本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人hsa-mir-124a-3ppcr檢測(cè)方法及其在ds妊娠風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

唐氏綜合征(down'ssyndrome，ds)是人類最常見的一種導(dǎo)致新生兒智力缺陷和發(fā)育障礙的遺傳性疾病，也稱為21-三體綜合征(trisomy21，t21)或者先天愚型，其在出生胎兒中的發(fā)病率大約為1/700，而我國ds的發(fā)生率約為(1.53-2.40)/萬。大多數(shù)ds胎兒在宮內(nèi)即停止發(fā)育或引發(fā)流產(chǎn)，因此，ds實(shí)際發(fā)病率應(yīng)遠(yuǎn)高于1/700。并且隨著婦女妊娠年齡的增大，尤其是我國現(xiàn)階段人口生育政策的變化，大齡或高齡孕婦增多以及輔助生育技術(shù)的進(jìn)一步推廣和應(yīng)用，ds發(fā)病率有繼續(xù)升高的趨勢(shì)。ds患兒除了智力缺陷外，還常伴有先天性心臟病、甲狀腺疾病、精神和體格發(fā)育遲滯以及器官和組織的多發(fā)性畸形等疾病。目前，做好ds患兒的產(chǎn)前早期篩查，避免其出生是最有效的預(yù)防ds方案。

ds的產(chǎn)前檢查方案主要分為無創(chuàng)產(chǎn)前檢查(noninvasiveprenataltesting，nipt)和有創(chuàng)產(chǎn)前檢查，其中nipt主要包括唐氏篩查和無創(chuàng)dna檢測(cè)，有創(chuàng)性檢查主要包括羊膜腔液體穿刺檢查、絨毛膜穿刺檢查和胎兒臍帶血檢查。唐氏篩查是目前應(yīng)用最廣的ds產(chǎn)前篩查手段，主要結(jié)合了超聲檢查和孕婦血清標(biāo)志物檢驗(yàn)。唐氏篩查安全性高，但是特異性較差，雖然胎兒頸項(xiàng)透明層(nuchaltranslucency，nt)>2.5mm時(shí)，ds患病率高達(dá)84％，但是仍不能達(dá)到確診的要求，唐氏篩查高危的孕婦仍然需要后續(xù)檢查確診。無創(chuàng)dna檢測(cè)是近年來興起的ds產(chǎn)前檢測(cè)手段，又稱為無創(chuàng)產(chǎn)前dna檢查或者無創(chuàng)胎兒染色體非整倍體檢查，主要依靠檢測(cè)母體血液中胎兒游離dna(cellfreefetaldna，cffdna)，并對(duì)其進(jìn)行序列分析以獲得胎兒的遺傳信息，從而診斷ds、帕陶氏綜合征(patausyndrome，ps)和愛德華綜合征(edwardssyndrome，es)，其安全性和靈敏度均較高，但是檢查費(fèi)用較高，技術(shù)操作復(fù)雜，檢查周期較長(zhǎng)，目前衛(wèi)生主管部門對(duì)其實(shí)行資質(zhì)認(rèn)證管理，多在第三方的醫(yī)療檢測(cè)機(jī)構(gòu)應(yīng)用，不易在臨床特別是基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)推廣。羊膜腔液體穿刺檢查、絨毛膜穿刺檢查和胎兒臍帶血檢查均通過侵襲性操作獲得胎兒脫落細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行染色體核型分析，達(dá)到確診的目的，雖特異性較高，但是侵襲性操作對(duì)操作者的臨床經(jīng)驗(yàn)要求高，且有1％導(dǎo)致流產(chǎn)的機(jī)率。目前，染色體核型分析雖然是產(chǎn)前診斷ds的金標(biāo)準(zhǔn)，但是其檢測(cè)技術(shù)復(fù)雜、條件要求高且檢測(cè)周期長(zhǎng)，故僅局限于唐氏篩查的高危孕婦。因此，建立一種安全、價(jià)格合理又特異的ds產(chǎn)前檢測(cè)手段仍舊是產(chǎn)前診斷領(lǐng)域探索的方向，而與cffdna同屬于血液常見分子的微小rna(micrornas，mirna)分子開始引起人們的重視。

