本發(fā)明涉及分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)，具體地說(shuō)，涉及一種微流控snp芯片檢測(cè)綿羊fecb基因多態(tài)性的方法。

背景技術(shù)：

家畜的產(chǎn)仔數(shù)是經(jīng)濟(jì)價(jià)值十分巨大的數(shù)量性狀。對(duì)綿羊產(chǎn)羔數(shù)的選擇不僅受到性別和年齡的限制，而且綿羊的產(chǎn)羔數(shù)是一個(gè)遺傳力很低的數(shù)量性狀，因此難以用常規(guī)的育種技術(shù)來(lái)改良產(chǎn)羔數(shù)性狀。標(biāo)記輔助選擇能夠通過(guò)影響選擇的時(shí)間、選擇的強(qiáng)度和準(zhǔn)確性而極大地提高這類低遺傳力性狀的選擇功效，而找到與這些數(shù)量性狀基因座相連鎖的分子遺傳標(biāo)記，則是實(shí)現(xiàn)標(biāo)記輔助選擇的先決條件。

上世紀(jì)50年代，seears兄弟選育出一群可以生多胞胎的澳大利亞美利奴(booroolamerino,bm)，并報(bào)道這種產(chǎn)多胞胎的美利奴綿羊比其他群體的美利奴綿羊產(chǎn)羔數(shù)提高了30％。該基因已被綿羊和山羊遺傳命名委員會(huì)定名為fecb(fecunditybooroola)。montgomery等用遺傳連鎖和微衛(wèi)星標(biāo)記定位的方法將fecb基因定位于booroola羊的第6號(hào)常染色體上。最終研究者發(fā)現(xiàn)綿羊fecb的影響是由于骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1b(bonemorphogeneticproteinreceptor1b,bmpr1b)基因編碼區(qū)發(fā)生了a746g突變，從而引起第249位氨基酸由谷氨酰胺變?yōu)榫彼?q249r)。1個(gè)fec^b拷貝增加排卵數(shù)1.3-1.6枚，母羊產(chǎn)羔數(shù)增加0.9-1.2只；2個(gè)fec^b拷貝增加排卵數(shù)2.7-3.0枚，母羊產(chǎn)羔數(shù)增加1.1-1.7只。

由于fecb基因能提高綿羊繁殖力，可帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)利益，因此各地展開(kāi)了對(duì)不同綿羊品種fecb基因檢測(cè)。目前研究表明fecb突變存在于世界各地各種高繁殖力綿羊品種中。我國(guó)的湖羊和小尾寒羊均攜帶此突變。傳統(tǒng)的fecb基因檢測(cè)方法，大多采用pcr-rflp(polymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism)和pcr-sscp(polymerasechainreaction-singlestrandconformationpolymorphism)檢測(cè)方法，這些方法通量較低，程序繁多，較難實(shí)現(xiàn)高通量自動(dòng)化測(cè)定。目前新開(kāi)發(fā)出的taqmanmgb以及snapshot這些高通量分型技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)fecb基因的快速準(zhǔn)確的高通量分型，但是存在成本偏高的問(wèn)題。

單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(snp)主要是指在基因組脫氧核酸(dna)序列上由單個(gè)脫氧核苷酸的變異所引起的dna片段的多態(tài)性。snp的多態(tài)性僅涉及到單個(gè)堿基的變異，表現(xiàn)的形式有替換、插入和缺失等。snp的檢測(cè)方法，目前常用的包括，sanger測(cè)序、dna芯片、飛行時(shí)間質(zhì)譜、以及最新的高通量二代測(cè)序等技術(shù)。通過(guò)檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記檢測(cè)基因型是近些年興起的一種方法。snp作為遺傳標(biāo)記已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于基因定位、克隆、遺傳育種以及遺傳多樣性等研究領(lǐng)域。分子標(biāo)記在動(dòng)物育種中的應(yīng)用已有一段時(shí)間，相比傳統(tǒng)育種方法，分子育種大大加快了選育效率，節(jié)省了育種時(shí)間，使得育種學(xué)家可以在分子水平上不斷探索并選育更優(yōu)良的家畜品種。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種利用微流控snp芯片檢測(cè)綿羊fecb基因多態(tài)性的方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種檢測(cè)綿羊多胎主效基因fecb基因型的方法，其是對(duì)綿羊第6號(hào)染色體上第29382188bp位點(diǎn)(nc_019463.1，基于綿羊基因組序列信息版本號(hào)oar_v3.1，2012年12月)的核苷酸進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判定綿羊fecb基因?yàn)閍a、ag或gg。本發(fā)明中單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)所采用的方法為微流控snp芯片法。

