本發(fā)明涉及魚(yú)類產(chǎn)品深加工技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及海鰻活性多肽的制備方法。

背景技術(shù)：

海鰻又名為鰻魚(yú)、虎鰻、牙魚(yú)、狼牙鱔、門(mén)鱔、長(zhǎng)魚(yú)、即勾、勾魚(yú)。體長(zhǎng)一般約0.5~1.5米，大的可達(dá)2米。體細(xì)長(zhǎng)，軀干部近圓筒狀，尾部較側(cè)扁，無(wú)鱗?？诖?，上下領(lǐng)延長(zhǎng)，具強(qiáng)尖銳齒，鰓孔寬大。背、臀、尾鰭相連，胸鰭發(fā)達(dá)。海鰻為暖水性的底層魚(yú)類，一般喜棲息于水深一米泥沙底海區(qū)，有季節(jié)性洞游。分布于印度洋和太平洋，在中國(guó)沿海均有分布，尤以浙、閩、粵沿海產(chǎn)量最多，目前我國(guó)的年產(chǎn)量大約為巧萬(wàn)噸左右。海水養(yǎng)殖魚(yú)一般呈高蛋白、高水分、高脂肪的特點(diǎn)。海鰻的肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，脂肪含量高，蛋白含量高于牛肉、牛乳及禽蛋，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有補(bǔ)虛養(yǎng)血、祛濕、抗痊等功效，是久病、虛弱、貧血、肺結(jié)核等病人的良好營(yíng)養(yǎng)品海鰻富含鈣質(zhì)，經(jīng)常食用，能使血鈣值有所增加，使身體強(qiáng)壯；且鰻魚(yú)的維生素和微量元素含量極高，維生素b1、維生素b2、維生素a含量分別是牛奶的25倍、5倍和45倍，鋅含量腦黃金是牛奶的9倍。

我國(guó)是世界上最大的海鰻養(yǎng)殖、加工和出口國(guó)家，海鰻產(chǎn)品己成為我國(guó)單項(xiàng)農(nóng)產(chǎn)品出口創(chuàng)匯最多的商品，每年產(chǎn)值逾億元，出口一萬(wàn)，創(chuàng)匯一億美元，我國(guó)海鰻產(chǎn)品出口量占世界貿(mào)易量的。海鰻產(chǎn)業(yè)在我國(guó)漁業(yè)經(jīng)濟(jì)中占重要地位，己成為一些地方經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)。海鰻消費(fèi)市場(chǎng)主要集中在烤鰻、活鰻和凍鰻為主。日本是世界最大的鰻魚(yú)消費(fèi)國(guó)，年進(jìn)口量萬(wàn)一萬(wàn)，占我國(guó)烤鰻生產(chǎn)總量的。目前，在各類海鰻加工產(chǎn)品中，干制品以及在此基礎(chǔ)上深加工的熏制品由于具有獨(dú)特風(fēng)味而受到人們的青睞，如烤鰻片、鰻鰲等是世界很多地區(qū)人們非常喜愛(ài)的食品。但這類產(chǎn)品都是基礎(chǔ)類產(chǎn)品，附加值不高。

現(xiàn)有技術(shù)如授權(quán)公告號(hào)為cn101869172b的中國(guó)發(fā)明專利，公開(kāi)了一種活性鰻肽的生產(chǎn)方法，其生產(chǎn)方法為：選擇宰殺好的鮮鰻魚(yú)或鮮凍鰻魚(yú)經(jīng)絞肉機(jī)絞碎、滅菌后再進(jìn)入初發(fā)酵車間進(jìn)行降解水解，通過(guò)魚(yú)骨刺分離將得到的水解清液經(jīng)過(guò)滅酶，油脂分離，超濾，膜分離、真空濃縮，生香處理，噴霧干燥生產(chǎn)出活性鰻肽。采用生物酶解及酶修飾在溫和的條件下進(jìn)行降解水解，提取濃縮高活性鰻魚(yú)蛋白多肽-鰻肽，但該制備方法繁瑣，油脂分離不徹底，產(chǎn)品易產(chǎn)生油哈敗味。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種溶解性好，可直接被小腸吸收，改善腸道內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)食物中營(yíng)養(yǎng)成分的消化吸收利用的海鰻活性多肽的制備方法。

