本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種具有抗腫瘤或癌癥活性的美蠊肽a及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：目前，由于工業(yè)發(fā)展帶來(lái)的環(huán)境污染等問(wèn)題，人類(lèi)的生存環(huán)境質(zhì)量不斷下降，腫瘤疾病的發(fā)病率和致死率也不斷上升，嚴(yán)重威脅人們的健康和生活。癌癥的發(fā)生與多種原因影響，例如環(huán)境污染、化學(xué)污染、電離輻射、自由基毒素或微生物及其代謝毒素等致癌物的影響，也可能受機(jī)體自身的影響，例如遺傳特性、內(nèi)分泌失衡、免疫功能紊亂等也會(huì)導(dǎo)致正常細(xì)胞發(fā)生癌變。國(guó)際抗癌聯(lián)盟發(fā)布的數(shù)據(jù)，世界范圍內(nèi)癌癥死亡比艾滋病、瘧疾和結(jié)核病的總數(shù)還要多，如果不開(kāi)發(fā)有效藥物，癌癥死亡人數(shù)將到2030年達(dá)到1700萬(wàn)。目前，世界范圍內(nèi)還沒(méi)有開(kāi)發(fā)出針對(duì)肝癌的特效藥物，采取預(yù)防和治療的手段，預(yù)防措施有定期體檢，治療一般臨床上采用化療，不僅患者痛苦而且康復(fù)情況也不樂(lè)觀。雖然市場(chǎng)上一些抗癌藥物，但是由于價(jià)格昂貴，副作用較強(qiáng)、療效不明顯等原因未能得到醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛使用。美洲大蠊，俗稱(chēng)蟑螂，其應(yīng)用于藥物中最初是利用其抗菌特性，例如，藍(lán)江林等人報(bào)道從美洲大蠊中提取分離的抗菌肽對(duì)大腸桿菌有抑菌作用[藍(lán)江林,周先治,卓侃,等，美洲大蠊(periplanetaamericanal.)抗菌肽殺菌作用初步觀察，福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2004，33(2):166]。近年來(lái)，隨著人們對(duì)蟑螂進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)蟑螂提取物具有抗腫瘤方面的應(yīng)用，例如陳利銘等人報(bào)道蟑螂提取物at2在抗腫瘤作用中的研究，藥理實(shí)驗(yàn)表明：at2具有抗腫瘤活性，能增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能，并能使脾臟重量增加，在體外可增加t淋巴細(xì)胞對(duì)cona的轉(zhuǎn)化反應(yīng)(陳利銘，蟑螂提取物at2抗癌作用的臨床及實(shí)驗(yàn)研究，中西醫(yī)結(jié)合雜志，1986，(11):648)。盡管現(xiàn)有技術(shù)中公開(kāi)了蟑螂中存在有效抗癌的活性成分，但是成功分離純化的抗癌活性成分種類(lèi)較少，現(xiàn)有技術(shù)中大部分是研究美洲大蠊中活性物質(zhì)的提取方法，例如用醇水混合溶劑提取美洲大蠊蟲(chóng)體具有抗腫瘤(cn101057872；zl200710067706.x；zl200810059054.x)和體外抗單純皰疹病毒的功效(zl200810060885.9)；以及用濾孔小于5000道爾頓(即<5kda)的超濾膜進(jìn)行分離，能得到新的抗單純皰疹病毒和光譜抗菌活性部位(zl201210137422.4；zl201210137410.1)。這些提取物對(duì)進(jìn)一步制備抗癌藥物存在較大影響，例如提取物中的雜質(zhì)容易引起超敏反應(yīng)，限制了用藥的途徑，同時(shí)進(jìn)一步分離純化還會(huì)大大降低藥物的療效。專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)為cn102108090的專(zhuān)利公開(kāi)了一種二氫異香豆素葡萄糖苷化合物及其制備方法與應(yīng)用，其描述了該化合物用于治療潰瘍、湯上、炎癥等，而非細(xì)胞毒性的抗腫瘤藥物之用。因此，目前對(duì)美洲大蠊中單一成分的活性物質(zhì)的研究較為匱乏，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足醫(yī)藥市場(chǎng)的需求。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗腫瘤或癌癥活性的美蠊肽a及其應(yīng)用，不僅具有抗腫瘤或癌癥活性，而且還能夠方便經(jīng)濟(jì)地以人工合成方式大量生產(chǎn)。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種具有抗腫瘤或癌癥活性的美蠊肽a，具有如序列表seqidno.1所示的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了所述的美蠊肽a在制備預(yù)防或治療腫瘤或癌癥的藥物中的應(yīng)用，所述癌癥為肺癌或口腔上皮癌。