本發(fā)明首先提供一種利用微流控snp芯片檢測(cè)綿羊fecb基因多態(tài)性的方法，包括以下步驟：

(1)提取待測(cè)綿羊的基因組dna；

(2)以待測(cè)綿羊的基因組dna為模板，利用引物探針組合，進(jìn)行普通pcr反應(yīng)；所述引物探針組合含有一對(duì)引物和2條探針，

所述引物的核苷酸序列如下：

正向引物：5’-ccagctggttccgagagaca-3’

反向引物：5’-cttatactcacccaagatgttttcatg-3’

所述探針的核苷酸序列如下：

p-g：5’-f1-aaatatatcggacggtgtt-mgb-3’

p-a：5’-f2-aaatatatcagacggtgttg-mgb-3’

其中，f1和f2為不同顏色的熒光報(bào)告基團(tuán)；

(3)pcr儀運(yùn)行停止后，取出芯片，將芯片放入luxscan-10k/d掃描儀，進(jìn)行熒光掃描。

步驟(2)中f1為fam，f2為hex。

步驟(2)中普通pcr反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以1μl，即為：基因組dna0.2μl，2×mastermix0.5μl，10μmol/l正向引物0.05μl，10μmol/l反向引物0.05μl；10μmol/l探針p-g0.025μl，10μmol/l探針p-a0.025μl，去離子水補(bǔ)齊至1μl。

步驟(2)中普通pcr反應(yīng)的擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃10min；95℃15sec，60℃1min，共40個(gè)循環(huán)；37℃1min。

本發(fā)明提供了上述方法在綿羊分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了上述方法在選育繁殖力高的綿羊品種中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了上述方法在綿羊種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種引物探針組合，含有一對(duì)引物和2條探針，

所述引物的核苷酸序列如下：

正向引物：5’-ccagctggttccgagagaca-3’

反向引物：5’-cttatactcacccaagatgttttcatg-3’

所述探針的核苷酸序列如下：

p-g：5’-f1-aaatatatcggacggtgtt-mgb-3’

p-a：5’-f2-aaatatatcagacggtgttg-mgb-3’

其中，f1和f2為不同顏色的熒光報(bào)告基團(tuán)。

本發(fā)明提供了上述引物探針組合在利用微流控snp芯片技術(shù)檢測(cè)綿羊fecb基因多態(tài)性中的應(yīng)用，

本發(fā)明提供了上述引物探針組合在利用微流控snp芯片技術(shù)篩選高繁殖力綿羊品種中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了上述引物探針組合在利用微流控snp芯片技術(shù)在改良綿羊種質(zhì)資源中的應(yīng)用。

