本發(fā)明涉及凈水技術(shù)領(lǐng)域，具體是一株用于脫色和絮凝的海洋細菌及其脫色絮凝劑制法。

背景技術(shù)：

絮凝技術(shù)被廣泛應(yīng)用在給水、廢水絮凝凈化、發(fā)酵工業(yè)、固液分離等方面，絮凝效果取決于選取的絮凝劑的種類。目前，用于水處理行業(yè)的絮凝劑主要有兩大類：以鋁系、鐵系及其聚合物為代表的無機絮凝劑和以pam及其衍生物為代表的有機高分子絮凝劑。它們憑借其在使用過程中絮凝效果好且成本低得到廣泛的應(yīng)用，但是它們對環(huán)境存在不安全性已引起人們足夠的重視。鋁系絮凝劑中鋁離子易引起老年性癡呆癥；鐵系絮凝劑中鐵離子對金屬有腐蝕作用，容易引起處理后水中帶有顏色，增加污泥處理負荷；pam的單體有很強的神經(jīng)毒性，有很強的致癌性。因此，目前眾多學(xué)者、專家開發(fā)研究被稱為第三代絮凝劑的新型絮凝劑---微生物絮凝劑。微生物絮凝劑是一類由微生物產(chǎn)生的具有絮凝活性的高分子物質(zhì)，具有生物分解性和環(huán)境安全性，主要由蛋白質(zhì)、多糖、纖維素、脂類和dna等組成。

微生物絮凝劑生產(chǎn)開發(fā)中存在絮凝劑產(chǎn)生菌的獲得的難題：目前應(yīng)用的絮凝劑微生物分別屬于細菌、放線菌、桿菌和酵母菌等，絮凝菌不同，產(chǎn)生的絮凝劑的分子結(jié)構(gòu)也不同。因此，獲得能高效產(chǎn)生絮凝劑的菌株是微生物絮凝劑開發(fā)研究的中心。

現(xiàn)有技術(shù)如授權(quán)公告號為cn101580550b的中國發(fā)明專利，公開了一株好氧羅氏菌屬菌株代謝產(chǎn)物胞外多糖、制法和用途。從中國渤海海域野生菲律賓蛤仔黏附污泥中分離獲得的好氧菌株zht4-13、鑒定為羅氏菌屬(ruthiasp.)。經(jīng)種子培養(yǎng)、擴大培養(yǎng)，其發(fā)酵液經(jīng)乙醇沉淀離心分離得到細胞外多糖mbf4-13。經(jīng)測定出該細胞外多糖mbf4-13具有較高的絮凝活性，對高嶺土的fr值達到80％以上；對六價鉻離子去除率達69.3％；對高濃度廢水脫色具有較高活性，對亞甲基藍、墨水藍、孔雀石綠、結(jié)晶紫的脫色率達86.11％、99.49％和97.84％；對活性污泥的性能及結(jié)構(gòu)也有明顯改善作用?，F(xiàn)在能高效產(chǎn)生絮凝劑的菌株種類較少，還需要繼續(xù)分離篩選出新的菌種。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單，制備的脫色絮凝劑脫色率高，性能穩(wěn)定，絮凝效果好的脫色絮凝劑制法。

本發(fā)明針對背景技術(shù)提到的問題，采用的技術(shù)方案為：一株需氧活性海洋細菌jp是從菲律賓蛤仔黏附淤泥中分離獲得，該菌株合適的生長鹽度范圍為1%-15%。依據(jù)《bergy’smanualofsystematicalbacteriology》(brenner,d.j.,krieg,n.r.,staley,j.t.&garrity,g.m.(eds.,2005),2nded.,vol.2,springer-verlag,newyork,ny.)，鑒定為pseudoalteromonassp，即交替假單胞菌，具體為水蛹交替假單胞菌（pseudoalteromonasundina）。已于2016年8月29日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（其簡稱為cgmcc），保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為：cgmccno.12914。

海洋菌株jp的16srdna全基因（1279bp）已向美國國家生物技術(shù)信息中心（ncbi）的genbank基因序列數(shù)據(jù)庫提交，登陸號為kx702268。其全序列如下：

aatgcttgggaacatgccttgaggtgggggacaacagttggaaacgactgctaataccgcataatgtctacggaccaaagggggcttcggctctcgcctttagattggcccaagtgggattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgatccctagctggtttgagaggatgatcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcactttcagtcaggaggaaaggttagtagttaatacctgctagctgtgacgttactgacagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcgagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgtacgcaggcggtttgttaagcgagatgtgaaagccccgggctcaacctgggaactgcatttcgaactggcaaactagagtgtgatagagggtggtagaatttcaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctgaaggaataccgatggcgaaggcagccacctgggtcaacactgacgctcatgtacgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtctactagaagctcggaacctcggttctgtttttcaaagctaacgcattaagtagaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctacacttgacatacagagaacttaccagagatggtttggtgccttcgggaactctgatacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccctatccttagttgctagcaggtaatgctgagaactctaaggagactgccggtgataaaccggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatggcccttacgtgtagggctacacacgtgctacaatggcgcatacagagtgctgcgaacctgcgaaggtaagcgaatcacttaaagtgcgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcgtatcagaatgacgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcc。

