本發(fā)明屬于豬細小病毒技術領域，尤其涉及一種重組豬細小病毒樣粒子及其制備方法和應用。

背景技術：

豬細小病毒(porcineparvovirus，ppv)是引起母豬繁殖障礙的主要病原體，母豬孕前期受ppv感染、經胎盤使胚胎或胎兒受到侵襲，引起初產母豬不孕、流產、胚胎死亡、胎兒畸形、胎兒木乃伊等，同時還可引起仔豬的皮炎和腹瀉，給養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的經濟損失。近年來，ppv感染呈現擴大、上升的趨勢，在全國范圍內流行，遍及二十多個省、市，血清學調查陽性率普遍高達50％-80％，ppv儼然已成為豬重要的傳染病之一，極大制約了我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。

眾所周知，畜禽重大疫病的防控關鍵都在于疫苗免疫，同樣免疫接種是防控ppv的主要手段。目前，我國市場上已有包括哈獸研、上海農科院、武漢科前等多家單位研制的滅活疫苗上市，這些疫苗在一定程度上控制了我國ppv的流行，但其存在免疫持續(xù)時間短，抗體水平較低，免疫副作用大等缺陷，造成免疫效果常不盡人意。弱毒苗和dna疫苗因其安全性和技術瓶頸難以突破等原因還處于研發(fā)階段。因此，克服目前ppv活苗、滅活苗以及基因工程疫苗缺點，尋找新的技術策略，研發(fā)一種安全、高效非復制的病毒疫苗是有效免疫防控ppv的重要科學前提。

病毒樣粒子(virus-likeparticles，vlps)，是由病毒主要衣殼蛋白或包膜蛋白自主包裝形成的空衣殼結構，在形態(tài)、結構及表面抗原和多肽表位與天然病毒粒子非常相似，作為免疫原，vlps模仿了病毒粒子的真實結構，比其它類型的亞單位疫苗更容易被免疫系統識別，并且以更真實的構象被抗原遞呈細胞吞噬、加工和遞呈；而且vlps結構與原病毒相似，就意味著與其它亞單位疫苗相比，低劑量就可以有效刺激產生和全病毒一樣的保護反應。此外，因vlps不會產生任何可能導致感染的遺傳成分，具有安全性好等特點，因此，病毒樣粒子已經成為多種研究病毒疫苗的首選對象，成為今后病毒類疫苗研究的發(fā)展方向。目前，多種病毒樣粒子疫苗已進入臨床前期試驗，其中由桿狀病毒表達系統產生的乙型肝炎病毒vlps和人乳頭瘤病毒vlps在美國已被批準上市。此外還有戊型肝炎vlps疫苗等多個品種在臨床研究中，顯示出該類疫苗的巨大潛力。研究證實，vp2蛋白是ppv的主要衣殼蛋白和主要的抗原表位聚集區(qū)，可自我組裝形成病毒樣顆粒，在病毒感染細胞過程中參與病毒dna的包裝形成具有感染性的病毒粒子。tat蛋白轉導域具有強大的蛋白轉導功能，能把與之融合的蛋白、dna等物質跨膜轉運到細胞內，并在細胞間傳遞，同時保留所攜帶外源物質的生物活性。近年來，應用蛋白轉導域來增強動物疫苗免疫效果的報道屢見不鮮，蛋白轉導域促進所攜帶蛋白的細胞提呈作用已證實。因此，tat蛋白轉導域在動物疫苗領域有著廣泛的研究和應用價值。

技術實現要素：

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種重組豬細小病毒樣粒子及其制備方法和應用。

為解決上述技術問題，本發(fā)明采用以下技術方案：tat-vp2融合基因，該基因由融合ppvvp2蛋白基因和2段tat蛋白轉導域核苷酸序列形成且具有序列表seq.id.no.1的堿基序列。

上述tat-vp2融合基因在制備預防豬細小病毒病(ppvd)疫苗中的應用。

重組豬細小病毒樣粒子，該病毒樣粒子由融合ppvvp2蛋白基因和2段tat蛋白轉導域核苷酸序列形成的tat-vp2融合基因所編碼，且病毒樣粒子具有序列表seq.id.no.2的氨基酸序列。