mirna是一類長(zhǎng)度約為20-25個(gè)堿基的非編碼rna小分子，其主要生理作用是調(diào)控基因的表達(dá)。mirna可以耐受血液中rna酶的降解，可以在循環(huán)血液中長(zhǎng)期穩(wěn)定的存在，同時(shí)mirna還可以耐受外界強(qiáng)酸、強(qiáng)堿的處理，為mirna的檢測(cè)帶來了方便。此外，mirna還具有很強(qiáng)的組織和器官的特異性，為其成為理想的疾病循環(huán)血液學(xué)標(biāo)志物奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。目前研究顯示，健康胎兒和唐氏患兒孕中期母體血漿存在135種表達(dá)差異的mirna分子，其中，hsa-mir-124a-3p是表達(dá)量顯著性升高的mirna分子中差異值最大的分子。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)以上問題，本發(fā)明提供一種操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的人hsa-mir-124a-3ppcr檢測(cè)方法及其在ds妊娠風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)中的應(yīng)用。

本發(fā)明實(shí)現(xiàn)其目的所采用的技術(shù)方案如下：

一種人hsa-mir-124a-3ppcr檢測(cè)方法，包括如下步驟：

1)提取待測(cè)人血漿樣品的總rna；

2)對(duì)提取的rna利用rt-qpcr進(jìn)行檢測(cè)：

a、rt反應(yīng)：rt引物序列為：

5′-gtcgtatccagtgcgtgtcgtggagtcggcaattgcactggatacgacggcattc-3′，rt反應(yīng)程序：16℃30min，42℃30min，85℃5min；

b、qpcr反應(yīng)：qpcr反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃2min，95℃10min；95℃15s，60℃60s，35個(gè)循環(huán)；

3)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)樣品中的hsa-mir-124a-3p濃度。

在上述技術(shù)方案中，rt反應(yīng)體系為：rt反應(yīng)混合物7μl、0.1pmol/μl的hsa-mir-124a-3p標(biāo)準(zhǔn)品5μl、100pmol/μl的rt引物3μl，其中rt反應(yīng)混合物由如下組分組成：0.15μldntps、1μl50u/μl的multiscribetmreversetranscriptase、1.5μl10×reversetranscriptionbuffer、0.19μl20u/μl的rnaseinhibitor、4.16μlrnase-freewater；qpcr反應(yīng)體系由如下組分組成：1μlsmallrnaassays、1.33μlrt反應(yīng)產(chǎn)物、10μlmastermixwithung、7.67μlrnase-freewater。

一種上述的人hsa-mir-124a-3ppcr檢測(cè)方法在ds妊娠風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)中的應(yīng)用，將采用權(quán)利要求1所述的方法測(cè)得的待測(cè)樣品的hsa-mir-124a-3p濃度應(yīng)用到ds妊娠風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)中，將10^-5至10^-3pmol/μl確定為權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法的ds高危風(fēng)險(xiǎn)的區(qū)間值。

本發(fā)明的有益效果是：成功構(gòu)建了血漿hsa-mir-124a-3p的rt-qpcr檢測(cè)方法，該方法的檢測(cè)線性范圍寬、檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)特異性、重復(fù)性較好，可用于臨床標(biāo)本中微量hsa-mir-124a-3p的定量檢測(cè)。同時(shí)檢測(cè)hsa-mir-124a-3p的rt-qpcr方法具有操作相對(duì)簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，有望應(yīng)用于ds的產(chǎn)前篩查。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證明hsa-mir-124a-3p在ds妊娠風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的價(jià)值比常規(guī)血清唐氏篩查方法高，為hsa-mir-124a-3p在ds妊娠產(chǎn)前篩查中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1是不同濃度hsa-mir-124a-3p逆轉(zhuǎn)錄cdna的qpcr擴(kuò)增曲線圖，其中，曲線a、b、c、d、e分別為10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6pmol/μl的hsa-mir-124a-3p逆轉(zhuǎn)錄cdna的擴(kuò)增曲線。

