本發(fā)明涉及抗腫瘤藥物領(lǐng)域，具體涉及一種ph刺激響應(yīng)性的線形二嵌段聚合前藥的制備方法及其體外活性。

背景技術(shù)：

癌癥是威脅人類健康的主要疾病之一，其發(fā)病率與死亡率僅次于心血管疾病，如何高效的治療癌癥已備受關(guān)注?？鼓[瘤藥物被廣泛用于治療癌癥，它能夠通過(guò)調(diào)控dna的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯有效地抑制腫瘤的增殖并促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，常用的有甲氨喋呤、吡喃阿霉素、鹽酸阿霉素以及從天然產(chǎn)物中提取的喜樹(shù)堿、紫杉醇等，但是這些化學(xué)藥物在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)損傷了正常細(xì)胞和組織，出現(xiàn)嘔吐、高熱、脫發(fā)、免疫力下降等癥狀，引起這一系列問(wèn)題的主要原因是抗腫瘤藥物的水溶性差，選擇性差從而不能在病變部位有效發(fā)揮藥效，導(dǎo)致它們的應(yīng)用在臨床上受到限制。

采用物理包埋或者化學(xué)鍵合的方式將抗腫瘤藥物與納米載體結(jié)合形成膠束既可以大幅度降低藥物的毒副作用，又可以實(shí)現(xiàn)藥物在病變部位的控制釋放。研究表明通過(guò)靶向試劑對(duì)藥物載體的修飾，可以提高藥物在腫瘤部位的分布使藥物充分發(fā)揮作用。cn201610987991.6公開(kāi)了一種ph-氧化還原雙響應(yīng)性的靶向納米給藥載體（腫瘤靶向配體-聚乙二醇-二硫鍵-聚酰胺-胺-組氨酸），其中組氨酸的修飾增加了載體的酸敏感性，使聚酰胺-胺的質(zhì)子海綿效應(yīng)增強(qiáng)，促進(jìn)藥物溶酶體中快速釋放。cn201611196325.7公開(kāi)了一種ph響應(yīng)胰島素緩釋的三嵌段聚合物（聚乙二醇單甲醚-聚己內(nèi)酯-聚堿聚甲基丙烯酸-n,n-二乙氨基乙酯），該納米顆粒能夠根據(jù)不同ph值進(jìn)行藥物的精準(zhǔn)投遞，同時(shí)能夠達(dá)到緩釋的效果。

由于到達(dá)病變部位的藥物濃度仍低于治療所需劑量，因此，構(gòu)建藥載量高、刺激響應(yīng)性的靶向性藥物載體具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是一種ph刺激響應(yīng)性線形聚合前藥的制備方法，該方法操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)率高。目的之二是使用所述制備方法制備的聚合物前藥具有藥載量高、穩(wěn)定性好、毒副作用小、ph刺激響應(yīng)性、葉酸靶向性等優(yōu)點(diǎn)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，采用以下技術(shù)方案：

1)一種ph刺激響應(yīng)性的線形二嵌段聚合前藥的制備方法，包含以下步驟：

（1）親水單體p(oegma)m的制備，其反應(yīng)式如下所示，包含以下步驟：在氬氣(ar，2-10pa)條件下，以cppa-nhs為raft反應(yīng)的大分子引發(fā)劑，與乙二醇甲基丙烯酸酯(oegma)一并溶于1,4-二氧六環(huán)(dio)中，加入偶氮異丁二腈(aibn)后，冷凍－解凍循環(huán)三次，在70℃下避光反應(yīng)24h，用液氮冷凍以終止反應(yīng)，解凍，加3~5ml甲醇稀釋，用截留分子量(mwco)為3500da的透析袋在甲醇中透析24h,濃縮后得到親水單體p(oegma)m，其中m表示oegma的聚合度聚合度(dp)，它的范圍為5~120；

