本發(fā)明屬于微生物肥料領(lǐng)域，具體地說，涉及一種兼具土壤改良和青枯病防治作用的復(fù)合菌劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
作物青枯病的防治一直是一個世界性難題。早期，針對作物青枯病的防治，國內(nèi)外專家在抗病品種選育、化學(xué)防治、農(nóng)業(yè)措施等方面進(jìn)行了大量的研究，但仍存在一些問題，如品種抗病性能低，抗性易喪失；化學(xué)防治藥劑后期防效差，病菌易產(chǎn)生抗藥性，且環(huán)境負(fù)面效應(yīng)明顯；農(nóng)業(yè)措施易受受地域條件限制，難于大面積推廣，等等。目前，隨著可持續(xù)、生態(tài)農(nóng)業(yè)觀念的不斷深入，生物防治越來越受到人們的重視。尤其是微生物肥料快速發(fā)展的今天，越來越多的專家學(xué)者將微生物肥料與作物病蟲害防治聯(lián)合起來研究，具有抗病蟲害功能的微生物肥料也越來越多。
微生物肥料是以微生物的生命活動導(dǎo)致作物得到特定肥料效應(yīng)的一種制品，其含有大量有益微生物，可以改善作物營養(yǎng)條件、固定氮素和活化土壤中一些無效態(tài)的營養(yǎng)元素，創(chuàng)造良好的土壤微生態(tài)環(huán)境來促進(jìn)作物的生長。微生物肥料中含有的有益微生物能產(chǎn)生大量糖類物質(zhì)，且該糖類物質(zhì)占土壤有機(jī)質(zhì)的0.1％，當(dāng)微生物肥料施入到土壤中后，與植物粘液，礦物胚體和有機(jī)膠體結(jié)合在一起，可改善土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)土壤物理性能和參與腐殖質(zhì)形成。
可見，研究開發(fā)抗病、促生等多功能微生物菌劑，是當(dāng)前微生物肥料重點(diǎn)研究的內(nèi)容之一，可以達(dá)到防治作物病害和提高土壤肥力的雙重目的，符合當(dāng)今生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展方向。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明針對上述的問題，提供了一種兼具土壤改良和青枯病防治作用的復(fù)合菌劑及其制備方法，該菌劑由多種有益微生物復(fù)合構(gòu)建而成，不僅可改善土壤微生物群體結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)作物養(yǎng)分吸收能力，而且還能有效防治作物青枯病害的發(fā)生，是生物防治作物青枯病害發(fā)生的有效途徑之一。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種兼具土壤改良和青枯病防治作用的復(fù)合菌劑，按照體積比由以下組分構(gòu)成：枯草芽孢桿菌菌懸液1份、地衣芽孢桿菌菌懸液1份、凝結(jié)芽孢桿菌菌懸液1.5份-3份、側(cè)孢芽孢桿菌菌懸液1.5份-3份、多粘芽孢桿菌菌懸液1份。
進(jìn)一步地，所述枯草芽孢桿菌菌懸液、地衣芽孢桿菌菌懸液、凝結(jié)芽孢桿菌菌懸液、側(cè)孢芽孢桿菌菌懸液和多粘芽孢桿菌菌懸液的濃度大于1×108cfu/ml。
進(jìn)一步地，所述枯草芽孢桿菌菌懸液、地衣芽孢桿菌菌懸液、凝結(jié)芽孢桿菌菌懸液、側(cè)孢芽孢桿菌菌懸液和多粘芽孢桿菌菌懸液通過以下方法制備得到：在無菌條件下，將保存在-4℃環(huán)境下的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌菌種分別接種至tsa平板培養(yǎng)基上，28-30℃下培養(yǎng)48h，其中凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)溫度為45℃；之后分別挑取各菌單菌落接種至tsa液體培養(yǎng)基中，28-30℃，200-220r/min下振蕩培養(yǎng)24h，即得枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌菌懸液。鏡檢，確保各菌菌懸液濃度大于1×108cfu/ml。
進(jìn)一步地，所述tsa培養(yǎng)基為：酪蛋白胰酶消化物15.0g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂15.0g，ph值7.3；滅菌條件為：壓強(qiáng)0.1-0.15mpa，溫度121℃，時間30min。
