本發(fā)明涉及一種人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)基，屬于細胞工程技術領域。
背景技術：
間質干細胞(mesenchymalstemcells，mscs)來源于中胚層，也稱多能間充質基質細胞(multipotentmesenchymalstromalcells)，為多能干細胞的一種，它最早發(fā)現于骨髓中，具有向三種胚層細胞分化的多向分化潛能，具有低免疫原性、不刺激產生同種異體免疫反應、不被細胞毒性t細胞和nk細胞殺傷，以及免疫調節(jié)作用。mscs在相應的誘導條件下能分化為骨、脂肪、軟骨、肌肉和肝細胞等不同類型細胞。臍帶間充質干細胞是一類存在于人臍帶中，具有多向分化潛能和自我更新能力的細胞群。它取材方便，來源廣泛，其使用屬“廢物利用”，不受倫理、道德限制，可以為實驗和臨床提供充足的細胞來源，特別能為神經系統疾病的治療帶來新的希望。已經證明其能被誘導分化為成骨細胞、胰島分泌細胞和類肝細胞等,并在免疫抑制治療方面具有積極的臨床應用前景，然而其臨床應用必須以在體外獲得高數量和高純度的臍帶間充質干細胞為基礎。
細胞培養(yǎng)基是決定細胞體外生長代謝最重要、最直接的環(huán)境因素。目前大多數合成細胞培養(yǎng)基均需要補充動物血清才能支持細胞的體外生長、增殖，而動物血清的使用帶來了動物性病原微生物污染培養(yǎng)物的可能，因此推動了動物細胞無血清培養(yǎng)基的發(fā)展。同時，我國對血制品管理嚴格，成人ab血清不易獲得且價格昂貴。動物血清如胎牛血清，對人類而言，存在異種蛋白抗原和攜帶在人類致病的未知病毒等危險，從而限制了臍帶mscs在臨床的應用。
現有技術中，尚未見到有關于人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)基的報道。
技術實現要素：
針對上述現有技術，本發(fā)明提供了一種人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)基，其不含動物源成分，可以完全實現無血清培養(yǎng)干細胞。采用本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人臍帶間充質干細胞，可在體外獲得高數量、高純度并且安全優(yōu)質的臍帶間充質干細胞，同時可提高細胞存活率，維持干細胞的特性。本發(fā)明可解決細胞數量不夠的問題，且每批次的細胞數量、存活率及免疫表型更加穩(wěn)定。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現的：
一種人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)基，是由以下濃度的組分組成的，各濃度單位若無特別說明，均為mg/l：
l-精氨酸100～300；
cuso4·5h2o0.0005～0.005；
l-天門冬酰胺25～75；
l-天門冬氨酸10～30；
l-谷氨酸10～30；
ni(no3)2·6h2o0.00002～0.0002；
l-谷氨酰胺0～500；
znso4·7h2o0.06～0.6；
甘氨酸5～15；
cocl2·6h2o0.001～0.008；
l-組氨酸10～30；
nasio3·9h2o0.001～0.01；
l-異亮氨酸25～75；
na3vo4·12h2o0.0005～0.005；
l-賴氨酸鹽酸20～60；
sncl2·2h2o0.00001～0.0001；
l-蛋氨酸10～30；
na2seo30.002～0.01；
l-苯丙氨酸10～30；
feso4·7h2o0.2～1.6；
l-脯氨酸10～30；
葡萄糖1000～4000；
l-絲氨酸15～45；
維生素c0.176～0.704；
l-蘇氨酸10～30；
對羥基苯甲酸0.5～1.5；
l-色氨酸5～15；
丙酮酸鈉55～550；
l-纈氨酸10～30；
亞油酸0.01～0.05；
l-亮氨酸25～75；
β-巰基乙醇0.8～4.0；
二水l-酪氨酸二鈉144～432；
乙醇胺1～5；
l-胱氨酸二鹽酸25～75；
地塞米松0.001～0.005；
人轉鐵蛋白5～50；
人血清白蛋白1000～5000；
纖粘連蛋白0.5～5；
重組人成纖維細胞生長因子0.1～10；
重組人轉化因子β0.1～10；
重組人表皮生長因子0.1～10；
胰島素：8～20；
純化人轉鐵蛋白液：1～30；
膽固醇：20～60；