優(yōu)選的，藥物的劑型為注射劑或粉末劑。優(yōu)選的，所述藥物包括美蠊肽a和藥用輔料。優(yōu)選的，所述藥物為注射劑時(shí)，美蠊肽a在注射劑中的質(zhì)量濃度為0.01～100mg/ml。優(yōu)選的，所述注射劑中美蠊肽a的質(zhì)量濃度為0.1～20mg/ml。優(yōu)選的，當(dāng)藥物為注射劑時(shí)，所述藥用輔料為質(zhì)量濃度為0.9％的氯化鈉溶液。本發(fā)明提供了一種具有抗腫瘤或癌癥活性的美蠊肽a，具有如序列表seqidno.1所示的氨基酸序列。所述美蠊肽對(duì)口腔上皮癌細(xì)胞kb和人肺癌細(xì)胞a549具有顯著細(xì)胞毒活性，具體地與美洲大蠊提取物相比，美蠊肽a對(duì)口腔上皮癌細(xì)胞kb的抑制濃度比美洲大蠊精提物降低了7.29倍，美蠊肽a對(duì)人肺癌細(xì)胞a549的抑制濃度比美洲大蠊精提物降低了7.75倍，說(shuō)明本發(fā)明提供的美蠊肽a較常規(guī)提取的美洲大蠊提取物具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，能夠有效抑制腫瘤或癌癥細(xì)胞的增殖。同時(shí)，本發(fā)明提供的美蠊肽a為多肽，能夠方便經(jīng)濟(jì)地以人工合成方式大量生產(chǎn)，從而擺脫活性物質(zhì)來(lái)源的限制，能夠滿(mǎn)足市場(chǎng)和生產(chǎn)的需求。本發(fā)明提供的所述的美蠊肽a在制備預(yù)防或治療腫瘤或癌癥的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的應(yīng)用沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有毒副作用；具有用量小、安全、長(zhǎng)期穩(wěn)定，機(jī)體無(wú)排除反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供了一種具有抗腫瘤或癌癥活性的美蠊肽a，具有如序列表seqidno.1所示的氨基酸序列。本發(fā)明中，所述具有抗腫瘤或癌癥活性的美蠊肽a的來(lái)源沒(méi)有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的多肽合成方法即可。本發(fā)明實(shí)施例中，所述美蠊肽a的來(lái)源委托生工生物(上海)股份有限公司按照seqidno.1所示的氨基酸序列合成。本發(fā)明還提供了所述的美蠊肽a在制備預(yù)防或治療腫瘤或癌癥的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明中，藥物的劑型優(yōu)選為注射劑或粉末劑，優(yōu)選為注射劑。本發(fā)明中，所述藥物優(yōu)選包括美蠊肽a和藥用輔料。本發(fā)明中，所述藥物為注射劑時(shí)，美蠊肽a在注射劑中的質(zhì)量濃度優(yōu)選為0.01～100mg/ml，更優(yōu)選為0.1～20mg/ml，最優(yōu)選1mg/ml。本發(fā)明中，當(dāng)藥物為注射劑時(shí)，所述藥用輔料為質(zhì)量濃度為0.9％的氯化鈉溶液。本發(fā)明中，所述注射劑的制備方法沒(méi)有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的注射劑的制備方法即可。本發(fā)明中，所述注射劑的注射劑量為250～2000ml/d，更優(yōu)選為500ml/d。所述注射劑的注射的間隔時(shí)間優(yōu)選為6～36h，更優(yōu)選為24h。。本發(fā)明中，所述凍干粉使用時(shí)，優(yōu)選配置成的注射液中美蠊肽a人工序列的質(zhì)量濃度優(yōu)選為0.01～100mg/ml，更優(yōu)選為0.1～20mg/ml，最優(yōu)選1mg/ml。本發(fā)明中，除注射劑的藥物其他劑型的制備方法沒(méi)有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的制備方法即可。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的一種具有抗腫瘤或癌癥活性的美蠊肽a及其應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明，但是不能把它們理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。實(shí)施例1美蠊肽a是存在于美洲大蠊藥材中。所述美蠊肽a的提取方法包括以下步驟：將美洲大蠊藥材經(jīng)溶劑提取后，再經(jīng)反相柱層析、葡聚糖凝膠柱層析、凝膠電泳及膠內(nèi)回收技術(shù)等反復(fù)提取分離后，得到含有美蠊肽a的樣品。