本發(fā)明涉及一種菜豆來源的環(huán)氧化物水解酶及其應用，屬于生物技術領域，。

背景技術：

手性純的環(huán)氧化物及其對應的水解產(chǎn)物鄰二醇被認為是一類具有高附加值的多功能手性砌塊，在手性藥物和精細化學品的合成中應用廣泛。然而，在一些手性環(huán)氧化物的制備過程中，sharpless不對稱環(huán)氧化、jacobsen環(huán)氧化等化學法的反應結(jié)果往往無法達到期望的手性純度，產(chǎn)物(指保留下來的單構(gòu)型環(huán)氧化物和生成的二醇)的對映體過剩率(enantiomericexcess,ee)值通常只有30％～80％，而且所使用的重金屬等催化劑也給環(huán)境帶來巨大的威脅。近年來，生物酶所介導的動力學拆分和對映體歸一性水解法因其較為專一的立體選擇性而逐漸走進人們的視野，環(huán)氧化物水解酶(epoxidehydrolase,eh,ec3.3.2.x)就是其中一類重要的酶，該酶可以催化環(huán)氧化物的開環(huán)水解，使水分子立體選擇性地加成到環(huán)氧化物的含氧三元環(huán)上，生成相應的1,2-二醇，是一種典型的α/β折疊型水解酶。eh來源廣泛、反應無需輔因子、底物譜廣、反應條件溫和，被認為是一種頗具開發(fā)潛力和研究價值的生物催化劑。

目前，人們已經(jīng)從動物、植物和微生物中發(fā)現(xiàn)了300多種eh，并根據(jù)酶的亞細胞定位及底物的特異性將其劃分為七個亞家族，其中可溶性環(huán)氧化物酶是當前研究較多的eh之一。bellucci等研究了存在于哺乳動物體內(nèi)微粒體環(huán)氧化物水解酶的立體化學特性，利用其催化水解一些β烷基取代的環(huán)氧苯乙烷衍生物，結(jié)果得到對應的r型二醇。胡蝶等從宇佐美曲霉中成功發(fā)掘出一種新型的環(huán)氧化物水解酶aueh2，發(fā)現(xiàn)其對r型環(huán)氧苯乙烷(styreneoxide,so)的親和性較s型的高，認為該酶在外消旋(rac-)so的手性拆分反應中具有很大的應用潛力。較之上述幾種來源，植物eh則更加容易獲得且原料也較為廉價。當前已經(jīng)在包括大豆(glycinemax)、木豆(cajanuscajan)、蒺藜狀苜蓿(medicagotruncatula)、本氏煙草(nicotianabenthamiana)等植物基因組中確定了編碼eh的開放閱讀框，其中研究最深入的是馬鈴薯eh，其晶體結(jié)構(gòu)早在2006年就已通過x射線衍射圖譜的解析獲得。最近，許建和課題組從綠豆(vignaradiata)中發(fā)現(xiàn)的兩種eh(mbeha,mbehb)在以對硝基環(huán)氧苯乙烷為底物的情況下表現(xiàn)出互補的對映選擇性，引起了相關學者的關注。

迄今報道的環(huán)氧化物水解酶雖然均具有一定的不對稱水解環(huán)氧化物的活性，但是目前僅有40余種eh針對于一種或多種環(huán)氧化物表現(xiàn)出高的對映選擇性(即對映選擇率e值>30)，據(jù)我們所知，除國外學者研究的馬鈴薯eh之外，目前尚無植物來源的eh可以高效的拆分rac-so制備高手性純的r-so，因此，通過分子生物學手段挖掘能夠表達具有高選擇性的eh基因構(gòu)建其表達體系，并將其應用于光學純環(huán)氧化物的制備等研究工作具有著重要經(jīng)濟和社會效益。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的是提供一種環(huán)氧化物水解酶pveh2，如(a)或(b)所示：

(a)氨基酸序列如seqidno.2所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有環(huán)氧化物水解活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種編碼所述環(huán)氧化物水解酶pveh2的基因，基因命名為pveh2，該基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，該序列全長951bp，編碼316個氨基酸。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種用于生產(chǎn)r-環(huán)氧苯乙烷的重組大腸桿菌，是以大腸桿菌為宿主，表達seqidno.2所示的環(huán)氧化物水解酶。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組大腸桿菌以pet-28a(+)為載體。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組大腸桿菌以e.colibl21、e.colijm109、e.colidh5α、或e.colitop10為宿主。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組大腸桿菌是按如下方法構(gòu)建的：(1)擴增seqidno.1所示序列，在基因兩端引入限制性內(nèi)切酶ndei和xhoi的酶切位點；(2)用上述兩種內(nèi)切酶分別處理seqidno.1所示序列和表達載體pet-28a(+)，并將上述酶解消化產(chǎn)物在17℃連接過夜，得到重組表達質(zhì)粒pet-28a(+)-pveh2；(3)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細胞中，即可得到重組菌株e.colibl21(de3)/pet28a(+)-pveh2。

