本發(fā)明涉及一種甘油酯型pufa的制備方法。

背景技術(shù)：

多不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacids，縮寫為pufa)是指含有兩個或兩個以上雙鍵且碳鏈長度為18～22個碳原子的直鏈脂肪酸的總稱。其中，最具代表性的pufa主要為epa、dpa和dha。研究表明，pufa具有多重功效，如治療自身免疫缺陷、促進(jìn)循環(huán)系統(tǒng)的健康、降低膽固醇、預(yù)防動脈粥樣硬化以及提高視網(wǎng)膜的發(fā)射機(jī)能等。目前市售的epa、dha產(chǎn)品主要為游離型或乙酯型。然而，游離型pufa極易氧化，而且有辛澀味，口感不好，直接食用難以被人們接受。乙酯型在人體中消化和吸收比較困難，且代謝過程中會產(chǎn)生乙醇，可能存在安全隱患。

甘油三酯型pufa在保持其生理和營養(yǎng)功能的同時，氣味和味道更平和，易于消化吸收。而且，研究表明甘油三酯型pufa具有更好的抗氧化性和生物利用度。然而，即使是來源最豐富的深海魚油，甘油三酯型pufa的含量也不足20％。傳統(tǒng)的甘油三酯型pufa合成工藝中，采用甘油和脂肪酸直接加酶在無溶劑體系下進(jìn)行反應(yīng)，或者是采用有機(jī)溶劑如叔丁醇作為溶劑進(jìn)行反應(yīng)，前者甘油三酯型pufa的得率僅能達(dá)到22％左右，后者雖有提高，但其造成的環(huán)境污染問題和食品安全問題不容忽視。更高純度的產(chǎn)品必須配合其他方法如分子蒸餾等來實(shí)現(xiàn)，原料利用率低。且由于產(chǎn)物中甘油單酯和甘油二酯的乳化作用，使得殘余甘油難以與酯化產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)快速分離，仍需采用離心等操作，耗時、能量消耗大且成本高昂。

cn101255380公開了一種甘油三酯型魚油及其制作方法，以乙酯型魚油和甘油為原料，novozym435為催化劑，有效地解決了以往乙酯型魚油藥用保健效果差的問題；cn103242969a公開了一種甘油三酯型魚油的制備方法，用乙酯型魚油、甘油在堿性催化劑進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，原料成本低,設(shè)備投入少；cn102994580a公開了一種高純度甘油三酯型pufa的制備方法，首先以脂肪酶novozym435為催化劑催化甘油與pufa反應(yīng)，然后除去novozym435催化劑，再經(jīng)偏甘油酯脂肪酶lipasesmg1在不高于5℃時催化混合物中的偏甘油酯型pufa與羥基供體進(jìn)行水解或醇解反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了高純度甘油三酯型pufa產(chǎn)品的酶法合成。

綜上所述，現(xiàn)有的甘油三酯型pufa的制備技術(shù)操作過程復(fù)雜，反應(yīng)過程需要配合使用多種設(shè)備且甘油酯產(chǎn)物的分離復(fù)雜，而且某些工藝需要配合使用多種酶制劑參與甘油三酯型pufa的合成，這就增加了甘油三酯型pufa的合成成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種甘油酯型pufa的制備方法，以甘油和游離態(tài)pufa或pufa短鏈醇酯為底物，在低共熔溶劑中合成甘油三酯型pufa，該方法反應(yīng)速度快，產(chǎn)物易于分離，節(jié)能環(huán)保，能有效提高底物轉(zhuǎn)化率，降低生產(chǎn)成本，有效解決了因復(fù)雜分離過程帶來的pufa氧化問題，提高了產(chǎn)品穩(wěn)定性。

為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

一種甘油酯型pufa的制備方法，將低共熔溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)，以固定化脂肪酶為催化劑，通入保護(hù)氣，利用甘油和游離態(tài)pufa或pufa短鏈醇酯進(jìn)行酯化或轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，然后靜置分層(采用分液漏斗回收下層低共熔溶劑)，上層即為高得率甘油三酯型pufa的酯化產(chǎn)物。