一株用于脫色和絮凝的海洋細菌的篩選方法為：采集新鮮菲律賓蛤仔，放入無菌水中吐泥，取1ml泥，采用梯度稀釋倒平板分離和劃線純化，經(jīng)活性測試篩選出具有高絮凝和脫色活性的菌株jp。

一株用于脫色和絮凝的海洋細菌的脫色絮凝劑制法，包括以下步驟：

種子液培養(yǎng)：將保藏號為cgmccno.12914的海洋細菌接種于斜面培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)后，培養(yǎng)溫度為22-27℃，培養(yǎng)時間為24-72h。加入無菌水，培養(yǎng)基與無菌水體積比為1:0.7-1.3，振蕩制得種子液。上述種子液的培養(yǎng)可將菌種從保藏狀態(tài)恢復(fù)到活力旺盛的生長繁殖狀態(tài)，并且能得到數(shù)量充足的菌種；

擴大發(fā)酵培養(yǎng)：在每100ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基接入0.2-0.5ml種子液，恒溫搖床培養(yǎng)。發(fā)酵溫度為22-27℃，搖床速率為120-140r/min，發(fā)酵培養(yǎng)時間為3-4d。在發(fā)酵培養(yǎng)期間，菌種利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分進行旺盛的新陳代謝，產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物---胞外多糖；

胞外多糖提?。簩l(fā)酵完成的菌液離心，取上清液，在上清液中加入乙醇，乙醇體積為上清液體積的3-6倍。在2-5℃下靜置10-18h，離心取沉淀，真空干燥得胞外多糖粗制品。親水的多糖的水化層被乙醇破壞，多糖在水中的溶解度大幅下降，以沉淀形式與其他成分分離，同時多糖的活性不會被破壞；

精制：在胞外多糖粗制品中加水，粗制品體積為水的1-2倍。振蕩后加入乙醇，乙醇體積為水溶液體積的3-6倍，乙醇溫度為2-5℃。靜置后離心取沉淀，真空干燥得到海洋細菌脫色絮凝劑。

作為優(yōu)選，斜面培養(yǎng)基成分及其濃度為：葡萄糖10-25g/l、尿素0.43-0.52g/l、硫酸銨0.18-0.24g/l、酵母膏0.4-0.6g/l、磷酸氫二鉀1.25-5g/l、磷酸二氫鉀0.5-2g/l、瓊脂12-16g/l和余量陳化海水或人工海水；調(diào)節(jié)ph為7.2-7.4，110-120℃高壓滅菌26-33min。其中，人工海水配方為：氯化鈉25.0g/l、氯化鎂2.0g/l、硫酸鎂3.2g/l、氯化鈣1.2g/l、碳酸氫鈉0.2g/l、氯化鉀0.7g/l、溴化鈉0.06g/l、硼酸0.06g/l、硅酸鈉0.0024g/l、磷酸0.002g/l、六氯化二鋁0.013g/l、氨水0.002g/l、硝酸鋰0.0013g/l、蒸餾水余量。斜面培養(yǎng)基去除瓊脂即為液體發(fā)酵培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基不僅能提供適合本發(fā)明海洋細菌適宜的環(huán)境，還能提供菌種生長繁殖所需的碳源、氮源及生長因子，菌種的繁殖速度快，并且能誘導(dǎo)菌種分泌產(chǎn)生大量的胞外多糖，降低產(chǎn)品成本。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明從菲律賓蛤仔黏附淤泥中分離純化并篩選出一株用于脫色和絮凝的海洋細菌，鑒定為交替假單胞菌（pseudoalteromonassp），并提取胞外多糖制得脫色絮凝劑。本發(fā)明制備的脫色絮凝劑脫色效果很好，對高嶺土的絮凝率達到90％以上；對高濃度廢水脫色具有較高活性，對亞甲基藍、墨水藍、孔雀石綠、結(jié)晶紫的脫色率達92％以上、99％以上和98％以上；絮凝劑性質(zhì)穩(wěn)定，制備步驟簡單，原料成本低廉，經(jīng)濟效益高，可大規(guī)模生產(chǎn)。