圖2是hsa-mir-124a-3pqpcr標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

圖3是hsa-mir-124a-3prt-qpcr檢測(cè)方法的靈敏度、特異性及重復(fù)性檢測(cè)圖，其中，圖a、b、c分別為30、35、40個(gè)循環(huán)時(shí)hsa-mir-124a-3p標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)組和rnase-freewater陰性對(duì)照組的擴(kuò)增曲線。

圖4是hsa-mir-124a-3p診斷ds妊娠的roc曲線圖。

圖5是hsa-mir-124a-3p檢測(cè)法和血清唐氏篩查的ds風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)roc曲線圖，其中，a、b分別為hsa-mir-124a-3p檢測(cè)法和唐氏篩查的ds風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)roc曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但并不因此而限制本發(fā)明。

相關(guān)試劑

(1)逆轉(zhuǎn)錄試劑：multiscribetmreversetranscriptase(50u/μl)、10×reversetranscriptionbuffer、dntpmix(100mmtotal)、rnaseinhibitor(20u/μl)均購于上海市愛普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)貿(mào)易有限公司；hsa-mir-124a-3p逆轉(zhuǎn)錄引物由上海市生物工程有限公司合成；tebuffer由上海市聰誠實(shí)業(yè)有限公司提供。

(2)熒光定量pcr擴(kuò)增試劑：smallrnaassays試劑盒購自賽默飛世爾科技公司，其為hsa-mir-124a-3p逆轉(zhuǎn)錄后得到的cdna的擴(kuò)增引物和taqman探針的混合液；mastermixwithung為qpcr反應(yīng)的預(yù)混合物，由賽默飛世爾科技公司提供；rnasefreewater為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。

(3)血漿mirna提取試劑：trzolls購自上海玉博生物科技有限公司。

(4)逆轉(zhuǎn)錄試劑：multiscribetmreversetranscriptase(50u/μl)、10×reversetranscriptionbuffer、dntpmix(100mmtotal)、rnaseinhibitor(20u/μl)均購于上海市愛普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)貿(mào)易有限公司；hsa-mir-124a-3p逆轉(zhuǎn)錄引物由上海市生物工程有限公司合成；u6snrna逆轉(zhuǎn)錄引物由賽默飛世爾科技公司提供；tebuffer由上海市聰誠實(shí)業(yè)有限公司提供。

(5)熒光定量pcr擴(kuò)增試劑：smallrnaassays試劑盒購自賽默飛世爾科技公司，為hsa-mir-124a-3p逆轉(zhuǎn)錄后得到的cdna的擴(kuò)增引物和taqman探針的混合液；mastermixwithung為qpcr反應(yīng)的預(yù)混合物，由賽默飛世爾科技公司提供；rnasefreewater為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。

(6)唐氏篩查試劑：afp、βhcg和ue3檢測(cè)試劑盒由羅氏公司提供。

(7)其他試劑：hsa-mir-124a-3p標(biāo)準(zhǔn)品由大連寶生物工程有限公司合成。

實(shí)施例1、hsa-mir-124a-3p的rt-qpcr檢測(cè)

一、hsa-mir-124a-3prt反應(yīng)

(1)hsa-mir-124a-3p標(biāo)準(zhǔn)品的合成：登錄http://www.mirbase.org/網(wǎng)站，獲取hsa-mir-124a-3p的堿基序列為5′-uaaggcacgcggugaaugcc-3′(如seqidno:1所示)。將獲得的hsa-mir-124a-3p序列送至大連寶生物工程有限公司合成hsa-mir-124a-3p標(biāo)準(zhǔn)品(12.8nmols)。