本發(fā)明公開了一種兼具土壤改良和青枯病防治作用的復(fù)合菌劑的制備方法，包括以下步驟：
步驟1、制備枯草芽孢桿菌菌懸液、地衣芽孢桿菌菌懸液、凝結(jié)芽孢桿菌菌懸液、側(cè)孢芽孢桿菌菌懸液和多粘芽孢桿菌菌懸液：在無菌條件下，將保存在-4℃環(huán)境下的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌菌種分別接種至tsa平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)；之后分別挑取各菌單菌落接種至tsa液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，即得枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌菌懸液；
步驟2、稱量：按照體積比稱量以下組分：枯草芽孢桿菌菌懸液1份、地衣芽孢桿菌菌懸液1份、凝結(jié)芽孢桿菌菌懸液1.5份-3份、側(cè)孢芽孢桿菌菌懸液1.5份-3份、多粘芽孢桿菌菌懸液1份；
步驟3、將稱量好的枯草芽孢桿菌菌懸液、地衣芽孢桿菌菌懸液、凝結(jié)芽孢桿菌菌懸液、側(cè)孢芽孢桿菌菌懸液和多粘芽孢桿菌菌懸液混合均勻，制備得到兼具土壤改良和青枯病防治作用的復(fù)合菌劑。
進(jìn)一步地，步驟1中的所述枯草芽孢桿菌菌懸液、側(cè)孢芽孢桿菌菌懸液和多粘芽孢桿菌菌懸液的濃度均大于1×108cfu/ml。
進(jìn)一步地，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌和多粘芽孢桿菌菌種在tsa平板培養(yǎng)基上的培養(yǎng)條件為：溫度28-30℃，時間48h；凝結(jié)芽孢桿菌菌種在tsa平板培養(yǎng)基上的培養(yǎng)條件為：溫度45℃，時間48h。
進(jìn)一步地，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌單菌落在tsa液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件為：溫度28-30℃，轉(zhuǎn)速200-220r/min，時間24h。
進(jìn)一步地，tsa培養(yǎng)基為：酪蛋白胰酶消化物15.0g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂15.0g，ph值7.3。
進(jìn)一步地，步驟1中的tsa培養(yǎng)基滅菌條件為：壓強(qiáng)0.1-0.15mpa，溫度121℃，時間30min。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：
1)本發(fā)明的復(fù)合菌劑含有大量有益菌類，具有無毒害、無污染、活性高等優(yōu)點(diǎn)，能改善土壤微生物群體結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)作物對氮磷鉀等養(yǎng)分的吸收及利用，對土壤改良和肥力提升有一定效果。
2)本發(fā)明的復(fù)合菌劑已經(jīng)番茄盆栽試驗驗證，其番茄青枯病的防治效果最高可達(dá)67.84％，預(yù)防及防治效果較好。
3)本發(fā)明復(fù)合菌劑由枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌構(gòu)建而成，芽孢類桿菌易于發(fā)酵生產(chǎn)，不僅可降低菌劑生產(chǎn)成本，也可豐富對作物青枯病有防治作用的功能菌品種。
4)本發(fā)明復(fù)合菌劑由枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌構(gòu)建而成，不僅可有效防治作物青枯病害的發(fā)生，而且還對土壤理化性狀的改善及質(zhì)地改良起到一定作用。
當(dāng)然，實施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。
具體實施方式
以下將配合實施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方式，藉此對本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達(dá)成技術(shù)功效的實現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實施。