本發(fā)明的第四個目的是提供一種r-環(huán)氧苯乙烷的生物轉(zhuǎn)化方法，所述方法是應用seqidno.2所示的環(huán)氧化物水解酶，催化外消旋環(huán)氧苯乙烷生產(chǎn)手性純(ee>99％)的r-環(huán)氧苯乙烷。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法是將重組環(huán)氧化物水解酶pveh2按照0.1～0.5u/mg底物的比例溶解于濃度為ph為7.0～8.0緩沖溶液中，在20～35℃下保溫10min后加入外消旋環(huán)氧苯乙烷，并在相同的條件下進行動力學拆分反應。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法是將重組環(huán)氧化物水解酶pveh2按照0.017u/mg底物的比例溶解于濃度為100mmol/l的ph為7.0～7.2的nah2po4-na2hpo4緩沖溶液體系中，在20～35℃下保溫10min后加入外消旋環(huán)氧苯乙烷，并在相同的條件下進行動力學拆分反應。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述環(huán)氧化物水解酶以酶液、具有生物活性的細胞、固體酶制劑的形式應用。

在本發(fā)明的一種實施方式中，以表達seqidno,2所示環(huán)氧化物水解酶的重組大腸桿菌進行生物轉(zhuǎn)化。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法是將所述的重組大腸桿菌活化后按照1％(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接至含有0.1mg/ml硫酸卡那霉素的lb培養(yǎng)基，并在發(fā)酵體系的od600值達到0.5～1.0時加入終濃度為0.05～1.0mmol/l的iptg，然后在25℃下培養(yǎng)6～7h，離心、收集菌體，將菌體用于r-環(huán)氧苯乙烷的生物轉(zhuǎn)化。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法是將經(jīng)過誘導表達的含有重組環(huán)氧化物水解酶的菌體或細胞破碎，將上清液或上清液經(jīng)純化后的純酶溶解于濃度為100mmol/l的ph為7.2的nah2po4-na2hpo4(100mm,ph7.2)緩沖溶液體系中，然后在25℃下保溫10min后加入外消旋環(huán)氧苯乙烷，進行動力學拆分反應。

本發(fā)明還提供所述生產(chǎn)r-環(huán)氧苯乙烷的重組大腸桿菌在食品、生物、化工領域的應用。

本發(fā)明的有益效果：(1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)一種環(huán)氧化物水解酶基因pveh2，其核苷酸序列如seqidno.1所示，該基因編碼一種新型的環(huán)氧化物水解酶pveh2，其氨基酸序列如seqidno.2所示；(2)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了由seqidno.1所示環(huán)氧化物水解酶基因表達的重組酶的新應用；與其它來源的環(huán)氧化物水解酶相比，催化的專一性更強；(3)本發(fā)明構(gòu)建的重組大腸桿菌作為催化劑進行生物轉(zhuǎn)化，可以以外消旋環(huán)氧苯乙烷為底物，經(jīng)對映體選擇性水解生產(chǎn)手性純(ee>99％)的r-環(huán)氧苯乙烷，產(chǎn)率由原先報道的馬鈴薯eh的45.6％提高至49.3％。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的重組表達載體pet-28a(+)-pveh2的物理圖譜。

圖2為12％sds-page圖譜，其中，m為蛋白分子量marker；1為e.colibl21(de3)；2為未經(jīng)過誘導的e.colibl21(de3)/pet28a(+)-pveh2；3為經(jīng)0.2mmol/liptg誘導的e.colibl21(de3)//pet28a(+)-pveh2。

圖3為重組環(huán)氧化物水解酶對外消旋環(huán)氧苯乙烷的水解反應進程；其中，—▼—為底物so的對映體過量率ees；—▲—為轉(zhuǎn)化率c；—●—為s-so；—■—r-so。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步的描述：

各構(gòu)型環(huán)氧苯乙烷的濃度利用手性氣相毛細色譜柱(cyclosil-b,agilent公司)進行檢測，測定方法、轉(zhuǎn)化率及ee值的計算參見2016年公開的《新型菜豆環(huán)氧化物水解酶的異源表達及對映歸一性催化特性》。

環(huán)氧化物水解酶的測定：取250μlpveh2粗酶液或純酶液或表達有pveh2的菌體懸浮液加入到225μl磷酸鈉緩沖液中并混勻，置于25℃下預熱10min，再加入25μlrac-so(母液濃度為200mmol/l，溶解于甲醇)，使催化體系中底物so的初始濃度為10mmol/l，反應期間每10min從體系中取200μl至1ml乙酸乙酯(含1mmol/l正己醇作為內(nèi)標物)中萃取，上層有機相利用氣相色譜法進行檢測。酶活定義為每分鐘環(huán)氧化物水解酶催化1.0μmol的環(huán)氧苯乙烷水解或生成1.0μmol的苯乙二醇所需要的酶量為1u。