(2)不同濃度hsa-mir-124a-3p標(biāo)準(zhǔn)品的配制：將1.28mlrnase-freewater加入12.8nmol數(shù)的hsa-mir-124a-3p標(biāo)準(zhǔn)品中，配制成10pmol/μl的hsa-mir-124a-3p標(biāo)準(zhǔn)品溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品的儲(chǔ)存液。然后繼續(xù)用rnase-freewater將10pmol/μl的hsa-mir-124a-3p標(biāo)準(zhǔn)品以10倍濃度梯度稀釋至1和0.1pmol/μl2種濃度。

(3)hsa-mir-124a-3prt引物的設(shè)計(jì)：將hsa-mir-124a-3p序列中的u全部替換為t，得到序列為5′-taaggcacgcggtgaatgcc-3′，其互補(bǔ)序列為5′-ggcattcaccgcgtgcctta-3′，將其5′端的7個(gè)堿基做為rt引物粘附序列，可得rt引物5′-gtcgtatccagtgcgtgtcgtggagtcggcaattgcactggatacgacggcattc-3′(如seqidno:2所示)。

(4)hsa-mir-124a-3prt反應(yīng)混合物的配制：各組分比例如表1所示：

表1rt反應(yīng)混合物配制比例

(5)hsa-mir-124a-3prt反應(yīng)

hsa-mir-124a-3prt反應(yīng)體系：rt反應(yīng)混合物7μl、hsa-mir-124a-3p(0.1pmol/μl)5μl、rt引物(100pmol/μl)3μl。

hsa-mir-124a-3prt反應(yīng)程序：16℃30min，42℃30min，85℃5min，4℃保存。

二、hsa-mir-124a-3pqpcr反應(yīng)

(1)qpcr反應(yīng)體系的配制：以hsa-mir-124a-3prt反應(yīng)產(chǎn)物為陽性實(shí)驗(yàn)組、以相同量的rnase-freewater為陰性對(duì)照組，分別配制qpcr反應(yīng)體系(表2)。

表2qpcr反應(yīng)體系

(2)qpcr反應(yīng)程序設(shè)置：如表3所示。

表3qpcr反應(yīng)程序

(3)hsa-mir-124a-3p標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量驗(yàn)證：觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的擴(kuò)增曲線和循環(huán)閾值(cyclethreshold，ct)，驗(yàn)證hsa-mir-124a-3p標(biāo)準(zhǔn)品的完整性。

三、hsa-mir-124a-3prt-qpcr檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和評(píng)價(jià)

將hsa-mir-124a-3p標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為1×10^-1、1×10^-2、1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6pmol/μl等濃度，分別在同樣條件下進(jìn)行qpcr擴(kuò)增反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)品濃度在1×10^-2至1×10^-6pmol/μl范圍時(shí)，其對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線呈典型的對(duì)數(shù)擴(kuò)增(如圖1所示)，且兩相鄰擴(kuò)增曲線的間距較為接近，故以1×10^-2、1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5和1×10^-6pmol/μl這五種濃度的對(duì)數(shù)值(lg值)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)擴(kuò)增曲線的ct值為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖2所示)。從圖中觀察發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的ct值與起始濃度存在良好的線性關(guān)系，經(jīng)計(jì)算可得r²＝0.998>0.98，說明標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性程度符合要求，故將1×10^-2至1×10^-6pmol/μl定為hsa-mir-124a-3prt-qpcr檢測(cè)方法的線性范圍。計(jì)算兩相鄰循環(huán)數(shù)差值分別為3.01、3.46、3.79、3.58，其相鄰循環(huán)稀釋濃度分別為8.06、11.00、13.83、11.96，均值為11.21與標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)際稀釋濃度倍數(shù)10相接近。計(jì)算可得qpcr擴(kuò)增效率為93.3％，介于90％-105％之間，說明反應(yīng)條件已優(yōu)化。

四、hsa-mir-124a-3prt-qpcr方法學(xué)評(píng)價(jià)