過氧化氫酶：20～50；
亞硒酸鈉：17.3～35.0；
1％(質量百分數)二巰基乙醇溶液：0.35～1.0ml/l；
余量為水。
所述重組人成纖維細胞生長因子、重組人轉化因子、重組人表皮生長因子均可市場購買得到，本發(fā)明所用為進口產品，均購自peprotech，商品名稱為：egf(重組人表皮生長因子)，商品號為af-100-15-50；商品名稱為tgf-b(重組人轉化因子)，貨號：100-21-100；商品名為(fgf)成纖維細胞生長因子，商品貨號：100-18b-50。
本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基的制備方法為：取上述除水外的組分，根據其各自溶解特性分類溶解，然后混合，加入水使各組分終濃度如上所述，調節(jié)ph值至7.1～7.4，即得，工業(yè)濾芯過濾，同時氮氣保護進行分裝(避免不穩(wěn)定性成分被氧化)。
本發(fā)明的人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)基，不含任何血清組分，且成分明確，克服了異種蛋白污染和致病微生物的危險,解決了mscs臨床應用的生物安全性問題。
采用本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人臍帶間充質干細胞，可在體外獲得高數量、高純度并且安全優(yōu)質的臍帶間充質干細胞，同時可提高細胞存活率，維持干細胞的特性。本發(fā)明可解決細胞數量不夠的問題，且每批次的細胞數量、存活率及免疫表型更加穩(wěn)定，符合相關指標要求。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
下述實施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現有技術中已有的常規(guī)儀器、試劑、材料等，可通過正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實施例中所涉及的實驗方法，檢測方法等，若無特別說明，均為現有技術中已有的常規(guī)實驗方法，檢測方法等。
實施例1制備人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)基
各原料的濃度如下，各濃度單位若無特別說明，均為mg/l：
l-精氨酸200；
cuso4·5h2o0.002；
l-天門冬酰胺50；
l-天門冬氨酸20；
l-谷氨酸20；
ni(no3)2·6h2o0.0001；
l-谷氨酰胺300；
znso4·7h2o0.3；
甘氨酸10；
cocl2·6h2o0.005；
l-組氨酸20；
nasio3·9h2o0.005；
l-異亮氨酸50；
na3vo4·12h2o0.002；
l-賴氨酸鹽酸40；
sncl2·2h2o0.00005；
l-蛋氨酸20；
na2seo30.005；
l-苯丙氨酸20；
feso4·7h2o1.0；
l-脯氨酸20；
葡萄糖3000；
l-絲氨酸30；
維生素c0.500；
l-蘇氨酸20；
對羥基苯甲酸1.0；
l-色氨酸10；
丙酮酸鈉300；
l-纈氨酸20；
亞油酸0.03；
l-亮氨酸50；
β-巰基乙醇2.0；
二水l-酪氨酸二鈉300；
乙醇胺3；
l-胱氨酸二鹽酸50；
地塞米松0.003；
人轉鐵蛋白30；
人血清白蛋白2500；
纖粘連蛋白3；
重組人成纖維細胞生長因子5；
重組人轉化因子β5；
重組人表皮生長因子5；
胰島素：10；
純化人轉鐵蛋白：20；
膽固醇：40；
過氧化氫酶：30；
亞硒酸鈉：25.0；
1％二巰基乙醇溶液：0.8ml/l；
余量為水。
制備方法為：取上述除水外的組分，根據其各自溶解特性分類溶解，然后混合，加入水使各組分終濃度如上所述，調節(jié)ph值至7.1～7.4，即得，工業(yè)濾芯過濾，同時氮氣保護進行分裝(避免不穩(wěn)定性成分被氧化)。
實施例2制備人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)基
各原料的濃度如下，各濃度單位若無特別說明，均為mg/l：
l-精氨酸100；
cuso4·5h2o0.0005；
l-天門冬酰胺75；
l-天門冬氨酸30；
l-谷氨酸10；
ni(no3)2·6h2o0.00002；
l-谷氨酰胺500；
znso4·7h2o0.6；
甘氨酸5；
cocl2·6h2o0.001；