（2）兩親性單體p(oegma)m-b-p(mgma)n的制備，包含以下步驟：

a)mgma的制備，其反應(yīng)式如下所示，包含以下步驟：在冰?。囟取?℃）和氬氣(ar，2-10pa)條件下，羥基乙酸甲酯(mg)溶于含三乙胺(tea)的二氯甲烷(dcm)溶液中并攪拌0.5h，然后將甲基丙烯酰氯(ma)溶于二氯甲烷(dcm)所形成的混合液緩慢加入，0.5h后置于室溫下避光反應(yīng)12h，過(guò)濾除雜,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮溶劑，進(jìn)一步以乙酸乙酯、正己烷為洗脫劑過(guò)硅膠柱除去二取代產(chǎn)物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮所收集溶液即得純的甘氨酸乙酯甲基丙烯酰胺(mgma)；

b)p(oegma)m-b-p(mgma)n的制備，其反應(yīng)式如下所示，包含以下步驟：在氬氣(ar，2-10pa)條件下，將步驟(1)制備的p(oegma)m作為raft反應(yīng)的大分子引發(fā)劑，與步驟(2)a)制備的mgma一起溶于dio中，加入aibn后，冷凍－解凍循環(huán)三次，在70℃下避光反應(yīng)24h，用液氮冷凍以終止反應(yīng)，解凍，加3~5ml甲醇稀釋，用mwco為3500da的透析袋在甲醇中透析24h,濃縮后得到兩親性二嵌段聚合物p(oegma)m-b-p(mgma)n，其中n表示mgma的聚合度(dp)，n的范圍為10~120；

（3）聚合前藥p(oegma)m-b-pdox的制備，其反應(yīng)式如下所示，包含以下步驟：常溫(25℃)通氬(ar，2-10pa)條件下，將步驟（2）制備的二嵌段聚合單體p(oegma)m-b-p(mgma)n與單水合肼(n2h4·h2o)溶于n,n-二甲基甲酰胺(dmf)與甲醇形成的混合液中,避光反應(yīng)12h,用mwco為3500da的透析袋在水中透析24h后冷凍干燥48h得到含酰肼的兩親物p(oegma)m-b-hydrazide；將該物質(zhì)與鹽酸阿霉素(dox^.hcl,其結(jié)構(gòu)如下所示)，在氬氣(ar，2-10pa)條件下溶于含等體積甲醇與dmf的混合液中，加入1滴三氟乙酸(tfa)后避光室溫(25℃)反應(yīng)48h，用mwco為3500da的透析袋在甲醇中透析，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后即得到聚合前藥p(oegma)m-b-pdox(簡(jiǎn)稱為om@dox)；

（4）ph刺激響應(yīng)性聚合前藥om@dox納米膠束的制備，包含以下步驟：取5mg步驟(3)制備的聚合前藥om@dox，溶于含tea的dmf混合液中，攪拌0.5h后，緩慢滴加至二次水中并攪拌0.5h,用mwco為3500da的透析袋在水中透析24h除去有機(jī)溶劑，即得到納米膠束水溶液。

進(jìn)一步的，步驟（1）中aibn、cppa-nhs和oegma的摩爾濃度比為1：(2.4～6.7):(8～24)。

進(jìn)一步的，所述步驟(2)a)中tea與dcm的體積比范圍為1:(2～4.5)；所述步驟(2)a)中mg和ma的摩爾濃度范圍比為1：(1.7～2.3)；所述步驟(2)a)中乙酸乙酯和正己烷的體積比為1:(3.62～4.8);所述步驟(2)b)中p(oegma)m和mgma摩爾濃度比為1：(10～80)。

進(jìn)一步的，所述步驟(3)中p(oegma)m-b-p(mgma)n、p(oegma)m-b-hydrazide和dox·hcl的摩爾濃度比為1：(1.2～3.6):(1.4～5.1)；所述步驟(3)中n2h4·h2o、甲醇、dmf和tfa的體積比為1:(6～10):(2～7):(0.1～0.4)。

進(jìn)一步的，步驟(4)的聚合前藥中阿霉素的濃度范圍為0.01mg·l^-1～0.05mg·l^-1;所述步驟（4）中dmf和水的體積比范圍為1：(6～500);所述步驟（4）中透析后所得的納米膠束粒徑范圍為10~1000nm。