本發(fā)明公開了一種兼具土壤改良和青枯病防治作用的復(fù)合菌劑，按照體積比由以下組分構(gòu)成：枯草芽孢桿菌菌懸液1份、地衣芽孢桿菌菌懸液1份、凝結(jié)芽孢桿菌菌懸液1.5份-3份、側(cè)孢芽孢桿菌菌懸液1.5份-3份、多粘芽孢桿菌菌懸液1份。
本發(fā)明還提供一種兼具土壤改良和青枯病防治作用的復(fù)合菌劑的制備方法，包括以下步驟：
步驟1、制備各菌菌懸液：在無菌條件下，將保存在-4℃環(huán)境下的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌菌種分別接種至tsa平板培養(yǎng)基上，28-30℃下培養(yǎng)48h，其中凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)溫度為45℃。之后分別挑取各菌單菌落接種至tsa液體培養(yǎng)基中，28-30℃，200-220r/min下振蕩培養(yǎng)24h，即得枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌菌懸液。鏡檢，確保各菌菌懸液濃度大于1×108cfu/ml。
其中tsa培養(yǎng)基為：酪蛋白胰酶消化物15.0g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂15.0g，ph值7.3。在0.1-0.15mpa，121℃條件下滅菌30分min，備用。
步驟2、配制：
將步驟1中制備得到的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌菌懸液，按體積比1:1:1.5-3:1.5-3:1混合均勻，制備得到兼具土壤改良和青枯病防治作用的復(fù)合菌劑。
實施例1
一種兼具土壤改良和青枯病防治作用的復(fù)合菌劑的制備方法，包括以下步驟：
步驟1、制備各菌菌懸液：在無菌條件下，將保存在-4℃環(huán)境下的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌菌種分別接種至tsa平板培養(yǎng)基上，29℃下培養(yǎng)48h，其中，凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)溫度為45℃。之后分別挑取各菌單菌落接種至tsa液體培養(yǎng)基中，29℃，210r/min下振蕩培養(yǎng)24h，即得枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌菌懸液。鏡檢，確保各菌菌懸液濃度大于1×108cfu/ml。
其中tsa培養(yǎng)基為：酪蛋白胰酶消化物15.0g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂15.0g，ph值7.3。在0.12mpa，121℃條件下滅菌30min，備用。
步驟2、配制：
將步驟1中制備得到的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌菌懸液，按體積比1:1:2:2:1混合均勻，制備得到兼具土壤改良和青枯病防治作用的復(fù)合菌劑。
實施例2
一種兼具土壤改良和青枯病防治作用的復(fù)合菌劑的制備方法，包括以下步驟：
步驟1、制備各菌菌懸液：在無菌條件下，將保存在-4℃環(huán)境下的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌菌種分別接種至tsa平板培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)48h，其中，凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)溫度為45℃。之后分別挑取各菌單菌落接種至tsa液體培養(yǎng)基中，28℃，220r/min下振蕩培養(yǎng)24h，即得枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌菌懸液。鏡檢，確保各菌菌懸液濃度大于1×108cfu/ml。
其中tsa培養(yǎng)基為：酪蛋白胰酶消化物15.0g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂15.0g，ph值7.3。在0.1mpa，121℃條件下滅菌30min，備用。
步驟2、配制：
將步驟1中制備得到的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌菌懸液，按體積比1:1:1.5:1.5:1混合均勻，制備得到兼具土壤改良和青枯病防治作用的復(fù)合菌劑。
實施例3