本發(fā)明針對(duì)上述技術(shù)中提到的問(wèn)題，采取的技術(shù)方案為：海鰻活性多肽的制備方法，包括預(yù)處理、酶法脫脂、發(fā)酵培養(yǎng)基制備、黑霉菌種子液制備、啤酒酵母種子液制備、發(fā)酵、純化，具體步驟為：

所用菌種及其購(gòu)買的公司為：黑霉菌和啤酒酵母均購(gòu)自上海復(fù)祥生物科技有限公司。

預(yù)處理：將冷凍海鰻解凍后，清洗，去頭、去尾及內(nèi)臟，從背部切開(kāi)分兩半，去中間的骨頭，然后切成質(zhì)量在20~30g之間的魚(yú)片，備用；

酶法脫脂：用ph為9~10的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液配制40~50u/ml的堿性脂肪酶液，將魚(yú)片與酶液按重量比為1:3~4的比例在28~33℃下浸泡脫脂48~55min，取出海鰻片，用清水沖洗，瀝干水分，備用，脂肪酶作用于油脂的脂鍵，使油脂水解成甘油和脂肪酸，甘油溶于水，脂肪酸與堿形成皂鹽漂洗掉，酶法脫脂反應(yīng)條件溫和、控制方便，能專一性水解油脂的酯鍵、不破壞制品的其他營(yíng)養(yǎng)成分，生物降解性好，使用量少，不會(huì)產(chǎn)生化學(xué)品殘留或二次污染等環(huán)境問(wèn)題；

發(fā)酵培養(yǎng)基制備：將脫脂魚(yú)片蒸煮35~40min，冷卻后與水按重量比為1:1~2的比例勻漿，調(diào)節(jié)ph至5~6，封口，滅菌，備用，該發(fā)酵培養(yǎng)基碳、氮豐富，為菌體的生長(zhǎng)繁殖提供能源，能使種子接種后能迅速生長(zhǎng)，達(dá)到一定的菌絲濃度，使長(zhǎng)好的菌體能迅速合成需產(chǎn)物；

黑霉菌種子液制備：將活化好的黑霉菌接種到查氏液體培養(yǎng)基中，在28~33℃培養(yǎng)45~48h，即得黑霉菌種子液；

啤酒酵母種子液制備：將活化好的啤酒酵母接種到y(tǒng)dp液體培養(yǎng)基中，在28~33℃培養(yǎng)35~38h，即得啤酒酵母種子液；

發(fā)酵：將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)液中，黑霉菌種子液的接種量為4~6%，啤酒酵母種子液的接種量為3~5%，在35~42℃下培養(yǎng)26~28h，滅菌，離心，抽濾，留取濾液，濃縮，備用，該步驟采用混合菌種發(fā)酵，相較于單一菌種純種發(fā)酵有很大的局限性，作用效果的差異性，混合菌種發(fā)酵可利用了不同菌株的生理生化反應(yīng)，使分泌的酶系統(tǒng)更加復(fù)雜多樣，使酶活大大提高，酶系比例協(xié)調(diào)，利用兩種菌種之間的共生作用或營(yíng)養(yǎng)作用，使水解與發(fā)酵能夠同時(shí)進(jìn)行；

純化：將濃縮液用0.2~0.3μm的微孔濾膜過(guò)濾，然后用截留分子量為3~5kda的超濾膜在0.6~0.8mpa壓力下超濾分離，冷凍干燥，即得海鰻活性多肽，其氨基酸序列為hshacklcvcvncfaakcylcrvlhpgklcvcncsk，該活性多肽溶解性好，具有較強(qiáng)的吸濕性，即使在濃度較高時(shí)也有較好的流動(dòng)性，不需要消化就可直接被小腸吸收，滲透壓較低，在食用后不會(huì)引起腹痛、腹瀉等不良反應(yīng)，有利于腸道內(nèi)益生菌的生長(zhǎng)，幫助改善腸道內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)食物中營(yíng)養(yǎng)成分的消化吸收利用，可用于一般蛋白質(zhì)制品的替代品，給擁有較弱的消化系統(tǒng)的病人或其它特殊人群提供營(yíng)養(yǎng)。

