本發(fā)明屬于生物傳感器領(lǐng)域，涉及食源性致病菌大腸桿菌o157:h7(escherichiacolio157:h7)的特異性檢測，是一種基于fret(fluorescenceresonanceenergytransfer，熒光共振能量轉(zhuǎn)移)技術(shù)和細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號通路的b淋巴細(xì)胞生物傳感器的構(gòu)建。

背景技術(shù)：

在基于細(xì)胞的生物傳感器cbbs中，全細(xì)胞通常被用作一個初級傳感器，而二級傳感器的構(gòu)建通常依賴于細(xì)胞信號檢測的類型。由于淋巴細(xì)胞卓越的特性及其巨大的應(yīng)用潛力，在cbbs中已經(jīng)應(yīng)用了越來越多的淋巴細(xì)胞進(jìn)行檢測。其中，b細(xì)胞由于其自身能特異性識別抗原和需要通過bcr(bcellreceptor，b細(xì)胞受體)向t細(xì)胞進(jìn)行抗原提呈的特性，在cbbs中顯示出了優(yōu)越的檢測速度和檢測特異性。b細(xì)胞是已知天然的最快速的致病菌識別元件，其固有反應(yīng)時間小于1秒。當(dāng)b細(xì)胞識別致病菌后，bcr會介導(dǎo)鈣離子回流，該反應(yīng)是b細(xì)胞應(yīng)對抗原刺激的一個關(guān)鍵反應(yīng)。當(dāng)發(fā)生二價抗原或多價抗原與bcr的交聯(lián)后，便會導(dǎo)致跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗原內(nèi)化后的提呈。因?yàn)殁}離子在調(diào)控不同的細(xì)胞活動時有著重要作用，因此使用熒光指示劑的鈣離子成像在原代細(xì)胞和組織中的生理學(xué)研究具有越發(fā)重要的作用。遺傳編碼的鈣離子指示劑(geneticallyencodedca²⁺indicators，gecis)是綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，gfp)技術(shù)的最大受益者之一，它是將熒光蛋白與生物鈣離子傳感器串聯(lián)得到的。gecis已經(jīng)成為了繼水母蛋白和化學(xué)鈣離子指示劑之后，檢測胞內(nèi)鈣離子濃度時的一種非常有價值的工具?；趃fp構(gòu)建的鈣離子指示劑可以很好地克服水母蛋白和化學(xué)合成指示劑的不足。其中一個高效的自組裝的geci是tn-xxl。tn-xxl鈣離子生物傳感器是由來源于骨骼和心肌的鈣離子結(jié)合蛋白肌鈣蛋白(troponinc，tnc)衍生而來的，它已經(jīng)被成功地應(yīng)用于大量研究中，諸如從果蠅和小鼠的神經(jīng)細(xì)胞直到小鼠的t細(xì)胞。據(jù)我們所知，還沒有tn-xxl被用于b細(xì)胞檢測食源性微生物中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種基于fret技術(shù)檢測大腸桿菌o157:h7的方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種基于fret技術(shù)檢測大腸桿菌o157:h7的方法，依次包括以下步驟：

1)、培養(yǎng)b細(xì)胞：將b細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)生長期；

2)、將遺傳編碼鈣離子熒光指示劑質(zhì)粒tn-xxl電轉(zhuǎn)化入指數(shù)生長期的b細(xì)胞，得表達(dá)tn-xxl的b細(xì)胞；

該表達(dá)tn-xxl的b細(xì)胞作為基于fret檢測大腸桿菌o157:h7的細(xì)胞生物傳感器；

3)、將表達(dá)tn-xxl的b細(xì)胞與待測物接觸時，通過光漂白法測定fret效率；

當(dāng)大腸桿菌o157:h7細(xì)菌濃度高時，所檢測到的fret效率相對較高。

作為本發(fā)明的基于fret技術(shù)檢測大腸桿菌o157:h7的方法的改進(jìn)：

步驟1)中使用的b細(xì)胞培養(yǎng)基為dmem培養(yǎng)基與hifbs(熱滅活胎牛血清)按照9:1的體積比混合而得。

所述dmem培養(yǎng)基為含有4mml-谷氨酰胺和1.5g/l的碳酸氫鈉，4.5g/l的葡萄糖，1vol％的非必須氨基酸(memnaa)的dmem培養(yǎng)基。