具體實施例

下面通過實施例對本發(fā)明方案作進一步說明：

實施例1：

一株用于脫色和絮凝的海洋細菌，鑒定為交替假單胞菌（pseudoalteromonassp），具體為水蛹交替假單胞菌（pseudoalteromonasundina），于2016年8月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為cgmccno.12914。

一株用于脫色和絮凝的海洋細菌的篩選方法為：采集新鮮菲律賓蛤仔，放入無菌水中吐泥，取1ml泥，采用梯度稀釋倒平板分離和劃線純化，經(jīng)活性測試篩選出具有高絮凝和脫色活性的菌株jp。

一株用于脫色和絮凝的海洋細菌的脫色絮凝劑制法，包括以下步驟：

1）種子液培養(yǎng)：將保藏號為cgmccno.12914的海洋細菌接種于斜面培養(yǎng)基，于25℃恒溫培養(yǎng)36h。加入等體積無菌水，振蕩制得種子液。上述種子液的培養(yǎng)可將菌種從保藏狀態(tài)恢復(fù)到活力旺盛的生長繁殖狀態(tài)，并且能得到數(shù)量充足的菌種；

2）擴大發(fā)酵培養(yǎng)：在每100ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基接入0.4ml種子液，于25℃恒溫搖床培養(yǎng)3.5d，搖床速率為130r/min。在發(fā)酵培養(yǎng)期間，菌種利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分進行旺盛的新陳代謝，產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物---胞外多糖；

3）胞外多糖提取：將發(fā)酵完成的菌液離心，取上清液，在上清液中加入5倍體積的乙醇。在4℃下靜置16h，離心取沉淀，真空干燥得胞外多糖粗制品。親水的多糖的水化層被乙醇破壞，多糖在水中的溶解度大幅下降，以沉淀形式與其他成分分離，同時多糖的活性不會被破壞；

4）精制：在胞外多糖粗制品中加等體積水，振蕩溶解完全后加入5倍體積乙醇，乙醇溫度為4℃。靜置后離心取沉淀，真空干燥得到海洋細菌脫色絮凝劑。

斜面培養(yǎng)基成分及其濃度為：培養(yǎng)基成分及其濃度為葡萄糖18g/l、尿素0.5g/l、硫酸銨0.2g/l、酵母膏0.5g/l、磷酸氫二鉀3.6g/l、磷酸二氫鉀1.6g/l、瓊脂15g/l和余量陳化海水或人工海水；調(diào)節(jié)ph為7.3，115℃高壓滅菌30min。其中，人工海水配方為：氯化鈉25.0g/l、氯化鎂2.0g/l、硫酸鎂3.2g/l、氯化鈣1.2g/l、碳酸氫鈉0.2g/l、氯化鉀0.7g/l、溴化鈉0.06g/l、硼酸0.06g/l、硅酸鈉0.0024g/l、磷酸0.002g/l、六氯化二鋁0.013g/l、氨水0.002g/l、硝酸鋰0.0013g/l、蒸餾水余量。斜面培養(yǎng)基去除瓊脂即為液體發(fā)酵培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基不僅能提供適合本發(fā)明海洋細菌適宜的環(huán)境，還能提供菌種生長繁殖所需的碳源、氮源及生長因子，菌種的繁殖速度快，并且能誘導(dǎo)菌種分泌產(chǎn)生大量的胞外多糖，降低產(chǎn)品成本。

實施例2：

一株用于脫色和絮凝的海洋細菌，鑒定為交替假單胞菌（pseudoalteromonassp），具體為水蛹交替假單胞菌（pseudoalteromonasundina），于2016年8月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為cgmccno.12914。

一株用于脫色和絮凝的海洋細菌的篩選方法為：采集新鮮菲律賓蛤仔，放入無菌水中吐泥，取1ml泥，采用梯度稀釋倒平板分離和劃線純化，經(jīng)活性測試篩選出具有高絮凝和脫色活性的菌株jp。

一株用于脫色和絮凝的海洋細菌的脫色絮凝劑制法，包括以下步驟：

1）種子液培養(yǎng)：將保藏號為cgmccno.12914的海洋細菌接種于斜面培養(yǎng)基，于25℃恒溫培養(yǎng)36h。加入1.2倍體積無菌水，振蕩制得種子液。斜面培養(yǎng)基成分及其濃度為：葡萄糖20g/l、尿素0.5g/l、硫酸銨0.2g/l、酵母膏0.45g/l、磷酸氫二鉀2.8g/l、磷酸二氫鉀1.3g/l、瓊脂14g/l和余量陳化海水或人工海水；調(diào)節(jié)ph為7.3，115℃高壓滅菌30min。其中，人工海水配方為：氯化鈉25.0g/l、氯化鎂2.0g/l、硫酸鎂3.2g/l、氯化鈣1.2g/l、碳酸氫鈉0.2g/l、氯化鉀0.7g/l、溴化鈉0.06g/l、硼酸0.06g/l、硅酸鈉0.0024g/l、磷酸0.002g/l、六氯化二鋁0.013g/l、氨水0.002g/l、硝酸鋰0.0013g/l、蒸餾水余量；