所述低共熔溶劑為尿素、木糖醇、海藻糖中的任意一種與氯化膽堿按摩爾比(1～3):1混合后加熱得到的液體混合物。

所述低共熔溶劑制備的條件：采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，真空度0.06～0.1mpa，溫度50～80℃，時間2～4h。

所述的低共熔溶劑制備參數(shù)為真空度0.08mpa，溫度65℃，時間為2h。

所述pufa為富含游離態(tài)epa、dpa和dha的混合物，所述pufa短鏈醇酯為epa短鏈醇酯、dpa短鏈醇酯和dha短鏈醇酯的混合物。

所述甘油與pufa或pufa短鏈醇酯的摩爾比為(1～5):1。

所述固定化脂肪酶的用量為反應(yīng)底物總質(zhì)量的0.5～10％；所述低共熔溶劑的用量為反應(yīng)底物總體積的2～4倍。

所述固定化脂肪酶的用量為反應(yīng)底物總質(zhì)量的3～10％。

所述固定化脂肪酶為novozym435、lipozymermim、lipozymepsim或lipozymetlim。

所述酯化反應(yīng)或轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的溫度為30～60℃。

所述酯化反應(yīng)或轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的時間為6～24h。

本發(fā)明中，采用的反應(yīng)介質(zhì)低共熔溶劑具有一定的吸水和吸醇能力，能實(shí)時除去甘油和游離態(tài)pufa酯化反應(yīng)過程中產(chǎn)生的水分或甘油和pufa短鏈醇酯轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)過程中生成的短鏈醇，推動酯化反應(yīng)向正方向進(jìn)行。傳統(tǒng)的無溶劑體系下的酯化反應(yīng)，由于反應(yīng)過程中產(chǎn)生的甘油單酯和甘油二酯均為乳化劑，使得反應(yīng)產(chǎn)物與殘余底物形成穩(wěn)定均相體系，反應(yīng)過程中產(chǎn)生的水會在一定程度上造成產(chǎn)物抑制，酯化產(chǎn)物中甘油三酯型pufa的得率比較低，且產(chǎn)物分離過程仍需采用離心等耗能操作來實(shí)現(xiàn)。采用上述低共熔溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)后，甘油能很好地溶解在其中，反應(yīng)產(chǎn)物仍為兩相，僅需采用普通分液漏斗除去下層低共熔溶劑即可，既能實(shí)現(xiàn)除去溶劑的作用，殘余反應(yīng)底物甘油和反應(yīng)過程中產(chǎn)生的水或短鏈醇也在此過程中被除去。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

(1)本發(fā)明利用甘油為pufa的?；荏w，以低共熔溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)，固定化脂肪酶為催化劑催化甘油與游離態(tài)pufa或pufa短鏈醇酯進(jìn)行酯化或轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，產(chǎn)物中甘油三酯型pufa含量高，可以達(dá)到50％～60％；和無溶劑體系下的酯化產(chǎn)物相比，甘油三酯型pufa含量提高了2～3倍。

(2)本發(fā)明采用低共熔溶劑為反應(yīng)介質(zhì)在常壓下反應(yīng)，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)體系簡單，產(chǎn)物易于分離；回收的低共熔溶劑可以重復(fù)利用5次以上。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步具體詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此，對于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。

實(shí)施例1

低共熔溶劑的制備：分別稱取116g氯化膽堿和100g尿素(氯化膽堿與尿素的摩爾比例為1:2)，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中真空度0.08mpa，65℃水浴加熱2h直至得到無色透明液體。

取50ml低共熔溶劑加入到圓底燒瓶中，然后依次加入23.0g甘油、28.3gpufa(甘油與pufa的摩爾比為2.8:1)和1.5g固定化酶lipozymermim(novozymes公司產(chǎn)品)，充入氮?dú)庾鳛楸Ｗo(hù)氣，置于40℃恒溫水浴條件下反應(yīng)，轉(zhuǎn)速控制在500rpm，反應(yīng)時間24h。用分液漏斗除去下層低共熔溶劑，收集上層甘油酯產(chǎn)物。甘油酯產(chǎn)物中各組分質(zhì)量百分含量如下：甘油三酯30.38％，甘油二酯42.05％，甘油單酯10.72％，游離脂肪酸16.85％。低共熔溶劑重復(fù)利用5次后，甘油三酯含量仍保持在29.89％。