分別用建立的hsa-mir-124a-3prt-qpcr方法檢測(cè)hsa-mir-124a-3p標(biāo)準(zhǔn)品為模板的陽性實(shí)驗(yàn)組和相同量的rnase-freewater的陰性對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)該方法能夠重復(fù)且穩(wěn)定檢測(cè)出hsa-mir-124a-3p的最低濃度為1×10^-6pmol/μl。分別在30、35、40循環(huán)數(shù)下用hsa-mir-124a-3prt-qpcr檢測(cè)hsa-mir-124a-3p標(biāo)準(zhǔn)品和rnase-freewater的陰性對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)該方法能夠特異的檢測(cè)出hsa-mir-124a-3p的循環(huán)數(shù)為35(如圖3所示，其中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別設(shè)有2個(gè)平行管)。此外，平行管擴(kuò)增曲線顯示二者ct值差異較小，說明本方法重復(fù)性好。

實(shí)施例2、母體血漿hsa-mir-124a-3p在唐氏綜合征產(chǎn)前篩查中的臨床應(yīng)用

一、血漿中總rna的提取

臨床標(biāo)本收集及分組：收集第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科產(chǎn)前診斷中心20～35歲妊娠健康胎兒的妊娠中期(13-27周)孕婦血漿36例為正常對(duì)照組；確診妊娠ds胎兒的妊娠中期孕婦血漿11例為ds妊娠組；血液標(biāo)本采用edta抗凝，在25℃條件下3000r/min，離心3min后吸取上層血漿，-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。提取血漿中總rna。

二、rt-qpcr反應(yīng)

按照實(shí)施例1中的方法對(duì)提取的血漿rna進(jìn)行rt-qpcr方法檢測(cè)各組臨床標(biāo)本中的hsa-mir-124a-3p的含量。同時(shí)以相同量的rnase-freewater為陰性對(duì)照，加入u6snrnart反應(yīng)產(chǎn)物作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參陽性對(duì)照，每個(gè)樣品設(shè)置2個(gè)平行檢測(cè)管。利用u6snrna內(nèi)參在相同量的樣本中表達(dá)較為一致的特點(diǎn)，對(duì)計(jì)算所得hsa-mir-124a-3p濃度進(jìn)行校正。

三、基于時(shí)間分辨熒光免疫分析的血清唐氏篩查實(shí)驗(yàn)

(1)用碘伏消毒肱靜脈表面皮膚，抽取本研究所有標(biāo)本來源孕婦孕中期空腹靜脈血5ml，不抗凝，在25℃條件下3000r/min，離心3min，吸取上層血清，-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

(2)在96孔微孔板第一孔中加入βhcg標(biāo)準(zhǔn)品25μl，然后依次分別加入25μl待測(cè)血清，所有加樣孔內(nèi)均加入抗βhcg試劑稀釋液200μl。

(3)另取一96孔微孔板，在第一孔中加入afp標(biāo)準(zhǔn)品25μl，然后依次分別加入25μl待測(cè)血清，所有加樣孔內(nèi)均加入抗afp試劑稀釋液200μl。

(4)將兩個(gè)微孔板緩慢震蕩3h，震蕩期間分別洗板6次。

(5)再取一96孔微孔板，第一孔中加入ue3標(biāo)準(zhǔn)品100μl，然后依次分別加入100μl待測(cè)血清，緩慢震蕩15min后所有加樣孔內(nèi)均加入100μlue3示蹤稀釋液，緩慢震蕩1h，震蕩期間分別洗板6次。

(6)在三個(gè)微孔板的反應(yīng)孔中依次加入增強(qiáng)液200μl，緩慢震蕩5min，預(yù)熱時(shí)間分辨免疫熒光分析儀15min后，上機(jī)檢測(cè)afp、βhcg和ue3的濃度。

(7)篩查報(bào)告：將孕婦的胎數(shù)，人種，年齡，體重，孕周，是否胰島素依賴型糖尿病，afp、hcg和ue3檢查結(jié)果輸入產(chǎn)前篩查軟件，得到唐氏篩查報(bào)告。記錄血清唐氏篩查報(bào)告為ds妊娠高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)的孕婦信息。