l-組氨酸30；
nasio3·9h2o0.01；
l-異亮氨酸25；
na3vo4·12h2o0.0005；
l-賴氨酸鹽酸60；
sncl2·2h2o0.0001；
l-蛋氨酸10；
na2seo30.002；
l-苯丙氨酸30；
feso4·7h2o1.6；
l-脯氨酸10；
葡萄糖1000；
l-絲氨酸45；
維生素c0.704；
l-蘇氨酸10；
對羥基苯甲酸0.5；
l-色氨酸15；
丙酮酸鈉550；
l-纈氨酸10；
亞油酸0.01；
l-亮氨酸75；
β-巰基乙醇4.0；
二水l-酪氨酸二鈉144；
乙醇胺1；
l-胱氨酸二鹽酸75；
地塞米松0.005；
人轉鐵蛋白5；
人血清白蛋白1000；
纖粘連蛋白5；
重組人成纖維細胞生長因子10；
重組人轉化因子β0.1；
重組人表皮生長因子0.1；
胰島素：20；
純化人轉鐵蛋白：30；
膽固醇：20；
過氧化氫酶：20；
亞硒酸鈉：35.0；
1％二巰基乙醇溶液：1.0ml/l；
余量為水。
制備方法為：取上述除水外的組分，根據其各自溶解特性分類溶解，然后混合，加入水使各組分終濃度如上所述，調節(jié)ph值至7.1～7.4，即得，工業(yè)濾芯過濾，同時氮氣保護進行分裝(避免不穩(wěn)定性成分被氧化)。
實施例3制備人臍帶間充質干細胞無血清培養(yǎng)基
各原料濃度如下，各濃度單位若無特別說明，均為mg/l：
l-精氨酸300；
cuso4·5h2o0.005；
l-天門冬酰胺25；
l-天門冬氨酸10；
l-谷氨酸30；
ni(no3)2·6h2o0.0002；
l-谷氨酰胺0；
znso4·7h2o0.06；
甘氨酸15；
cocl2·6h2o0.008；
l-組氨酸10；
nasio3·9h2o0.001；
l-異亮氨酸75；
na3vo4·12h2o0.005；
l-賴氨酸鹽酸20；
sncl2·2h2o0.00001；
l-蛋氨酸30；
na2seo30.01；
l-苯丙氨酸10；
feso4·7h2o0.2；
l-脯氨酸30；
葡萄糖4000；
l-絲氨酸15；
維生素c0.176；
l-蘇氨酸30；
對羥基苯甲酸1.5；
l-色氨酸5；
丙酮酸鈉55；
l-纈氨酸30；
亞油酸0.05；
l-亮氨酸25；
β-巰基乙醇0.8；
二水l-酪氨酸二鈉432；
乙醇胺5；
l-胱氨酸二鹽酸25；
地塞米松0.001；
人轉鐵蛋白50；
人血清白蛋白5000；
纖粘連蛋白0.5；
重組人成纖維細胞生長因子0.1；
重組人轉化因子β10；
重組人表皮生長因子10；
胰島素：8；
純化人轉鐵蛋白：1；
膽固醇：60；
過氧化氫酶：50；
亞硒酸鈉：17.3；
1％二巰基乙醇溶液：0.35ml/l；
余量為水。
制備方法為：取上述除水外的組分，根據其各自溶解特性分類溶解，然后混合，加入水使各組分終濃度如上所述，調節(jié)ph值至7.1～7.4，即得，工業(yè)濾芯過濾，同時氮氣保護進行分裝(避免不穩(wěn)定性成分被氧化)。
實驗
將實施例2制備的培養(yǎng)基置于t25細胞培養(yǎng)瓶中，將臍帶間充質干細胞以1.0×104cells/cm2接種，在溫度37℃下培養(yǎng)，統計原代細胞的爬出時間，每代的生長時間。
同時，以lonza無血清培養(yǎng)基(市場購買得到)為對照培養(yǎng)臍帶間充質干細胞。
結論：
原代細胞爬出時間：通常的細胞培養(yǎng)基進行臍帶植塊法爬細胞，8～10天可見細胞爬出，而本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基，爬出細胞時間縮短至7天,提高了細胞分離效率。
細胞每代生長時間，經過連續(xù)10代監(jiān)測，平均每代生長時間在2～3天，比lonza無血清培養(yǎng)基提高了一天，節(jié)約了培養(yǎng)時間，提高了工作效率。
連續(xù)傳代次數：傳統的msc無血清培養(yǎng)基傳代至6代以后，細胞生長變緩慢，本發(fā)明的培養(yǎng)基可連續(xù)傳代至10代，細胞仍保持其分化潛能，而lonza培養(yǎng)基傳代至第8代，細胞生長明顯變緩，導致后期無法傳代。
上述雖然結合實施例對本發(fā)明的具體實施方式進行了描述，但并非對本發(fā)明保護范圍的限制，所屬領域技術人員應該明白，在本發(fā)明的技術方案的基礎上，本領域技術人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護范圍以內。