2)一種ph刺激響應(yīng)性的線形二嵌段聚合前藥的制備方法，該聚合前藥還具有靶向性，包含以下步驟：

（i）fa-nh2的制備，其反應(yīng)式如下所示，包含以下步驟：在冰?。囟取?℃）和氬氣(ar，2-10pa)條件下，將葉酸(fa)溶于無(wú)水的dmf中，加入催化劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(edc)和n-羥基硫代琥珀酰亞胺(nhs)，攪拌0.5h后，加入n-叔丁氧羰基-1,6-己二胺(nh2-boc)溶于含tea的dmf的混合液，在室溫下(25℃)反應(yīng)24h，緩慢滴加至不斷攪拌的二次水中，過(guò)濾，真空干燥后得到氨基被叔丁氧羰基保護(hù)的fa-nh-boc，加入dcm和tfa溶劑并攪拌0.5h，濃縮，加入dcm及tea，避光室溫(25℃)攪拌24h,轉(zhuǎn)速設(shè)為5000r/min離心3min,用dcm洗兩次，真空干燥后得到fa-nh2；

（ii）fa-p(oegma)m-b-p(mgma)n的制備，其反應(yīng)式如下所示，包含以下步驟：在室溫(25℃)通氬(ar，2-10pa)條件下將步驟（2）制備的二嵌段聚合物p(oegma)m-b-p(mgma)n與步驟（i)制備的fa-nh2溶于含tea的無(wú)水二甲亞砜(dmso)溶液中，避光反應(yīng)48h后，緩慢滴加至乙醚中沉淀，真空干燥得到接葉酸的兩親性聚合物fa-p(oegma)m-b-p(mgma)n；

（iii）聚合前藥fa-p(oegma)m-b-pdox的制備，其反應(yīng)式如下所示，包含以下步驟：常溫(25℃)通氬(ar，2-10pa)條件下，將步驟(ii)制備的二嵌段共聚物fa-p(oegma)m-b-p(mgma)n與單水合肼(n2h4·h2o)溶于n,n-二甲基甲酰胺(dmf)與甲醇形成的混合液中,避光反應(yīng)12h,用mwco為3500da的透析袋在水中透析24h后冷凍干燥48h得到含酰肼的兩親物fa-p(oegma)m-b-hydrazide。將該物質(zhì)與dox·hcl在氬氣(ar，2-10pa)條件下溶于含等體積甲醇與dmf的混合液中，加入1滴三氟乙酸(tfa)后避光室溫(25℃)反應(yīng)48h，用mwco為3500da的透析袋在甲醇中透析，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后即得到聚合前藥fa-p(oegma)m-b-pdox，記為fa-om@dox；

（iv）一種ph刺激響應(yīng)性聚合前藥fa-om@dox納米膠束的制備，包含以下步驟：取5mg步驟(iv)制備的聚合前藥fa-om@dox，溶于含tea的dmf混合液中，攪拌0.5h后，緩慢滴加至二次水中并攪拌0.5h，用mwco為3500da的透析袋在水中透析24h除去有機(jī)溶劑，即得到納米膠束水溶液。

進(jìn)一步的，所述步驟(i)中fa、edc、nhs、nh2-boc和tea的摩爾濃度比范圍為1：(1.01～1.2):(1.04～1.3):(1.8～2.4)(1.4～2.2)；所述步驟(i)中dcm、tfa和tea的體積比范圍為1:(0.92～1.08):(1.8～2.4)；

進(jìn)一步的，所述步驟(ii)中p(oegma)m-b-p(mgma)n、fa-nh2和tea的摩爾濃度比范圍為1:(1.01～1.2):(1.01～1.2)；

進(jìn)一步的，所述步驟(iii)中fa-p(oegma)m-b-p(mgma)n、fa-p(oegma)m-b-hydrazide和dox·hcl的摩爾濃度比范圍為1：(1.2～3.6):(1.4～5.1)；所述步驟(iii)中n2h4·h2o、甲醇、dmf和tfa的體積比范圍為1:(6～10):(2～7):(0.1～0.4)。

進(jìn)一步的，步驟(iv)的聚合前藥中阿霉素的濃度范圍為0.01mg·l^-1～0.05mg·l^-1;所述步驟（iv）中dmf和水的體積比范圍為1：(6～500);所述步驟（iv）中透析后所得的納米膠束粒徑范圍為10~1000nm。