一種兼具土壤改良和青枯病防治作用的復(fù)合菌劑的制備方法，包括以下步驟：
步驟1、制備各菌菌懸液：在無菌條件下，將保存在-4℃環(huán)境下的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌菌種分別接種至tsa平板培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)48h，其中，凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)溫度為45℃。之后分別挑取各菌單菌落接種至tsa液體培養(yǎng)基中，30℃，220r/min下振蕩培養(yǎng)24h，即得枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌菌懸液。鏡檢，確保各菌菌懸液濃度大于1×108cfu/ml。
其中tsa培養(yǎng)基為：酪蛋白胰酶消化物15.0g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂15.0g，ph值7.3。在0.15mpa，121℃條件下滅菌30min，備用。
步驟2、配制：
將步驟1中制備得到的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌菌懸液，按體積比1:1:3:3:1混合均勻，制備得到兼具土壤改良和青枯病防治作用的復(fù)合菌劑。
下面結(jié)合具體的實驗來說明本發(fā)明復(fù)合菌劑對番茄青枯病防治效果：
(1)青枯病菌接菌方法
首先將供試土壤曝曬2天，消毒后裝盆，每盆缽裝土6kg，后接青枯病菌菌液(菌懸液濃度大于1×108cfu/ml)200ml/盆，攪拌均勻，保濕培養(yǎng)5天，備用。
(2)功能菌接菌方法
選取長勢一致的4-6葉番茄幼苗移栽到預(yù)處理過青枯菌的盆缽中，移栽時用處理1的功能菌液蘸根10min，之后分別在移栽后第7、20天進(jìn)行功能菌液灌根處理，各功能菌(菌懸液濃度大于1×108cfu/ml)接種量60ml/每盆。
(3)試驗設(shè)計
ck1：只接青枯病菌
ck2：不接任何菌
處理1：實施例1制備的復(fù)合菌劑+青枯病菌
處理2：實施例2制備的復(fù)合菌劑+青枯病菌
處理3：實施例3制備的復(fù)合菌劑+青枯病菌
試驗共設(shè)3個處理，每處理3個重復(fù)，每個重復(fù)10盆，每盆1株番茄苗。試驗期間正常水分管理。另外，為滿足番茄生長需求，在裝土?xí)r每盆追施尿素2.06g，過磷酸鈣0.94g，硫酸鉀2.72g。移栽40天后，記錄番茄發(fā)病情況，計算其病情指數(shù)及青枯病抑制率，測定土壤中ph、有機(jī)質(zhì)、堿解氮、礦化氮、速效磷、速效鉀含量，統(tǒng)計結(jié)果見表1-4。
番茄青枯病病情調(diào)查分級標(biāo)準(zhǔn)采用5級標(biāo)準(zhǔn)法，即0級：無??；1級：植株有1-2片葉凋萎；2級：植株有3-5片葉凋萎；3級：植株大部分葉片凋萎；4級：植株凋萎枯死或即將枯死。
病情指數(shù)＝[σ(病級株數(shù)×病害級數(shù))/(該處理盆栽苗總和×發(fā)病最重級的代表數(shù)值)]×100。
抑制率(％)＝(對照發(fā)病指數(shù)-處理病情指數(shù))×100/對照發(fā)病指數(shù)。
表1原始土壤基本理化性狀
表2番茄盆栽40天后土壤基本理化性狀變化
表3盆栽40天后番茄青枯病發(fā)病情況統(tǒng)計
表4盆栽40d對青枯病菌的抑制效果
由表1、表2可知，本發(fā)明實施例1-3處理過的土壤ph、有機(jī)質(zhì)、堿解氮、礦化氮、速效磷、速效鉀含量基本上均高于原始土壤、不接菌處理(ck1)和只接青枯菌處理(ck2)，只有有機(jī)質(zhì)含量稍微低于只接青枯菌處理(ck2)，可能是由于青枯病菌的接入導(dǎo)致植物根系病變，根系部分?jǐn)嗔堰M(jìn)入土壤，增加了該處理的土壤有機(jī)質(zhì)含量。說明接菌本發(fā)明復(fù)合菌劑可在一定程度上改良土壤基本理化性狀，提高土壤肥力。
由表3、表4可知，在同時接種番茄青枯病菌的基礎(chǔ)上，本發(fā)明復(fù)合菌劑處理番茄后，青枯病病情指數(shù)較低，抑制率最高可達(dá)67.84％，說明本發(fā)明復(fù)合菌劑在一定程度上對番茄青枯病有一定的防治效果。
上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識進(jìn)行改動。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。