作為優(yōu)選，查氏培養(yǎng)基制備：按重量份取硝酸鈉0.1~0.3份，磷酸氫二鉀0.08~0.12份，氯化鉀0.03~0.06份，硫酸亞鐵0.001~0.002份，七水硫酸鎂0.03~0.06份，蔗糖2~4份，瓊脂1.5~2.3份，蒸餾水96~100份，混合均勻，高壓滅菌。

作為優(yōu)選，ydp液體培養(yǎng)基制備：按重量份取葡萄糖1.8~2.3份，酵母膏0.4~0.6份，蛋白胨0.8~1.2份，瓊脂1.7~2.2份，蒸餾水96~100份，混合均勻，調(diào)節(jié)ph為5.5~6.0，高壓滅菌。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：1）本發(fā)明活性多肽溶解性好，具有較好的流動(dòng)性，可直接被小腸吸收，滲透壓較低，在食用后不會(huì)引起腹痛、腹瀉等不良反應(yīng)，幫助改善腸道內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)食物中營(yíng)養(yǎng)成分的消化吸收利用；2）采用混合菌種發(fā)酵法制備海鰻活性多肽，可利用了不同菌株的生理生化反應(yīng)，使分泌的酶系統(tǒng)更加復(fù)雜多樣，使酶系比例協(xié)調(diào)，水解與發(fā)酵能夠同時(shí)進(jìn)行；3）制備方法簡(jiǎn)單可行，易于擴(kuò)大生產(chǎn)，能提高海鰻的附加值，具有較大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方案作進(jìn)一步說(shuō)明：

實(shí)施例1：

海鰻活性多肽的制備方法，包括預(yù)處理、酶法脫脂、發(fā)酵培養(yǎng)基制備、黑霉菌種子液制備、啤酒酵母種子液制備、發(fā)酵、純化，具體步驟為：

1）預(yù)處理：將冷凍海鰻解凍后，清洗，去頭、去尾及內(nèi)臟，從背部切開(kāi)分兩半，去中間的骨頭，然后切成魚(yú)片的長(zhǎng)和寬約為5cm和3cm，厚度約為1cm，質(zhì)量在20~30g之間的魚(yú)片，備用；

2）酶法脫脂：用ph為9的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液配制42u/ml的堿性脂肪酶液，將魚(yú)片與酶液按重量比為1:3.5的比例在30℃下浸泡脫脂50min，取出海鰻片，用清水沖洗，瀝干水分，備用，脂肪酶作用于油脂的脂鍵，使油脂水解成甘油和脂肪酸，甘油溶于水，脂肪酸與堿形成皂鹽漂洗掉，酶法脫脂反應(yīng)條件溫和、控制方便，能專一性水解油脂的酯鍵、不破壞制品的其他營(yíng)養(yǎng)成分，生物降解性好，使用量少，不會(huì)產(chǎn)生化學(xué)品殘留或二次污染等環(huán)境問(wèn)題；

3）發(fā)酵培養(yǎng)基制備：將脫脂魚(yú)片蒸煮38min，冷卻后與水按重量比為1:1.5的比例用組織搗碎機(jī)搗致勻漿，調(diào)節(jié)ph至6，封口，滅菌，備用，該發(fā)酵培養(yǎng)基碳、氮豐富，為菌體的生長(zhǎng)繁殖提供能源，能使種子接種后能迅速生長(zhǎng)，達(dá)到一定的菌絲濃度，使長(zhǎng)好的菌體能迅速合成需產(chǎn)物；