主要優(yōu)點(diǎn)：

針對(duì)聚合前藥遞送體系現(xiàn)存的問(wèn)題，本項(xiàng)目提出一類ph刺激響應(yīng)性的線形二嵌段聚合前藥遞送體系，該體系有效的提高了藥物上載量及藥物釋放量，降低了對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用，最重要的是，該體系可以實(shí)現(xiàn)藥物的靶向遞送并選擇性釋放，從而實(shí)現(xiàn)癌癥的精準(zhǔn)治療。

附圖說(shuō)明

為了更加清楚的展現(xiàn)本發(fā)明的目的及其技術(shù)方案，本發(fā)明提供如下附圖。

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中的聚合前藥om@dox和實(shí)施例2中的聚合前藥fa-om@dox的制備流程示意圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中的p(oegma)m與p(oegma)m-b-p(mgma)n的核磁示意圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中的fa-p(oegma)m-b-p(mgma)n與fa-p(oegma)m-b-pdox的核磁示意圖。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1中的聚合前藥om@dox納米膠束的dls和tem示意圖。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例1中的聚合前藥om@dox納米膠束的釋放示意圖。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例1中的聚合前藥om@dox納米膠束和實(shí)施例2中的聚合前藥fa-om@dox納米膠束的毒性示意圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。

實(shí)施例1制備ph刺激響應(yīng)性的聚合前藥

1.制備p(oegma)m：在氬氣(ar，2-10pa)條件下，以cppa-nhs為raft反應(yīng)的大分子引發(fā)劑，與乙二醇甲基丙烯酸酯(oegma)一并溶于1,4-二氧六環(huán)(dio)中，加入偶氮異丁二腈(aibn)后，冷凍－解凍循環(huán)三次，在70℃下避光反應(yīng)24h，用液氮冷凍以終止反應(yīng)，解凍，加3~5ml甲醇稀釋，用截留分子量(mwco)為3500da的透析袋在甲醇中透析24h,濃縮后以氘代-二甲亞砜為溶劑(dmso-d6)測(cè)氫譜結(jié)果如圖2(a)所示，1(3.24ppm)和2(3.60ppm)分別為oegma上甲氧基和亞甲基氫的信號(hào)峰，表明親水單體p(oegma)m成功合成;

2.制備p(oegma)m-b-p(mgma)n：

a)mgma的制備：在冰?。囟取?℃）和氬氣(ar，2-10pa)條件下，羥基乙酸甲酯(mg)溶于含三乙胺(tea)的二氯甲烷(dcm)溶液中并攪拌0.5h，然后將甲基丙烯酰氯(ma)溶于二氯甲烷(dcm)所形成的混合液緩慢加入，0.5h后置于室溫下避光反應(yīng)12h，過(guò)濾后濃縮即得純的mgma;

b)p(oegma)m-b-p(mgma)n的制備：在氬氣(ar，2-10pa)條件下，p(oegma)m與mgma一并溶于dio中，加入aibn后，冷凍－解凍循環(huán)三次，在70℃下避光反應(yīng)24h，用液氮冷凍以終止反應(yīng)，解凍，透析24h,濃縮純化;以氘代氯仿(cdcl3)為溶劑所測(cè)的氫譜結(jié)果如圖2(b)所示,4(3.73ppm)與5(4.55ppm)分別為mgma上甲氧基和亞甲基上氫的信號(hào)峰，表明兩親性單體p(oegma)m-b-p(mgma)n成功合成；

3.制備p(oegma)m-b-pdox：常溫(25℃)通氬(ar，2-10pa)條件下，p(oegma)m-b-p(mgma)n與單水n2h4·h2o溶于dmf與甲醇形成的混合液中,避光反應(yīng)12h,透析24h后冷凍干燥48h得到含酰肼的兩親物；將該物質(zhì)與dox·hcl在氬氣(ar，2-10pa)條件下溶于含等體積甲醇與dmf的混合液中，加入1滴三氟乙酸(tfa)后避光室溫(25℃)反應(yīng)48h，透析后濃縮后即得到聚合前藥p(oegma)m-b-pdox(om@dox);