作為本發(fā)明的基于fret技術(shù)檢測大腸桿菌o157:h7的方法的進(jìn)一步改進(jìn)：步驟2)中，取指數(shù)生長期生長的b細(xì)胞，使用電轉(zhuǎn)化技術(shù)將質(zhì)粒tn-xxl轉(zhuǎn)染到b細(xì)胞中(bio-radgene-pulser,bio-rad,hercules,ca,usa)，電轉(zhuǎn)化時使用0.35ml濃度為1.43×10⁶cells/ml的b細(xì)胞和3μg的tn-xxl質(zhì)粒dna，電轉(zhuǎn)化的工藝參數(shù)為：0.4cm電轉(zhuǎn)化杯，500v(bio-radgenepulserxcelltmelectroporationsystems)。

本發(fā)明構(gòu)建一種新型的細(xì)胞生物傳感器，它利用遺傳編碼鈣離子指示劑tn-xxl對胞內(nèi)鈣離子的靈敏性和b細(xì)胞對致病菌反應(yīng)的快速性，結(jié)合fret技術(shù)，提供一種檢測食源性致病菌e.colio157:h7的新的檢測方法。該方法是一種全新的細(xì)胞生物傳感器的構(gòu)建方法(圖1)。

本發(fā)明根據(jù)b細(xì)胞對e.colio157:h7的特異性和tn-xxl對胞內(nèi)鈣離子的敏感性特性，構(gòu)建了含有鈣離子熒光指示劑的b細(xì)胞生物傳感器。本發(fā)明將表達(dá)tn-xxl的b細(xì)胞與不同濃度e.colio157:h7菌體細(xì)胞混合后，b細(xì)胞就會捕獲細(xì)菌細(xì)胞，從而引發(fā)b細(xì)胞表面的bcr介導(dǎo)的胞內(nèi)鈣離子激流，tn-xxl的構(gòu)象發(fā)生變化從而引發(fā)了fret效率發(fā)生改變，通過共聚焦顯微鏡對fret效率的測定，從而確定待測樣品中是否含有靶標(biāo)致病菌。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

圖1基于fret的細(xì)胞生物傳感器快速檢測食源性致病菌e.colio157:h7的原理示意圖。

圖2不同濃度e.colio157:h7的fret效率對比圖。

圖3該細(xì)胞生物傳感器的roc曲線圖。

圖4飲用水中靶標(biāo)細(xì)菌e.colio157:h7的測定對比圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1、一種基于fret技術(shù)檢測食源性致病菌escherichiacolio157:h7的方法，依次進(jìn)行以下步驟：

1)b細(xì)胞培養(yǎng)：

b細(xì)胞培養(yǎng)基為在900ml的dmem培養(yǎng)基中加入100mlhifbs(熱滅活胎牛血清)而得。該dmem培養(yǎng)基為含有4mml-谷氨酰胺和1.5g/l的碳酸氫鈉，4.5g/l的葡萄糖，1vol％的非必須氨基酸(memnaa)的dmem培養(yǎng)基。細(xì)胞在37℃，二氧化碳濃度為7％的二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

每次以1:10的比例(體積比)將b細(xì)胞接種至b細(xì)胞培養(yǎng)基中，于t25或t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)(falcon，oxnard，usa)，培養(yǎng)72h后；使用tc10自動細(xì)胞計數(shù)儀(bio-rad，hercules，ca，usa)進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)和細(xì)胞存活率的測定。取指數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。按照上述培養(yǎng)條件將b細(xì)胞傳代至b細(xì)胞培養(yǎng)基；選用代數(shù)為5-10代的b細(xì)胞保存在液氮中。

2)電轉(zhuǎn)化

取上述指數(shù)生長期生長的b細(xì)胞，使用電轉(zhuǎn)化技術(shù)將質(zhì)粒tn-xxl轉(zhuǎn)染到b細(xì)胞中(bio-radgene-pulser,bio-rad,hercules,ca,usa)。電轉(zhuǎn)化時使用0.35ml濃度為1.43×10⁶cells/ml的b細(xì)胞和3μg的tn-xxl質(zhì)粒dna，電轉(zhuǎn)化的工藝參數(shù)為：0.4cm電轉(zhuǎn)化杯，500v(bio-radgenepulserxcelltmelectroporationsystems)；終體積約為0.4ml。在電轉(zhuǎn)化后，立刻將轉(zhuǎn)化后細(xì)胞置于t25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入10mlb細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行過夜培養(yǎng)(在37℃，二氧化碳濃度為7％的二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng))。