重組豬細小病毒樣粒子的制備方法，將tat蛋白轉導域通過兩輪pcr擴增與形成ppv空衣殼蛋白所需的抗原vp2基因融合，克隆到桿狀病毒轉移載體獲得同源重組載體，包裝產生含有ppvvp2蛋白和tat蛋白轉導域的重組桿狀病毒，感染昆蟲細胞，表達融合了ppvvp2蛋白和tat蛋白轉導域的重組tat-vp2蛋白，形成病毒樣粒子(vlps)。

上述重組豬細小病毒樣粒子的制備方法，包括以下步驟：

(1)以豬細小病毒基因組dna為模板擴增出ppvvp2基因，人工合成tat蛋白轉導域序列；

(2)通過兩輪pcr擴增將步驟(1)獲得的形成ppv空衣殼蛋白所需的抗原vp2基因與2段tat拼接形成tat-vp2融合基因，并通過bamhi/noti雙酶切位點將其定向克隆至桿狀病毒轉移載體pfastbac1中構建重組桿狀病毒轉移載體pfast-tat-vp2；

(3)將步驟(2)獲得的重組桿狀病毒轉移載體pfast-tat-vp2轉化dh10bac感受態(tài)細胞進行同源重組，并篩選鑒定獲得攜帶有目的基因tat-vp2的重組桿粒dna；

(4)將步驟(3)獲得的重組桿粒dna以脂質體法轉染對數生長期的sf9細胞，產生表達融合基因tat-vp2的重組桿狀病毒株；

(5)將步驟(4)獲得的重組桿狀病毒株感染對數生長期的sf9細胞，表達tat-vp2融合蛋白；

(6)經反復凍融收集步驟(5)中獲得的感染細胞培養(yǎng)液并裂解感染有tat-vp2基因重組桿狀病毒的宿主細胞，純化獲得有生物活性的、自行組裝形成的重組豬細小病毒樣粒子(tat-vp2vlps)。

疫苗含有isa206佐劑。

上述重組豬細小病毒樣粒子在制備預防豬細小病毒病(ppvd)疫苗中的應用。

針對目前缺乏安全高效防控豬細小病毒病的疫苗(ppv疫苗)的問題，發(fā)明人首次提出了用桿狀病毒表達系統表達豬細小病毒vp2與tat融合基因，設計并制備了一種重組豬細小病毒樣粒子，包括利用bac-to-bac桿狀病毒表達系統在昆蟲細胞中表達n端融合具有細胞穿膜功能的tat蛋白轉導域的ppv重組vp2蛋白，體外組裝形成重組病毒樣粒子。具體操作是先擴增ppvvp2全基因序列，再利用pcr方法在vp2的n端引入tat蛋白轉導域，構建包含融合基因tat-vp2的重組桿狀病毒，重組桿狀病毒感染sf9細胞表達目的蛋白并獲得重組豬細小病毒樣粒子。研究表明，tat-vp22融合基因能在昆蟲細胞中進行表達，表達的融合蛋白具有高度組裝成病毒樣粒子的能力；融合ppvvp2蛋白和tat蛋白轉導域的重組桿狀病毒能夠有效表達出目的蛋白tat-vp2，并且表達的目的蛋白可形成病毒樣粒子，形成的vlps可以輔以佐劑接種動物，可有效刺激ppv特異性抗體產生，提高淋巴細胞產生細胞因子能力，與單純的vp2蛋白相比，具有增強免疫的效果。因此，應用本發(fā)明可研制具有良好免疫效果的新型高效ppv亞單位疫苗。

附圖說明

圖1是vp2基因pcr電泳圖，圖中：m：dl2000dnamarker，1、2：vp2pcr。

圖2是克隆載體pmd-tat-vp2鑒定結果圖，圖中：m：dl15000dnamarker，1、2：pmd-tat-vp2雙酶切產物。

圖3是重組轉移載體pfastbactat-vp2鑒定結果圖，圖中：m：dl5000dnamarker，1：pfastbacvp2pcr產物，2：pfastbacvp2雙酶切產物，3：pfastbactat-vp2pcr產物，4：pfastbactat-vp2雙酶切產物。

圖4是重組桿粒bac-tat-vp2pcr鑒定結果圖，圖中：m：1kbdnaladder，1：bac-tat-vp2pcr產物，2：bac-vp2pcr產物。

圖5是轉染重組桿粒細胞病變圖，圖中：a：正常培養(yǎng)sf9細胞，b：bac-vp2轉染病變細胞，c：bac-tat-vp2轉染病變細胞。

圖6是間接免疫熒光檢測圖，圖中：a1：正常sf9細胞常光，a2：正常sf9細胞熒光，b1：bac-vp2感染細胞常光，b2：bac-vp2感染細胞熒光，c1：bac-tat-vp2感染細胞常光，c2：bac-tat-vp2感染細胞熒光。