實施例1環(huán)氧化物水解酶基因的克隆及表達質(zhì)粒的構(gòu)建

提取菜豆的總rna(使用trizol試劑盒，invitrogen公司)，參照試劑盒說明書進行操作。反轉(zhuǎn)錄過程參照takara公司的rt-pcr試劑盒pcrprimescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser(perfectrealtime)說明書，然后以反轉(zhuǎn)錄得到的cdna為模板，上、下游引物序列分別為seqidno:3和seqidno.4(引物中引入ndei和xhoi限制性內(nèi)切酶酶切位點，引物均由上海生工有限公司合成)，采用常規(guī)pcr方法擴增pveh2全長基因，其核苷酸序列如seqidno.1，pcr反應條件為：94℃預變性2min，94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，循環(huán)30次，再在72℃下延伸10min。pcr產(chǎn)物用1.0％瓊脂糖核酸凝膠電泳檢測與純化后用dna膠回收試劑盒(上海生工)回收目的片段，回收產(chǎn)物和表達載體pet-28a(+)經(jīng)相同的限制酶的處理之后，用t4dna連接酶將兩者在17℃下過夜連接，得到重組表達載體pet-28a(+)-pveh2，并將其導入到e.colibl21(de3)的感受態(tài)細胞內(nèi)，涂布于含有0.1mg/ml硫酸卡那霉素的lb平板上，37℃培養(yǎng)16h，挑取陽性克隆，轉(zhuǎn)接于含有相同卡那霉素含量的lb液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并用ndei和xhoi進行雙酶切鑒定，pveh2序列如序列圖seqidno.1所示，所推導的氨基酸序列如seqidno.2所示。

實施例2環(huán)氧化物水解酶pveh2的制備

將實施例1中的基因工程菌e.colibl21(de3)/pet28a(+)-pveh2接種于lb液體培養(yǎng)基(含0.1mg/ml硫酸卡那霉素)中，37℃培養(yǎng)10～16h(優(yōu)化的，為12h)，然后再以1％(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接于含有相同成分的lb培養(yǎng)基內(nèi)繼續(xù)擴大培養(yǎng)，當菌體濃度od600值達到0.8～1.0(優(yōu)化的，為0.8)時加入iptg至其終濃度為0.2mmol/l，在25℃下誘導培養(yǎng)4～9h(優(yōu)化的，為7h)后4℃下8000r/min離心5min，收集菌體沉淀，依照上述步驟每100ml培養(yǎng)基可以發(fā)酵得到0.5～0.8g的濕菌體。菌體細胞的sds-page分析結(jié)果如圖2所示，目的蛋白的表觀分子約為37.9kda。。

實施例3環(huán)氧化物水解酶pveh2在制備手性環(huán)氧苯乙烷中的應用

將實施例2中經(jīng)離心獲得的濕菌體按照每g對應10mlnah2po4-na2hpo4(100mm,ph7.2)緩沖液的比例重新混懸，菌細胞懸液直接作為生物酶催化劑，以外消旋環(huán)氧苯乙烷為底物進行轉(zhuǎn)化，制備r型環(huán)氧苯乙烷。具體操作為：在10ml的ep塑料管內(nèi)加入2.5ml菌細胞懸液(菌濃50mg/ml，活力為0.04u/ml)、2.25ml緩沖液、0.25ml濃度為200mmol/l的外消旋環(huán)氧苯乙烷(在催化體系的終濃度為10mmol/l)，在25℃振蕩的條件下轉(zhuǎn)化120min，最后加入相同體積的乙酸乙酯進行萃取及終止反應。

pveh2在上述條件下對于環(huán)氧苯乙烷的反應進程如圖3所示。經(jīng)檢測，反應40min時ees已超過70％，轉(zhuǎn)化率達到42％；反應80min時轉(zhuǎn)化率達45％；反應完全時得到ee>99％的r型環(huán)氧苯乙烷，產(chǎn)率達到49.3％(手性拆分的理論產(chǎn)率為50％)。

對照例1

按實施例2的方法制備pveh2酶，區(qū)別在于，當發(fā)酵體系od600值達到1.5時，在30℃下加入0.5mmol/l的iptg誘導培養(yǎng)6h時，所產(chǎn)的重組pveh2基本以無酶學活性的包涵體形式存在。

對照例2

按實施例3的方法利用重組pveh2對外消旋環(huán)氧苯乙烷進行生物轉(zhuǎn)化，區(qū)別在于，轉(zhuǎn)化過程控制溫度為35℃，受到底物較強的自水解作用的影響，導致當反應70～75min時，s-so水解完全，得到97.6％ee的r-so，其最終產(chǎn)率僅為32.4％。此外，重組pveh2在40℃條件下保持1h后，其殘余活力僅為原酶的8.3％。

對照例3

其它來源的eh酶水解制備r-so的效果如表1所示。

表1不同來源的環(huán)氧化物水解酶在rac-so動力學拆分中保留r-so的效果

以上所述的僅為本發(fā)明較佳實施例，并非以此來限定本發(fā)明的范圍，上述實施例還可以進行進一步的優(yōu)化。即凡是依據(jù)本發(fā)明所申請的權(quán)利要求書及說明書內(nèi)容所作的簡單、等效的變化與修飾，皆為本發(fā)明申請的權(quán)利要求的保護范圍。

sequencelisting

<110>江南大學

<120>一種菜豆來源的環(huán)氧化物水解酶及其應用

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