實(shí)施例2

低共熔溶劑的制備同實(shí)施例1。

取50ml低共熔溶劑加入到圓底燒瓶中，然后依次加入23.0g甘油、28.3gpufa(甘油與pufa的摩爾比為2.8:1)和1.5g固定化酶novozym435(novozymes公司產(chǎn)品)，充入氮?dú)庾鳛楸Ｗo(hù)氣，置于40℃恒溫水浴條件下反應(yīng)，轉(zhuǎn)速控制在500rpm，反應(yīng)時間24h。用分液漏斗除去下層低共熔溶劑，收集上層甘油酯產(chǎn)物。甘油酯產(chǎn)物中各組分質(zhì)量百分含量如下：甘油三酯43.98％，甘油二酯41.08％，甘油單酯4.85％，游離脂肪酸10.09％。低共熔溶劑重復(fù)利用5次后，甘油三酯含量仍保持在42.60％。

實(shí)施例3

低共熔溶劑的制備同實(shí)施例1。

取50ml低共熔溶劑加入到圓底燒瓶中，然后依次加入23.0g甘油、15.5gpufa(甘油與pufa的摩爾比為5:1)和1.5g固定化酶novozym435(novozymes公司產(chǎn)品)，充入氮?dú)庾鳛楸Ｗo(hù)氣，置于40℃恒溫水浴條件下反應(yīng)，轉(zhuǎn)速控制在500rpm，反應(yīng)時間24h。用分液漏斗除去下層低共熔溶劑，收集上層甘油酯產(chǎn)物。甘油酯產(chǎn)物中各組分質(zhì)量百分含量如下：甘油三酯49.58％，甘油二酯38.06％，甘油單酯3.80％，游離脂肪酸8.56％。低共熔溶劑重復(fù)利用5次后，甘油三酯含量仍保持在46.86％。

實(shí)施例4

低共熔溶劑的制備同實(shí)施例1。

取60ml低共熔溶劑加入到圓底燒瓶中，然后依次加入23.0g甘油、15.5gpufa(甘油與pufa的摩爾比為5:1)和1.5g固定化酶novozym435(novozymes公司產(chǎn)品)，充入氮?dú)庾鳛楸Ｗo(hù)氣，置于40℃恒溫水浴條件下反應(yīng)，轉(zhuǎn)速控制在500rpm，反應(yīng)時間24h。用分液漏斗除去下層低共熔溶劑，收集上層甘油酯產(chǎn)物。甘油酯產(chǎn)物中各組分質(zhì)量百分含量如下：甘油三酯51.40％，甘油二酯33.68％，甘油單酯3.35％，游離脂肪酸11.57％。低共熔溶劑重復(fù)利用5次后，甘油三酯含量仍保持在48.50％。

實(shí)施例5

低共熔溶劑的制備同實(shí)施例1。

取60ml低共熔溶劑加入到圓底燒瓶中，然后依次加入23.0g甘油、15.5gpufa(甘油與pufa的摩爾比為5:1)和3.0g固定化酶novozym435(novozymes公司產(chǎn)品)，充入氮?dú)庾鳛楸Ｗo(hù)氣，置于40℃恒溫水浴條件下反應(yīng)，轉(zhuǎn)速控制在500rpm，反應(yīng)時間24h。用分液漏斗除去下層低共熔溶劑，收集上層甘油酯產(chǎn)物。甘油酯產(chǎn)物中各組分質(zhì)量百分含量如下：甘油三酯55.16％，甘油二酯30.75％，甘油單酯2.59％，游離脂肪酸11.50％。低共熔溶劑重復(fù)利用5次后，甘油三酯含量仍保持在52.27％。