圖7是病毒粒子電鏡觀察圖，圖中：病毒粒子電鏡觀察(a：vp2蛋白形成病毒樣粒子b：tat-vp2蛋白形成病毒樣粒子)。

圖8是ppv抗體消長情況。

具體實施方式

一、融合基因tat-vp2的構建

1.引物設計合成

根據genbank公布的ppvvp2序列設計擴增vp2基因特異性引物，人工合成tat蛋白轉導域序列(表1)，引物由北京博邁德生物公司合成。其中引物p1、p4用于從病毒基因組上擴增vp2基因；p2、p4用于擴增在vp2n端引入第1段tat序列的tat-vp2基因，p3、p4用于擴增在vp2n端引入第2段tat序列的tat-vp2基因，p2、p3單下劃線部分為tat序列，p3、p4雙下劃線部分引入的酶切位點。

表1目的基因tat-vp2擴增引物及tat蛋白轉導域序列

2.tat-vp2基因的構建

2.1vp2基因的克隆

2.1.1pcr擴增vp2基因

以常規(guī)方法提取的ppv病毒基因組dna為模板，應用fastpfudnapolymerase聚合酶，用引物p1、p4擴增ppvvp2基因(圖1)，擴增體系為：dna模板20ng，上游引物(20μm)0.5μl，下游引物(20μm)0.5μl，dntps(2.5mm)3μl，5xfastbuffer5μl，dnapolymerase1μl，去離子水補足25μl。擴增條件為：95℃預變性2min；95℃變性20s，65℃退火30s，72℃延伸1min，32個循環(huán)；72℃延伸7min。

2.1.2pcr擴增產物克隆、測序分析

pcr擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后，用dna快速回收純化試劑盒(北京天根)回收純化pcr產物，將回收產物與pmd-18t克隆載體連接，轉化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細胞，挑取單個菌落培養(yǎng)，提取質粒，通過pcr、酶切鑒定為陽性克隆送生物公司進行進一步測序鑒定，證實成功克隆獲得長1740bp目vp2基因(seq.id.no.9)。

2.2目的基因tat-vp2的擴增

以含vp2基因的質粒pmd-tat-vp2為模板，應用fastpfudnapolymerase聚合酶，用p2、p4引物進行第一輪pcr擴增，在vp2的n端引入1段tat序列。擴增條件為：95℃預變性2min；95℃變性10s，68℃退火和延伸1min，32個循環(huán)；72℃延伸7min?；厥占兓谝惠唒cr擴增產物為模板，用p3、p4引物以與第一輪相同的擴增條件進行第二輪pcr擴增，擴增產物經回收純化后與pmd-18t克隆載體連接，轉化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細胞，提取質粒，通過pcr、酶切鑒定為陽性克隆送生物公司進行進一步測序鑒定，證實成功獲得長1812bp的tat-vp2基因(圖2)。

二、重組桿狀病毒的構建

1.重組轉移質粒的構建與鑒定

pmd-tat-vp2質粒和pfastbac載體分別進行bamhi/noti雙酶切，回收純化目的片段tat-vp2及pfastbaci線性化片段，將回收的目的片段與pfastbaci線性化片段進行t4連接，轉化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細胞，提取質粒，通過pcr、酶切鑒定成功構建重組轉移載體pfastbactat-vp2(圖3)。

2.重組bacmid的構建與鑒定

2.1重組桿粒bac-2vp2-vp22構建

將重組質粒pfasttat-vp2轉化大腸桿菌dh10bac感受態(tài)細胞，在輔助質粒的作用下pfasttat-vp2與桿狀病毒骨架載體發(fā)生同源重組，獲得包含tat-vp2基因的重組桿粒bac-2vp2-vp22，最終將外源基因tat-vp2插入到桿狀病毒骨架載體中。