微流控snp芯片是通過(guò)把生物樣品的反應(yīng)和檢測(cè)等基本操作單元集成到一塊小型芯片上，基于微流控管道的方式，輕松完成snp分型的全過(guò)程。其含有進(jìn)/出樣孔、進(jìn)樣管道、反應(yīng)孔三部分，可實(shí)現(xiàn)每個(gè)反應(yīng)孔形成一個(gè)獨(dú)立的pcr體系，具有試劑消耗小、反應(yīng)速度快、檢測(cè)靈活、對(duì)實(shí)驗(yàn)室無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明提供的利用微流控snp芯片檢測(cè)綿羊fecb基因多態(tài)性的方法，能高通量檢測(cè)a、g位點(diǎn)，結(jié)果容易判讀。與傳統(tǒng)的pcr-rflp檢測(cè)fecb基因等方法相比，減少了手動(dòng)操作過(guò)程，并在簡(jiǎn)化操作的同時(shí)，大大縮短了檢測(cè)周期，提高了檢測(cè)效率。同時(shí)微流控snp芯片方法反應(yīng)體系降低到1μl，對(duì)探針的消耗量大幅降低，顯著降低了試劑成本。本發(fā)明使用的引物和探針特異性強(qiáng)，不會(huì)受到其他基因的干擾，降低了pcr產(chǎn)物污染引起假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)，并且結(jié)果判讀更容易?？蓪?duì)fecb基因的snp位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，在對(duì)羊進(jìn)行大規(guī)模分子育種中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中利用微流控snp芯片法用第1組的引物探針組合對(duì)fecb基因的三種基因型，即gg、aa和ag的檢測(cè)結(jié)果。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中第2組的引物探針組合對(duì)fecb基因的三種基因型的分型檢測(cè)結(jié)果。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中第3組的引物探針組合對(duì)fecb基因的三種基因型的分型檢測(cè)結(jié)果。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1中第4組的引物探針組合對(duì)fecb基因的三種基因型的分型檢測(cè)結(jié)果。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例1中第5組的引物探針組合對(duì)fecb基因的三種基因型的分型檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件。

實(shí)施例1針對(duì)綿羊fecb基因snp位點(diǎn)的檢測(cè)引物和探針的設(shè)計(jì)

針對(duì)綿羊第6號(hào)染色體上第29382188bp位點(diǎn)(nc_019463.1，基于綿羊基因組序列信息版本號(hào)oar_v3.1，2012年12月)的核苷酸進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性a/g，設(shè)計(jì)了以下引物和探針組合，采用微流控snp芯片檢測(cè)綿羊fecb基因多態(tài)性。

通過(guò)對(duì)fecb基因的多態(tài)性位點(diǎn)序列共設(shè)計(jì)了5對(duì)引物和探針，在探針的5’分別標(biāo)記不同顏色的熒光報(bào)告基團(tuán)。

所述引物1的核苷酸序列如下：

正向引物：5’-ccagctggttccgagagaca-3’

反向引物：5’-cttatactcacccaagatgttttcatg-3’

所述探針1的核苷酸序列如下：

p-g：5’-fam-aaatatatcggacggtgtt-mgb-3’

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所述引物2的核苷酸序列如下：

正向引物：5’-ctaatacagacttatactcacccaagatgt-3’

反向引物：5’-ttcactacagaggaggccagct-3’

所述探針2的核苷酸序列如下：

p-g：5’-fam-catgcctcatcaacaccgtccgatatattt-mgb-3’

p-a：5’-hex-tcatgcctcatcaacaccgtctgatatatttc-mgb-3’

所述引物3的核苷酸序列如下：

正向引物：5’-cacccaagatgttttcatgcct-3’

反向引物：5’-tacagaggaggccagctggtt-3’

所述探針3的核苷酸序列如下：

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p-a：5’-hex-cgagagacagaaatatatcggacggtgtt-mgb-3’

所述引物4的核苷酸序列如下：

正向引物：5’-ctgaacatcnctaatacagacttatactca-3’

反向引物：5’-cttcactacagaggaggccagct-3’

所述探針4的核苷酸序列如下：

p-g：5’-fam-ttttcatgcctcatcaacaccgtccgatata-mgb-3’

p-a：5’-hex-tgttttcatgcctcatcaacaccgtctgata-mgb-3’

所述引物5的核苷酸序列如下：

正向引物：5’-cccaagatgttttcatgcctca-3’

反向引物：5’-ctgtgaaagtgttcttcactacagagga-3’