4.制備聚合前藥om@dox納米膠束:5mg聚合前藥om@dox溶于含tea的dmf混合液中，攪拌0.5h后，緩慢滴加至二次水中并攪拌0.5h,在水中透析24h除去有機(jī)溶劑，即得到納米膠束水溶液；如圖4所示，om@dox納米膠束為球狀，多分散指數(shù)(pdi)比較小，粒徑介于1~100之間，表明所制膠束尺寸均勻易進(jìn)入細(xì)胞；體外釋放如圖5所示，96h時(shí)om@dox納米膠束在ph=5.0的媒介中釋放百分比為90.0%，而在ph=7.4的媒介中為11.4%，表明該體系在酸性條件下趨于完全釋放，具有ph刺激響應(yīng)性；體外毒性如圖6所示，om@dox膠束作用72h后，圖6a)中宮頸癌細(xì)胞(hela)存活率為16.2%，從圖6(b)中可以看出對(duì)正常細(xì)胞的(l929)毒副作用較小。

實(shí)施例2制備ph刺激響應(yīng)性的聚合前藥,該聚合前藥還具有靶向性

（i）fa-nh2的制備：在冰浴（溫度≤0℃）和氬氣(ar，2-10pa)條件下，將葉酸(fa)溶于無(wú)水的dmf中，加入催化劑edc和nhs，攪拌0.5h后，加入nh2-boc溶于含tea的dmf形成的混合液，在室溫下(25℃)反應(yīng)24h，緩慢滴加至不斷攪拌的二次水中，過(guò)濾，真空干燥后得到fa-nh-boc。加入dcm和tfa溶劑并攪拌0.5h，濃縮，加入dcm及tea，避光室溫(25℃)攪拌24h,轉(zhuǎn)速設(shè)為5000r/min離心3min,用dcm洗兩次，真空干燥后得到fa-nh2；

（ii）制備fa-p(oegma)m-b-p(mgma)n：在室溫(25℃)通氬(ar，2-10pa)條件下p(oegma)m-b-p(mgma)n與fa-nh2溶于含tea的dmso溶液中，避光反應(yīng)48h后，在乙醚中沉淀，真空干燥后以氘代-二甲亞砜(dmso-d6)為溶劑所測(cè)的氫譜結(jié)果如圖3(a)所示,6.63~8.60ppm葉酸特征峰的出現(xiàn)表明聚合物fa-p(oegma)m-b-p(mgma)n成功合成；

（iii）制備fa-p(oegma)m-b-pdox：常溫(25℃)通氬(ar，2-10pa)條件下，二嵌段共聚物fa-p(oegma)m-b-p(mgma)n，與n2h4·h2o溶于dmf與甲醇形成的混合液中,避光反應(yīng)12h,透析24h后冷凍干燥48h得到含酰肼的兩親物；將該物質(zhì)與dox·hcl在氬氣(ar，2-10pa)條件下溶于含等體積甲醇與dmf的混合液中，加入1滴tfa，避光室溫(25℃)反應(yīng)48h，透析濃縮后，以氘代二甲基亞砜（dmso-d6）為溶劑所測(cè)的氫譜結(jié)果如圖3(b)所示,7.98~7.78ppm阿霉素特征峰的出現(xiàn)表明聚合前藥fa-p(oegma)m-b-pdox(fa-om@dox)成功合成，通過(guò)核磁結(jié)果計(jì)算藥載量高達(dá)61.5%；

（iv）制備聚合前藥fa-om@dox納米膠束:5mg聚合前藥fa-om@dox溶于含tea的dmf混合液中，攪拌0.5h后，緩慢滴加至二次水中并攪拌0.5h,在水中透析24h除去有機(jī)溶劑，即得到納米膠束水溶液；通過(guò)比較體外毒性圖6(c)與圖6(d)，顯然fa-om@dox膠束作用時(shí)間相同時(shí)，口腔表皮樣癌細(xì)胞(kb)的存活率低于(~4%)肺癌細(xì)胞(a549)，表明fa-om@dox膠束具有靶向性。

最后說(shuō)明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其做出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。