。母液2：6.06gtris-base，ddh2o定溶至1l，調(diào)節(jié)ph=8.0。bindingbuffer：0.1702g咪唑，溶于500ml母液1。elutionbuffer：17.02g咪唑，溶于500ml母液1。washingbuffer:2.3828g咪唑，溶于500ml母液2。先用bindingbuffer平衡鎳離子親和層析柱，然后將待純化的樣品上樣于鎳柱，結(jié)合30min左右，收集留出液flowthrough，用washingbuffer洗3個(gè)柱體積，收集washthrongh，最后用elutionbuffer洗脫蛋白，收集eluent.將bindingbuffer，washthrongh，eluent。將鎳柱收集的蛋白用milipore壓力超濾濃縮裝置通過(guò)30kda超濾膜截留濃縮至10ml左右，將樣品通過(guò)gelfiltrationbuffer平衡過(guò)的superdex200分子篩進(jìn)行分離。實(shí)施例6豬溶菌酶的sds-page驗(yàn)證1、相關(guān)試劑的配制1.1、tris-hcl緩沖液(1mol/l,ph8.8)、tris-hcl緩沖液(0.5mol/l,ph6.8)購(gòu)于北京諾博萊德科技有限公司1.2、sds-page分離膠（15%）成分體積（ml）ddh2o4.630%丙烯酰胺101.5mtris-hcl（ph=8.8）510%sds0.210%過(guò)硫酸銨0.2temed0.008總體積20成分體積（ml）ddh2o4.130%丙烯酰胺1.01.0mtris-hcl（ph=6.8）0.7510%sds0.0610%過(guò)硫酸銨0.06temed0.006總體積61.3sds-page濃縮1.4、sds-page電泳緩沖液（tris-glycine）：9.4g甘氨酸、1.51gtris-base、0.5gsds，ddh2o定容至500ml；1.5、考馬斯亮藍(lán)染色液：稱取1.0g考馬斯亮藍(lán)r-250，加入50ml冰醋酸、25ml無(wú)水乙醇和425mlddh2o，攪拌溶解后過(guò)濾；1.6、考馬斯亮藍(lán)脫色液：50ml冰醋酸、25ml無(wú)水乙醇，用ddh2o定容至500ml；1.51×tris-glycine電泳緩沖液（0.5l）：1.51gtris粉末、9.4g甘氨酸、0.5gsds、ddh2o定容至0.5l；2、純化豬溶菌酶的sds-page驗(yàn)證將純化的豬溶菌酶中添加sds-pageloadingbuffer，沸水浴15min，以蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量為參考，在分離膠為15%的sds-page蛋白膠上電泳；按以下步驟操作：2.1、清洗bio-rad玻璃板，干燥后安裝，按上配方配制分離膠，1mm膠板中加入2ml分離膠液體，至梳齒下1.5cm，覆蓋少量ddh2o，待凝固后倒掉覆蓋的ddh2o，用濾紙吸凈殘留的ddh2o；2.2、同樣的方法按上配方配制濃縮膠，灌制于分離膠之上，立即插入1mm膠梳，室溫下凝固；2.3、待濃縮膠制備完成，拔下膠梳，立即將膠板固定于電泳裝置上，電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，排盡凝膠底部玻璃板間的氣泡；2.4、每孔加樣20μl,接通電源，設(shè)定電壓80v/cm，待染料進(jìn)入濃縮膠后，調(diào)節(jié)電壓至120v/cm，至溴酚蘭染料距膠底部2cm處停止電泳；2.5、取下凝膠，考馬斯亮藍(lán)染色液中染色過(guò)夜；2.6、過(guò)夜染色完成后，使用考馬斯亮藍(lán)脫色液進(jìn)行脫色，每30分鐘換脫色液，直到看到清晰的條帶為止，結(jié)果如圖2所示。實(shí)施例7重組豬溶菌酶酶活的測(cè)定磷酸鹽緩沖液：磷酸二氫鈉10.4g，磷酸氫二鈉7.86g，乙二胺四乙酸二鈉0.37g，加ddh2o定容至1000ml，ph6.2底物懸浮液的制備：稱取溶酶小球菌20mg，加磷酸鹽緩沖液1ml,于研缽內(nèi)研磨3分鐘，再加磷酸鹽緩沖液，使總體積約為50ml，使懸浮液于25℃時(shí)，在450nm的波長(zhǎng)處測(cè)得的吸收度為0.70±0.05。精密量取25℃的底物懸浮液3ml，置1cm比色池中，在450nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，作為零秒的讀數(shù)a<[0]>，然后精密量取25℃的純化的重組溶菌酶0.15ml,加到上述比色池中，迅速混勻，用秒表計(jì)時(shí),至60秒時(shí)再測(cè)定吸收度a；同時(shí)精密量取磷酸鹽緩沖液0.15ml，同法操作，做為空白試驗(yàn)，測(cè)得零秒的讀數(shù)a'<[0]>及60秒的讀數(shù)a'。在室溫25℃、ph值6.2時(shí)，在波長(zhǎng)450nm處，每分鐘引起吸收度下降0.001為一個(gè)酶活力單位。按下式計(jì)算：（a<[0]>－a）－（a'<[0]>－a'）效價(jià)單位數(shù)(u/ml)＝───────────────10<6>v式中v為所測(cè)純化重組溶菌酶的體積（ml）經(jīng)測(cè)定，1l乳酸克魯維酵母培養(yǎng)基表達(dá)上清，經(jīng)純化后獲得20ml重組溶菌酶，其活性為500u/ml。當(dāng)前第1頁(yè)12