將美蠊肽a進(jìn)行maldi-tofms質(zhì)譜(ultraflextof/tof，bruker)分析。將質(zhì)譜所得所有肽段的質(zhì)量數(shù)及其ms圖譜(碎片離子質(zhì)量數(shù))同時(shí)送入ncbinr數(shù)據(jù)庫(kù)，使用mascot(http://www.matrixscience.com/)，matrixscienceltd，uk中的串級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)搜索功能(msionssearch)與數(shù)據(jù)庫(kù)中相應(yīng)肽段的理論質(zhì)量數(shù)及其ms裂解圖譜進(jìn)行相關(guān)性比較檢索鑒定。通過(guò)對(duì)美蠊肽a的肽質(zhì)量指紋圖譜數(shù)據(jù)的mascot軟件搜索分析，得到的最高匹配分?jǐn)?shù)為52分。8個(gè)肽段的串級(jí)質(zhì)譜圖和已知蛋白匹配，但最高的匹配率只有30％，說(shuō)明已知的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有與蛋白美蠊肽a相匹配的任何蛋白，即美蠊肽a是一種未報(bào)道的新多肽或蛋白類(lèi)物質(zhì)。將美蠊肽a的多肽序列thr-val-tyr-ser-arg-cys-gly-leu-val-gln-ala-lys委托給生工生物(上海)股份有限公司合成。將美蠊肽a(n-tvysrcglvqak)在ncbi蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blast序列比對(duì)，根據(jù)匹配情況系統(tǒng)給出分?jǐn)?shù)(score)和期望值(expectvalue)。通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)n-末端氨基酸序列同源性很差，最高得分(score)＝15.9，最小期望值(evalve)＝0.88，表明沒(méi)有檢索到與之相匹配的多肽，由此進(jìn)一步推斷美蠊肽a應(yīng)該為一種未報(bào)道的新多肽。合成的美蠊肽a經(jīng)過(guò)注射用水配置成濃度為1mg/ml的母液，保存于4℃環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)時(shí)用培養(yǎng)基將藥物母液稀釋到所需濃度即可。實(shí)施例2口腔上皮癌細(xì)胞kb用rpmi1640培養(yǎng)基(購(gòu)自gibco，usa)培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10％的胎牛血清，100u/毫升青霉素和100u/毫升的鏈霉素。細(xì)胞以每孔5×103的濃度加入到96孔板中，在37℃含5％co2潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。細(xì)胞存活率的測(cè)定用mtt法：細(xì)胞經(jīng)過(guò)48小時(shí)的孵育后棄去上清液，分別將新配的美蠊肽a的二甲亞砜溶液以濃度梯度加入到各孔中，使孔中美蠊肽a最終濃度分別為300,100,30,10和3μg/ml，以順鉑為陽(yáng)性對(duì)照，每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml)(購(gòu)自gibco，usa)，再繼續(xù)在37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)后，每孔中加入150μl二甲亞砜，于微量震蕩器上震蕩至還原的mtt晶體甲臜(formazan)完全溶解，用酶標(biāo)儀(型號(hào)為synergy-ht型，購(gòu)自bio-tek公司)在570nm波長(zhǎng)下比色，細(xì)胞存活率由樣品相對(duì)于對(duì)照品的比值計(jì)算。其中美蠊肽a對(duì)kb細(xì)胞半抑制濃度(ic50)由劑量效應(yīng)曲線得到。對(duì)比例1參照公開(kāi)號(hào)為cn102743739b的授權(quán)專(zhuān)利制備美洲大蠊水提物美洲大蠊藥材3公斤，加雙蒸水10000毫升，45℃浸泡提取1次，24小時(shí)；50℃浸泡提取1次，24小時(shí)；55℃浸泡提取1次，24小時(shí)。合并提取液，減壓濃縮至干，真空干燥，即得美洲大蠊水提物。將新提取的美洲大蠊水提物的二甲亞砜溶液以濃度梯度加入到各孔中，使孔中美洲大蠊水提物最終濃度分別為300,100,30,10和3μg/ml，備用。對(duì)比例2參照公開(kāi)號(hào)為cn102743739b的授權(quán)專(zhuān)利制備美洲大蠊分子量<5kda多肽樣品取對(duì)比例1中的美洲大蠊水提物300毫克，用水1000毫升溶解；調(diào)制其ph值為11后，傾入置有孔徑為5kda的超濾膜的超濾裝置中，以4500r/min轉(zhuǎn)速超濾30分鐘。