3)光漂白檢測fret效率

使用共聚焦顯微鏡zeisslsm780(carlzeissinc.，thornwood，ny)，用yfp通道中的514nm激光通道使用100％的激光能量對roi進(jìn)行光漂白。在收集數(shù)據(jù)時，獲得同一檢測器補(bǔ)償條件下漂白前和漂白后的圖像進(jìn)行分析。在光漂白之前，掃描三個漂白前的成像作為基線，然后進(jìn)行光漂白直至50％的yfp熒光強(qiáng)度被漂白。

fret效率值用如下公式進(jìn)行計算：

fretefficiency(％)＝[(cfppost-cfppre)/cfppost]×100；

其中，cfppre是光漂白之前的cfp信號，cfppost是光漂白之后的cfp信號。使用zeiss軟件獲得cfp和yfp在roi的信號值后，通過以上方程對roi的fret效率進(jìn)行計算。在光漂白之前的roi的yfp信號降低和fret效率的增加都為0；當(dāng)光漂白之后，yfp信號降低為50％，此時供體cfp的信號增強(qiáng)，這象征了fret效率的增強(qiáng)。

4)樣品檢測

當(dāng)電轉(zhuǎn)化48h后，表達(dá)tn-xxl的b細(xì)胞的濃度達(dá)到5.4×10⁵cells/ml時進(jìn)行檢測。將e.colio157:h7作為靶標(biāo)致病菌，使用hbss對其梯度稀釋為6.1×10¹～6.1×10⁸cfu/ml。

檢測試驗(yàn)操作步驟簡述如下：使用hbss代替致病菌作為空白對照組；使用e.colio157:h7作為靶標(biāo)致病菌組；用hbss將b細(xì)胞洗滌三次后，在空白對照組中，將1ml洗滌后的b細(xì)胞與1ml的hbss溫和混勻；在靶標(biāo)致病菌組中，將1ml洗滌后的b細(xì)胞與1ml的致病菌混勻。取出20μl的混合物滴加至載玻片上用指甲油密封，置于室溫黑暗中等待檢測(按照上述步驟3)所述)。所有樣本制備都是在檢測之前新鮮制備，即制即測。

5)數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)為20個樣本的重復(fù)試驗(yàn)，當(dāng)不同濃度e.colio157:h7存在時，測得的fret有很大差別。根據(jù)圖2，我們得知：當(dāng)細(xì)菌濃度越高時，所檢測到的fret效率相對較高。

空白對照組對應(yīng)的fret效率(％)約為7.33092。

為了評估該生物傳感器的準(zhǔn)確性，我們繪制了roc曲線?？梢岳胷oc曲線特征，初步進(jìn)行評估細(xì)菌的濃度范圍：當(dāng)aur≤0.7時，細(xì)菌濃度小于10³cells/ml；當(dāng)0.7＜aur＜0.9時，細(xì)菌濃度介于10⁴-10⁵cells/ml；當(dāng)aur≥0.9時，細(xì)菌濃度大于10⁶cells/ml(圖3)。

實(shí)驗(yàn)1、利用細(xì)胞生物傳感器所得的細(xì)胞生物傳感器，進(jìn)行檢測大腸桿菌o157:h7的方法，依次進(jìn)行以下步驟：

1)樣品制備：

在飲用水中加入大腸桿菌o157:h7，使其終濃度分別為5.6×10²，5.6×10⁵和5.6×10⁸cfu/ml，即分別為樣品a、b和c。

2)樣品檢測：

將已經(jīng)表達(dá)了tn-xxl質(zhì)粒的濃度為4.9×10⁵cells/ml的b細(xì)胞分別與待測樣品按照體積比1：1混合均勻，立刻置于共聚焦顯微鏡zeisslsm780下分別進(jìn)行fret效率檢測。所得結(jié)果如圖4所示，當(dāng)靶標(biāo)細(xì)菌濃度為5.6×10²，5.6×10⁵和5.6×10⁸cfu/ml時，樣品a、b和c所測得fret效率(％)分別為9.851±0.8582,13.96±0.8712和18.31±0.7875。與空白對照(bc)相比均有顯著性差異(p﹤0.0001)。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。