四、染色體核型分析

(1)以0.6mm內(nèi)徑的長(zhǎng)針，在超聲波的引導(dǎo)下，穿過孕婦腹部，經(jīng)過子宮壁，到達(dá)羊膜腔，然后抽取20ml羊水，1500r/min，離心10min，吸取上清液作其他檢驗(yàn)，將余下0.5ml沉淀輕柔吹打混勻后接種在含有0.9ml小牛血清和2.1mlf10培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，搖勻，37℃培養(yǎng)6d后更換培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)6d后加入秋水仙堿，搖勻，使秋水仙堿的終濃度達(dá)到3μg/ml，繼續(xù)37℃孵育4h。

(2)取出細(xì)胞懸液，0.002％的胰蛋白酶溶液2ml中消化5min，1500r/min，離心5min，棄去上清后加入0.4％枸櫞酸鈉和0.4％氯化鉀比例為1:1溶液5滴，37℃孵育5min。

(3)取出離心管，加入甲醇和冰醋酸比例為3:1的固定液7滴，輕柔吹打混勻，1500r/min，離心5min，棄去上清后再加入甲醇和冰醋酸比例為3:1的固定液4ml，輕柔吹打混勻，靜置40min，再次1500r/min，離心5min，棄去上清后加入甲醇和冰醋酸比例為3:1的固定液2ml，輕柔吹打混勻，靜置20min。1500r/min，離心5min，棄去上清后將加3滴固定液將沉淀制成混懸液。

(4)將2滴上述混懸液滴在處理后的載玻片上，輕柔吹氣，使混懸液均勻分布并晾干。將載玻片置于90℃烤箱拷片45min后放入0.002％的胰蛋白酶溶液中消化60s，隨后用giemsa染液染色5min，流水沖洗載玻片并在空氣中晾干。

(5)在顯微鏡下觀察染色體條帶，并對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)。其中46，xn表示染色體核型正常的胎兒，n代表x或y染色體中的一條。47，xn，+21代表多了一條21號(hào)染色體的ds胎兒。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

(1)將所有的檢測(cè)結(jié)果錄入excel表，建立數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用spss23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)健康胎兒和ds患兒母體血漿hsa-mir-124a-3p檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)算二者均數(shù)倍值，將所得結(jié)果與前期研究結(jié)果相比較。

(2)以染色體核型分析作為金標(biāo)準(zhǔn)，將hsa-mir-124a-3p的檢測(cè)結(jié)果以10^-8至10^-7pmol/μl作為程度1，10^-7至10^-6pmol/μl作為程度2，依次類推，以10倍濃度區(qū)間內(nèi)結(jié)果出現(xiàn)的次數(shù)作為頻數(shù)，作roc曲線，選擇約登指數(shù)(youdenindex，yi)最大值所對(duì)應(yīng)的頻數(shù)對(duì)應(yīng)的hsa-mir-124a-3p濃度范圍作為rt-qpcr檢測(cè)方法預(yù)測(cè)孕中期ds高危風(fēng)險(xiǎn)的區(qū)間值。

(3)以染色體核型分析作為金標(biāo)準(zhǔn)，分別作唐氏篩查和rt-qpcr檢測(cè)方法預(yù)測(cè)ds風(fēng)險(xiǎn)的結(jié)果作roc曲線，比較二者預(yù)測(cè)ds風(fēng)險(xiǎn)的價(jià)值。