濾液真空干燥，即得分子量<5kda多肽樣品。將新提取的美洲大蠊分子量<5kda多肽樣品的二甲亞砜溶液以濃度梯度加入到各孔中，使孔中美洲大蠊分子量<5kda多肽樣品最終濃度分別為300,100,30,10和3μg/ml，備用。將對(duì)比例1制備得到的美洲大蠊水提物替換實(shí)施例2中的美蠊肽a，進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例2和對(duì)比例1的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。表1美蠊肽a及對(duì)比例1對(duì)口腔上皮癌細(xì)胞kb的細(xì)胞毒試驗(yàn)樣品ic50(微克/毫升)美蠊肽a25.2陽(yáng)性對(duì)照順鉑4.04對(duì)比例1>300對(duì)比例2183.74結(jié)果表明，美蠊肽a對(duì)口腔上皮癌細(xì)胞(kb)具有顯著細(xì)胞毒活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：kb細(xì)胞是測(cè)試化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性的有效工具和評(píng)價(jià)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)表明美蠊肽a對(duì)kb細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒性，與美洲大蠊精提物(對(duì)比例2)相比，半抑制濃度降低了7.29倍，這說(shuō)明本發(fā)明提供的美蠊肽a能夠經(jīng)過(guò)進(jìn)一步發(fā)掘優(yōu)化而發(fā)展成為新的具有抗多種腫瘤作用的藥物。實(shí)施例3a549(人肺癌細(xì)胞)用rpmi1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10％的胎牛血清，100u/毫升青霉素和100u/毫升的鏈霉素。細(xì)胞以每孔5×103的濃度加入到96孔板中，在37℃含5％co2潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。細(xì)胞存活率的測(cè)定用mtt法，具體方法如實(shí)施例1。其中美蠊肽a對(duì)a549細(xì)胞半抑制濃度(ic50)由劑量效應(yīng)曲線得到。對(duì)比例3按照對(duì)比例1中方法制備的美洲大蠊水提物。將對(duì)比例3制備得到的美洲大蠊水提物替換實(shí)施例2中的美蠊肽a，進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。對(duì)比例4按照對(duì)比例2中方法制備的美洲大蠊分子量<5kda多肽樣品。將對(duì)比例4制備得到的美洲大蠊分子量<5kda多肽樣品替換實(shí)施例2中的美蠊肽a，進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例2和對(duì)比例1的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。表2美蠊肽a及陽(yáng)性對(duì)照藥物對(duì)a549(人肺癌細(xì)胞)的細(xì)胞毒試驗(yàn)結(jié)果表明，美蠊肽a對(duì)a549(人肺癌細(xì)胞)具有顯著細(xì)胞毒活性。結(jié)論：a549細(xì)胞是測(cè)試化合物對(duì)人肺癌的細(xì)胞毒性的有效工具和評(píng)價(jià)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)表明美蠊肽a對(duì)a549細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒性，與美洲大蠊精提物(對(duì)比例4)相比，半抑制濃度降低了7.75倍，這說(shuō)明本發(fā)明提供的美蠊肽a能夠經(jīng)過(guò)進(jìn)一步發(fā)掘優(yōu)化而發(fā)展成為新的從昆蟲(chóng)中純化得到的具有抗肺癌作用的細(xì)胞毒類(lèi)藥物。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。sequencelisting<110>大理大學(xué)<120>一種具有抗腫瘤或癌癥活性的美蠊肽a及其應(yīng)用<130>2017<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>12<212>prt<213>人工序列<400>1thrvaltyrserargcysglyleuvalglnalalys1510當(dāng)前第1頁(yè)12