4）黑霉菌種子液制備：將活化好的黑霉菌接種到查氏液體培養(yǎng)基中，在32℃培養(yǎng)46h，即得黑霉菌種子液；

5）啤酒酵母種子液制備：將活化好的啤酒酵母接種到y(tǒng)dp液體培養(yǎng)基中，在32℃培養(yǎng)36h，即得啤酒酵母種子液；

6）發(fā)酵：將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)液中，黑霉菌種子液的接種量為5%，啤酒酵母種子液的接種量為3%，在38℃、190r/min下?lián)u床培養(yǎng)26h，滅菌，離心，抽濾，留取濾液，濃縮，備用，該步驟采用混合菌種發(fā)酵，相較于單一菌種純種發(fā)酵有很大的局限性，作用效果的差異性，混合菌種發(fā)酵可利用了不同菌株的生理生化反應(yīng)，使分泌的酶系統(tǒng)更加復(fù)雜多樣，使酶活大大提高，酶系比例協(xié)調(diào)，利用兩種菌種之間的共生作用或營(yíng)養(yǎng)作用，使水解與發(fā)酵能夠同時(shí)進(jìn)行；

7）純化：將濃縮液用0.25μm的微孔濾膜過(guò)濾，然后用截留分子量為4kda的超濾膜在0.6mpa壓力下超濾分離，冷凍干燥，即得海鰻活性多肽，其氨基酸序列為hshacklcvcvncfaakcylcrvlhpgklcvcncsk，該活性多肽溶解性好，具有較強(qiáng)的吸濕性，即使在濃度較高時(shí)也有較好的流動(dòng)性，不需要消化就可直接被小腸吸收，滲透壓較低，在食用后不會(huì)引起腹痛、腹瀉等不良反應(yīng)，有利于腸道內(nèi)益生菌的生長(zhǎng)，幫助改善腸道內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)食物中營(yíng)養(yǎng)成分的消化吸收利用，可用于一般蛋白質(zhì)制品的替代品，給擁有較弱的消化系統(tǒng)的病人或其它特殊人群提供營(yíng)養(yǎng)。

上述查氏培養(yǎng)基制備：按重量份取硝酸鈉0.15份，磷酸氫二鉀0.09份，氯化鉀0.05份，硫酸亞鐵0.0015份，七水硫酸鎂0.04份，蔗糖3.2份，瓊脂1.9份，蒸餾水98份，混合均勻，高壓滅菌。

上述ydp液體培養(yǎng)基制備：按重量份取葡萄糖1.9份，酵母膏0.48份，蛋白胨0.96份，瓊脂1.9份，蒸餾水98份，混合均勻，調(diào)節(jié)ph為5.8，高壓滅菌。

實(shí)施例2：

海鰻活性多肽的制備方法，包括預(yù)處理、酶法脫脂、發(fā)酵培養(yǎng)基制備、黑霉菌種子液制備、啤酒酵母種子液制備、發(fā)酵、純化，具體步驟為：

1）預(yù)處理：將冷凍海鰻解凍后，清洗，去頭、去尾及內(nèi)臟，從背部切開(kāi)分兩半，去中間的骨頭，然后切成質(zhì)量在20~30g之間的魚(yú)片，備用；

2）酶法脫脂：用ph為9.5的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液配制43u/ml的堿性脂肪酶液，將魚(yú)片與酶液按重量比為1:3.5的比例在30℃下浸泡脫脂50min，取出海鰻片，用清水沖洗，瀝干水分，備用，脂肪酶作用于油脂的脂鍵，使油脂水解成甘油和脂肪酸，甘油溶于水，脂肪酸與堿形成皂鹽漂洗掉，酶法脫脂反應(yīng)條件溫和、控制方便，能專一性水解油脂的酯鍵、不破壞制品的其他營(yíng)養(yǎng)成分，生物降解性好，使用量少，不會(huì)產(chǎn)生化學(xué)品殘留或二次污染等環(huán)境問(wèn)題；

3）發(fā)酵培養(yǎng)基制備：將脫脂魚(yú)片蒸煮38min，冷卻后與水按重量比為1:1.8的比例用組織搗碎機(jī)搗致勻漿，調(diào)節(jié)ph至5.5，封口，滅菌，備用，該發(fā)酵培養(yǎng)基碳、氮豐富，為菌體的生長(zhǎng)繁殖提供能源，能使種子接種后能迅速生長(zhǎng)，達(dá)到一定的菌絲濃度，使長(zhǎng)好的菌體能迅速合成需產(chǎn)物；

4）黑霉菌種子液制備：將活化好的黑霉菌接種到查氏液體培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)45h，即得黑霉菌種子液；