實(shí)施例6

低共熔溶劑的制備同實(shí)施例1。

取60ml低共熔溶劑加入到圓底燒瓶中，然后依次加入23.0g甘油、15.5gpufa(甘油與pufa的摩爾比為5:1)和3.0g固定化酶novozym435(novozymes公司產(chǎn)品)，充入氮?dú)庾鳛楸Ｗo(hù)氣，置于50℃恒溫水浴條件下反應(yīng)，轉(zhuǎn)速控制在500rpm，反應(yīng)時間24h。用分液漏斗除去下層低共熔溶劑，收集上層甘油酯產(chǎn)物。甘油酯產(chǎn)物中各組分質(zhì)量百分含量如下：甘油三酯59.16％，甘油二酯27.72％，甘油單酯2.62％，游離脂肪酸10.50％。低共熔溶劑重復(fù)利用5次后，甘油三酯含量仍保持在52.60％。

實(shí)施例7

低共熔溶劑的制備：分別稱取116g氯化膽堿和850g海藻糖(氯化膽堿與海藻糖的摩爾比例為1:3)，其他步驟同實(shí)施例1。

取60ml低共熔溶劑加入到圓底燒瓶中，然后依次加入23.0g甘油、15.5gpufa(甘油與pufa的摩爾比為5:1)和3g固定化酶novozym435(novozymes公司產(chǎn)品)，充入氮?dú)庾鳛楸Ｗo(hù)氣，置于50℃恒溫水浴條件下反應(yīng)，轉(zhuǎn)速控制在500rpm，反應(yīng)時間24h。用分液漏斗除去下層低共熔溶劑，收集上層甘油酯產(chǎn)物。甘油酯產(chǎn)物中各組分質(zhì)量百分含量如下：甘油三酯52.12％，甘油二酯33.07％，甘油單酯2.28％，游離脂肪酸12.53％。低共熔溶劑重復(fù)利用5次后，甘油三酯含量仍保持在37.19％。

實(shí)施例8

低共熔溶劑的制備同實(shí)施例1。

取60ml低共熔溶劑加入到圓底燒瓶中，然后依次加入23.0g甘油、15.5gpufa乙酯(甘油與pufa的摩爾比為2.5:1)和3g固定化酶novozym435(novozymes公司產(chǎn)品)，充入氮?dú)庾鳛楸Ｗo(hù)氣，置于50℃恒溫水浴條件下反應(yīng)，轉(zhuǎn)速控制在500rpm，反應(yīng)時間24h。用分液漏斗除去下層低共熔溶劑，收集上層甘油酯產(chǎn)物。甘油酯產(chǎn)物中各組分質(zhì)量百分含量如下：甘油三酯33.75％，甘油二酯30.80％，甘油單酯8.58％，pufa乙酯26.87％。低共熔溶劑重復(fù)利用5次后，甘油三酯含量仍保持在29.55％。

對比實(shí)施例1

將23.0g甘油、15.5gpufa(甘油與pufa的摩爾比為5:1)和1.5g固定化酶novozym435(novozymes公司產(chǎn)品)加入到圓底燒瓶中，充入氮?dú)庾鳛楸Ｗo(hù)氣，置于40℃恒溫水浴條件下反應(yīng)，轉(zhuǎn)速控制在500rpm，反應(yīng)時間24h。將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至離心管中，于10000rpm條件下離心5min，除去下層未反應(yīng)的甘油，收集上層甘油酯產(chǎn)物。甘油酯產(chǎn)物中各組分質(zhì)量百分含量如下：甘油三酯23.85％，甘油二酯46.90％，甘油單酯17.95％，游離脂肪酸11.30％。

對比實(shí)施例2

取60ml叔丁醇加入到圓底燒瓶中，然后依次加入23.0g甘油、15.5gpufa(甘油與pufa的摩爾比為5:1)和3.0g固定化酶novozym435(novozymes公司產(chǎn)品)，充入氮?dú)庾鳛楸Ｗo(hù)氣，于50℃恒溫水浴條件下反應(yīng)，轉(zhuǎn)速控制在500rpm，反應(yīng)時間24h。然后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中于85℃、0.1mpa條件下除去溶劑叔丁醇，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)于10000rpm條件下離心5min，除去下層未反應(yīng)的甘油，收集上層甘油酯產(chǎn)物。甘油酯產(chǎn)物中各組分質(zhì)量百分含量如下：28.09％，甘油二酯43.82％，甘油單酯13.09％，游離脂肪酸15.00％。