所述探針5的核苷酸序列如下：

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經(jīng)過(guò)對(duì)上述五種引物和探針進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第1組的引物和探針表現(xiàn)最佳。從圖1的分型散點(diǎn)圖可以看到，第1組的散點(diǎn)分布可以將三種基因型aa\ag\gg很清晰的分開(kāi)，有較好的區(qū)分度。通過(guò)第2組、第3組、第4組和第5組的引物、探針進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其檢測(cè)特異性均不如第1組，從圖2，圖3，圖4和圖5的分型散點(diǎn)圖可以看到，除第1組外的其它四組對(duì)不同樣本的三種基因型的區(qū)分界限不顯著，會(huì)造成分型結(jié)果誤判。

實(shí)施例2利用微流控snp芯片檢測(cè)綿羊fecb基因多態(tài)性的方法

1、實(shí)驗(yàn)材料選取以小尾寒羊?yàn)槟副尽⑵渌贩N為父本雜交產(chǎn)生的共95只綿羊?yàn)闄z測(cè)對(duì)象。

2、基因組dna的提取綿羊頸靜脈采血1ml，用edta抗凝處理。首先紅細(xì)胞裂解液裂解去除不含dna的紅細(xì)胞，細(xì)胞核裂解液裂解包細(xì)胞釋放出基因組dna，然后蛋白沉淀液選擇性沉淀去除蛋白，純凈的基因組dna通過(guò)異丙醇沉淀并重溶解于dna溶解液。

3、微流控snp芯片進(jìn)行基因分型

選用實(shí)施例1篩選得到的針對(duì)綿羊第6號(hào)染色體上第29382188bp位點(diǎn)(nc_019463.1，基于綿羊基因組序列信息版本號(hào)oar_v3.1，2012年12月)的最佳檢測(cè)引物及探針進(jìn)行檢測(cè)。

所述引物的核苷酸序列如下：

正向引物：5’-ccagctggttccgagagaca-3’

反向引物：5’-cttatactcacccaagatgttttcatg-3’

所述探針的核苷酸序列如下：

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p-a：5’-hex-aaatatatcagacggtgttg-mgb-3’

引物和探針由英濰捷基公司合成，universalmastermix購(gòu)自abi公司，利用北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司的微流控snp芯片檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行分型實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系：以提取的基因組dna為模板，以上述合成的探針在微流控snp芯片檢測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行以下擴(kuò)增(1μl反應(yīng)體系)：dna0.2μl，2×mastermix0.5μl，10μmol/l正向引物0.05μl，10μmol/l反向引物0.0.05μl；10μmol/l探針p-g0.025μl，10μmol/l探針p-a0.025μl，去離子水補(bǔ)至1μl。具體步驟如下：

(1)按基因組dna按順序分別加在芯片孔中，等待晾干。

(2)使用壓膜機(jī)將芯片和膜壓緊，從芯片注樣口將反應(yīng)mix從彎道注入，用封口膜將注樣孔密封。

(3)將密封好的芯片，放入離心機(jī)，4000rpm，1min。

(4)將芯片放入平板pcr儀，按著前面設(shè)定的pcr反應(yīng)程序，進(jìn)行擴(kuò)增。

(5)pcr儀運(yùn)行停止后，取出芯片，將芯片放入luxscan-10k/d掃描儀，進(jìn)行掃描。

4.分析結(jié)果通過(guò)luxscan-10k/d掃描儀掃描生成tif文件，并將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)字信號(hào)值。然后將上述數(shù)字信號(hào)輸入到snptyper軟件中，運(yùn)行軟件后，可實(shí)現(xiàn)snp分型。結(jié)果見(jiàn)表1。

5.統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表1待測(cè)綿羊第6號(hào)染色體29382188位點(diǎn)不同基因型分析統(tǒng)計(jì)

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

sequencelisting

<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司

<120>利用微流控snp芯片檢測(cè)綿羊fecb基因多態(tài)性的方法

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