六、結(jié)果

1、健康胎兒和ds胎兒母體血漿hsa-mir-124a-3p檢測(cè)結(jié)果的比較

利用hsa-mir-124a-3prt-qpcr檢測(cè)方法分別對(duì)36例健康胎兒和11例ds患兒母體血漿hsa-mir-124a-3p的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)(表4)。已知hsa-mir-124a-3prt-qpcr檢測(cè)方法的檢測(cè)下限為1×10^-6pmol/μl，因?qū)嶋H檢測(cè)了200μl血漿中hsa-mir-124a-3p濃度，故臨床應(yīng)用檢測(cè)下限為1×10^-8pmol/μl。若將正常組低于檢測(cè)下限的值假定為1×10^-8pmol/μl，對(duì)正常組和ds組hsa-mir-124a-3p濃度進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)可得：p＝0.021<0.05，說明正常組和ds組hsa-mir-124a-3p濃度差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，正常組hsa-mir-124a-3p濃度顯著小于ds組hsa-mir-124a-3p濃度，與前期研究結(jié)果符合。另外，經(jīng)計(jì)算可得正常組和ds組hsa-mir-124a-3p濃度均值差異倍數(shù)為：1659.7459，對(duì)比前期研究差異倍數(shù)918.7662，本研究所得差異倍數(shù)偏大，分析原因可能是與前期研究采用檢測(cè)方法不同所致。

表4健康胎兒和ds患兒母體血漿hsa-mir-124a-3p濃度

2、hsa-mir-124a-3p預(yù)測(cè)ds妊娠高危風(fēng)險(xiǎn)的區(qū)間值

以染色體核型分析作為金標(biāo)準(zhǔn)，將hsa-mir-124a-3p10^-8至10^-7pmol/μl作為程度1，10^-7至10^-6pmol/μl作為程度2，依次類推，以10倍濃度區(qū)間內(nèi)結(jié)果出現(xiàn)次數(shù)作為頻數(shù)繪制表5，再根據(jù)表5結(jié)果作對(duì)應(yīng)的roc曲線(圖4)，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果可得該roc曲線的標(biāo)準(zhǔn)誤為0.042，p＝0.000，95％的置信區(qū)間為(0.833，0.998)，roc曲線下面積為0.915。計(jì)算可得該roc曲線最大的yi為0.735，而其所對(duì)應(yīng)的程度為4.5，說明hsa-mir-124a-3p濃度在10^-5至10^-3pmol/μl時(shí)對(duì)ds的診斷價(jià)值最大，故將10^-5至10^-3pmol/μl定為hsa-mir-124a-3prt-qpcr檢測(cè)方法預(yù)測(cè)ds高危風(fēng)險(xiǎn)的區(qū)間值。

表5rt-qpcr檢測(cè)結(jié)果

3、hsa-mir-124a-3prt-qpcr檢測(cè)方法與唐氏篩查的比較

由上述結(jié)果分析可知，將孕中期婦女血漿hsa-mir-124a-3p濃度在10^-5至10^-3pmol/μl區(qū)間者定為ds高風(fēng)險(xiǎn)。以此作為ds妊娠高危風(fēng)險(xiǎn)區(qū)間值，并以染色體核型分析作為金標(biāo)準(zhǔn)，將血清唐氏篩查結(jié)果與hsa-mir-124a-3p檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較(表6)。同時(shí)分別對(duì)hsa-mir-124a-3p檢測(cè)和唐氏篩查的ds風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)情況作roc曲線(圖5)。其中rt-qpcr法相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)誤為0.093，p＝0.006，95％的置信區(qū)間為(0.594，0.959)，曲線下面積為0.777，表示rt-qpcr法對(duì)ds風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)中等。而唐氏篩查相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)誤為0.097，p＝0.171，95％置信區(qū)間為(0.448，0.827)，曲線下面積為0.638，表示其風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)價(jià)值較低。結(jié)果提示hsa-mir-124a-3p在ds妊娠風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的價(jià)值比常規(guī)血清唐氏篩查方法高。

表6血清唐氏篩查和hsa-mir-124a-3p檢測(cè)的結(jié)果比較

序列表

<110>中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院

<120>人hsa-mir-124a-3ppcr檢測(cè)方法及其在ds妊娠風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)中的應(yīng)用

<130>1

<160>2

<210>1

<211>20

<212>rna

<213>人工序列

<223>hsa-mir-124a-3p

<400>1

uaaggcacgcggugaaugcc20

<210>2

<211>55

<212>dna

<213>人工序列

<223>rt引物

<400>2

gtcgtatccagtgcgtgtcgtggagtcggcaattgcactggatacgacggcattc55