2.2重組細菌的挑選和質粒提取

將轉入pfasttat-vp2重組質粒的dh10bac感受態(tài)細胞以100倍稀釋，取50μl涂布于新鮮的含四環(huán)素(10μg/ml)、卡那霉素(50μg/ml)、慶大霉素(7μg/ml)、β-半乳糖苷(100μg/ml)和iptg(40μg/ml)的sob平板中，培養(yǎng)72小時后，挑取大的白色菌落重新接種于新的sob平板中，37℃培養(yǎng)過夜，挑取白色單克隆接種于含(50μg/ml)卡那霉素，(7μg/ml)慶大霉素，(10μg/ml)四環(huán)素的lb培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)8-12h。提取重組桿粒bac-tat-vp2。

2.3重組桿粒bac-tat-vp2的鑒定

以提取的重桿粒bac-tat-vp2為模板，參考bac-to-bac表達系統說明書，以m13f)：5’-gttttcccagtcacgac-3’(seq.id.no.7)、m13r：5’-caggaaacagctatgac-3’(seq.id.no.8)為引物進行重組桿粒的pcr鑒定，獲得長約4.1kb目的條帶，pcr鑒定結果證實重組桿粒bac-tat-vp2構建成功(圖4)。

3.重組桿狀病毒的制備

3.1重組桿粒轉染昆蟲細胞

sf9細胞鋪板于6孔板中培養(yǎng)，待細胞匯合度至70-80％時，用3000進行質粒轉染。具體步驟如下：

(1)將2μg重組桿粒bac-tat-vp2和2μlp3000加入到250μl不含血清和抗生素的grace培養(yǎng)基中，輕輕混勻；

(2)將4μl3000脂質體加入到250μl不含血清和抗生素的grace培養(yǎng)基中，輕輕混勻；

(3)將步驟(2)和步驟(1)液體混合均勻，室溫放置2～10min；

(4)將步驟(3)混合液逐滴滴入細胞中，置于27℃恒溫培養(yǎng)。

3.2重組桿狀病毒的收獲及擴增

轉染后每天觀察細胞病變情況，細胞出現明顯的病變，細胞變大，變圓或不規(guī)則，開始上漂(圖5)，收集細胞及上清，提取細胞rna及培養(yǎng)上清中的重組桿狀病毒，進行pcr鑒定，檢測到目的基因的存在；轉染后5天細胞出現明顯病變，反復凍融收集細胞及其培養(yǎng)物上清，4℃，12000rpm，離心10min，收集上清，此為p1代重組桿狀病毒細胞毒。將p1代毒按照1∶10接種sf9細胞，27℃培養(yǎng)4-5天，細胞出現大量病變時收獲p2代重組桿狀病毒細胞毒，按同樣方法培養(yǎng)p3代重組桿狀病毒細胞毒，收集的重組病毒-70℃保存。

3.3重組桿狀病毒的滴度測定

以p1、p2、p3代毒為原液，分別進行10倍倍比稀釋，接種96孔板細胞，每個稀釋度接種8孔，置于27℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察病變情況，直到對照細胞完全脫落，記錄每稀釋度的病變情況，按karber法計算重組桿狀病毒滴度，經計算p1～p3代重組桿狀病毒的滴度在10^-3.375tcid50/0.1ml～10^-4.875tcid50/0.1ml之間。

三、重組蛋白的表達

1.重組蛋白ifa鑒定

重組桿狀病毒按10％接種量感染sf9細胞，設置非感染組對照。27℃培養(yǎng)48h～72h，待細胞出現病變后以80％預冷丙酮固定2h，pbst洗滌3次，5％脫脂奶粉(tbst)4℃封閉過夜，pbst洗滌3次，加入1∶2000稀釋的ppv單克隆抗體，37℃避光孵育1h，pbst洗滌3次，加入1∶1000稀釋的fitc熒光標記的羊抗鼠igg，37℃孵育1h，pbst洗滌3次，熒光顯微鏡觀察并記錄結果，重組桿狀病毒感染的細胞有明顯的綠色熒光出現，而對照組觀測不到熒光，證實融合基因tat-vp2能在昆蟲細胞中表達(圖6)。

2.重組蛋白電鏡觀察

p2代重組桿狀病毒按10％接種量感染sf9細胞，27℃培養(yǎng)5d后，反復凍融收集細胞及培養(yǎng)物上清，4℃，12000rpm，離心20min，收集上清，進行電鏡觀察，結果顯示檢測到形態(tài)大小與ppv全病毒粒子相似的直徑約20nm的重組病毒樣粒子，證實表明融合tat蛋白轉導域的vp2蛋白能在體外有效形成病毒樣粒子(圖7)。