5）啤酒酵母種子液制備：將活化好的啤酒酵母接種到y(tǒng)dp液體培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)37h，即得啤酒酵母種子液；

6）發(fā)酵：將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)液中，黑霉菌種子液的接種量為6%，啤酒酵母種子液的接種量為4%，在40℃下培養(yǎng)27h，滅菌，離心，抽濾，留取濾液，濃縮，備用，該步驟采用混合菌種發(fā)酵，相較于單一菌種純種發(fā)酵有很大的局限性，作用效果的差異性，混合菌種發(fā)酵可利用了不同菌株的生理生化反應(yīng)，使分泌的酶系統(tǒng)更加復(fù)雜多樣，使酶活大大提高，酶系比例協(xié)調(diào)，利用兩種菌種之間的共生作用或營(yíng)養(yǎng)作用，使水解與發(fā)酵能夠同時(shí)進(jìn)行；

7）純化：將濃縮液用0.3μm的微孔濾膜過(guò)濾，然后用截留分子量為5kda的超濾膜超濾分離，冷凍干燥，即得海鰻活性多肽，其氨基酸序列為hshacklcvcvncfaakcylcrvlhpgklcvcncsk，該活性多肽溶解性好，具有較強(qiáng)的吸濕性，即使在濃度較高時(shí)也有較好的流動(dòng)性，不需要消化就可直接被小腸吸收，滲透壓較低，在食用后不會(huì)引起腹痛、腹瀉等不良反應(yīng)，有利于腸道內(nèi)益生菌的生長(zhǎng)，幫助改善腸道內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)食物中營(yíng)養(yǎng)成分的消化吸收利用，可用于一般蛋白質(zhì)制品的替代品，給擁有較弱的消化系統(tǒng)的病人或其它特殊人群提供營(yíng)養(yǎng)。

上述查氏培養(yǎng)基制備：按重量份取硝酸鈉0.3份，磷酸氫二鉀0.1份，氯化鉀0.05份，硫酸亞鐵0.002份，七水硫酸鎂0.04份，蔗糖3份，瓊脂2份，蒸餾水98份，混合均勻，高壓滅菌。

上述ydp液體培養(yǎng)基制備：按重量份取葡萄糖2份，酵母膏0.5份，蛋白胨1份，瓊脂2份，蒸餾水100份，混合均勻，調(diào)節(jié)ph為6，高壓滅菌。

實(shí)施例3：

海鰻活性多肽的制備方法，具體步驟為：

將冷凍海鰻解凍后，清洗，切成魚(yú)片，備用；

用ph為10的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液配制40~50u/ml的堿性脂肪酶液，將魚(yú)片與酶液按重量比為1:3.3的比例在32℃下浸泡脫脂48~55min，取出海鰻片，用清水沖洗，瀝干水分，備用；

發(fā)酵培養(yǎng)基制備：將脫脂魚(yú)片蒸煮35min，冷卻后與水按重量比為1:2的比例勻漿，調(diào)節(jié)ph至5.8，封口，滅菌，備用；

將活化好的黑霉菌接種到含有硝酸鈉、磷酸氫二鉀、氯化鉀、硫酸亞鐵、七水硫酸鎂、蔗糖、瓊脂、蒸餾水的查氏液體培養(yǎng)基中，在33℃培養(yǎng)48h，即得黑霉菌種子液；

將活化好的啤酒酵母接種到含有葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、瓊脂、蒸餾水的ydp液體培養(yǎng)基中，在28℃培養(yǎng)38h，即得啤酒酵母種子液；

將接種量為4~6%的黑霉菌種子液、接種量為3~5%的啤酒酵母種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)液中，在36℃下培養(yǎng)27h，滅菌，離心，抽濾，留取濾液，濃縮，備用；

純化：將濃縮液用微孔濾膜過(guò)濾，超濾，即得海鰻活性多肽。

本發(fā)明的操作步驟中的常規(guī)操作為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在此不進(jìn)行贅述。

以上所述的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補(bǔ)充或類似方式替代等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

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<110>樂(lè)清瑞耀食品技術(shù)有限公司

<120>海鰻活性多肽的制備方法

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