2）擴大發(fā)酵培養(yǎng)：在每100ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基接入0.4ml種子液，于25℃恒溫搖床培養(yǎng)3d，搖床速率為130r/min。液體發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖20g/l、尿素0.5g/l、硫酸銨0.2g/l、酵母膏0.45g/l、磷酸氫二鉀2.8g/l、磷酸二氫鉀1.3g/l和余量陳化海水或人工海水；調(diào)節(jié)ph為7.3，115℃高壓滅菌30min。其中，人工海水配方為：氯化鈉25.0g/l、氯化鎂2.0g/l、硫酸鎂3.2g/l、氯化鈣1.2g/l、碳酸氫鈉0.2g/l、氯化鉀0.7g/l、溴化鈉0.06g/l、硼酸0.06g/l、硅酸鈉0.0024g/l、磷酸0.002g/l、六氯化二鋁0.013g/l、氨水0.002g/l、硝酸鋰0.0013g/l、蒸餾水余量；

3）胞外多糖提?。簩l(fā)酵完成的菌液離心，取上清液，在上清液中加入5.3倍體積的乙醇。在4℃下靜置14h，離心取沉淀，真空干燥得胞外多糖粗制品；

4）精制：在胞外多糖粗制品中加1.2倍體積水，振蕩溶解完全后加入5.3倍體積乙醇，乙醇溫度為4℃。靜置后離心取沉淀，真空干燥得到海洋細菌脫色絮凝劑。

實施例3：絮凝活性的測定

采用對高嶺土懸濁液的絮凝活性測試法(r.kurane，k.takeda，t.suzuki.screeningandcharacteristeristicsofmicrobialflocculants.agric.biol.chem.1986：2301-2307)取5g/l的高嶺土懸濁液93ml，加入5ml1％(m/v)cacl2做助凝劑，加入2ml實施例2樣品，調(diào)節(jié)ph值為9，混合快速攪拌1min，再慢速攪拌5min，靜置10min，取水平面下1cm處混合液，可見分光光度計測550nm下吸光度a，同時以2ml蒸餾水代替樣品作為對照，測吸光度b，計算絮凝率，fr(％)＝(a-b)/a×100％。則海洋細菌脫色絮凝劑對高嶺土懸濁液的絮凝率為91.34％。

實施例4：脫色活性測定

取10ml亞甲基藍和孔雀石綠(10mg/l)以及10ml結(jié)晶紫(20mg/l)于大試管中，加入1ml濃度為2g/l的實施例2樣品，漩渦振蕩1min，調(diào)節(jié)溶液ph值為9，靜置30min后取水平面下1cm處溶液，測定相應(yīng)染料在最大吸收波長處的吸光度，計算脫色率，dr(％)＝(a-a0)/a×100％。則海洋細菌脫色絮凝劑對亞甲基藍、孔雀石綠和結(jié)晶紫的脫色率分別為92.13％、99.35％和98.44％。

實施例5：活性污泥性能改善實驗

在新鮮活性污泥中加入實施例2樣品，投加量為2g/l，攪拌均勻，適量曝氣，2天后測sv30、svi，并做活性污泥壓片顯微觀察污泥中微生物種類。實驗結(jié)果表明sv30、svi分別由原活性污泥的390、80.42降至340、74.13，說明活性污泥沉降性能有了一定的提高。顯微觀察表明絮凝培養(yǎng)后菌膠團結(jié)構(gòu)變得更緊密、絲狀菌相對減少、出現(xiàn)了能顯示良好水質(zhì)的指示生物-輪蟲等原生動物，表明該微生物絮凝劑的投加對活性污泥起到了良好的改善性能及結(jié)構(gòu)的作用。

本發(fā)明的操作步驟中的常規(guī)操作為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在此不進行贅述。

以上所述的實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行了詳細說明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補充或類似方式替代等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>浙江海洋大學(xué)

<120>一株用于脫色和絮凝的海洋細菌及其脫色絮凝劑制法

<130>1

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1279

<212>dna

<213>海洋菌株pseudoalteromonasundinajp

<400>1

aatgcttgggaacatgccttgaggtgggggacaacagttggaaacgactgctaataccgc60

ataatgtctacggaccaaagggggcttcggctctcgcctttagattggcccaagtgggat120

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