四、重組豬細小病毒樣粒子疫苗制備及小鼠免疫試驗

1.重組病毒樣粒子疫苗制備

p2代重組桿狀病毒按10％接種量感染sf9細胞，27℃培養(yǎng)5d后，反復凍融收集細胞上清及培養(yǎng)物，4℃，12000rpm，離心20min，收集上清，用飽和(nh4)2so4沉淀蛋白，tritonx-100和磷酸三丁酯(tbp)滅活桿狀病毒，透析袋初步純化蛋白，bca蛋白定量試劑盒測定濃縮50倍后蛋白濃度為6372.6μg/ml，調整重組蛋白濃度為500ng/μl，按照抗原/佐劑體積比例1∶1加入isa206佐劑完全乳化，制備成為重組豬細胞病毒樣粒子疫苗。

2.小鼠免疫試驗

選取24只8周齡的balb/c小鼠隨機分3組，每組8只，其中第1組注射生理鹽水為陰性對照，第2組注射vp2vlps疫苗，第3組注射tat-vp2vlps疫苗。經肌肉注射免疫小鼠，免疫200μl(含抗原50μg)，左右后肢肌肉各注射100μl，間隔兩周后，以相同途徑和劑量加強免疫一次。在首免后每間隔7天進行小鼠尾尖靜脈采血，收集小鼠血清測定血清ppv抗體水平和細胞因子表達水平。

3.ppv特異性抗體檢測

用ppvelisa檢測試劑盒進行免疫小鼠ppv抗體檢測，用羊抗鼠hrp-igg替代試劑盒中的酶標二抗進行抗體檢測。取ppvelisa抗原包被板加入100μl1∶40倍稀釋的待檢血清，置37℃作用30min后棄去板孔中液體，加入300μl的洗液洗滌4次，每次3min，加入1∶25000稀釋的羊抗鼠hrp-igg，100μl/孔，37℃反應30min后棄去板孔中液體，洗液洗滌4次，先后迅速加入50μl底物a和50μl底物b，輕輕震蕩混勻，22℃-28℃避光顯色10min，加入50μl終止液，在酶標儀上讀取od650mm數值，結果顯示，vp2vlps和tat-vp2vlps疫苗均能有效刺激小鼠產生特異性抗體，并且抗體消長規(guī)律基本一致，但產生的抗體水平無顯著差異(圖8)。

4.細胞因子檢測

用小鼠白介素2(il-2)和γ干擾素(ifn-γ)elisa進行免疫小鼠細胞因子il-2和ifn-γ的檢測。分別取il-2和ifn-γ抗原包被板依次加入配置好的不同濃度的100μl標準品、稀釋好的血清，以稀釋液作為零孔對照，37℃作用90min；棄去elisa板中的液體，加入100μl事先準備好的抗小鼠il-2或ifn-γ抗體工作液，稀釋液孔不加，37℃作用60min；然后后棄去板孔中液體，加入300μl的洗液洗滌3次，每次2min；每孔加入90μltmb顯色液，37℃避光放置25min；每孔加入100μl終止液，在酶標儀上讀取od450mm數值，制作標準曲線，計算血清中il-2和ifn-γ含量。結果顯示vp2vlps和tat-vp2vlps免疫小鼠后6周后，血清中il-2和ifn-γ的分泌水平明顯升高，其中vp2vlps和tat-vp2vlps的il-2含量為976.4pg/ml和1159.1pg/ml，ifn-γ的含量為462.7pg/ml和603.4pg/ml，均顯著高于生理鹽水對照組，并且tat-vp2vlps免疫組的il-2和ifn-γ含量均要明顯高于vp2vlps免疫組；提示vp2vlps和tat-vp2vlps作為免疫原均能有效誘導小鼠產生細胞免疫，并且tat-vp2vlps組誘導小鼠淋巴細胞產生細胞因子的能力要優(yōu)于vp2vlps組。

本發(fā)明制備了含tat蛋白轉導域的ppv重組vlps，并將其與isa206佐劑配制亞單位疫苗，通過免疫小鼠具有較好的免疫原性，若進一步優(yōu)化接種條件、佐劑類型等，可以進一步進行豬體的免疫試驗，具有更好的免疫保護效力，可用于ppv的預防。

sequencelisting

<110>廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所

<120>重組豬細小病毒樣粒子及其制備方法和應用

<130>重組豬細小病毒樣粒子及其制備方法和應用

<160>9

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1812

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

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