本發(fā)明涉及生物樣本處理液,尤其是涉及一種具有樣本保存和滅活功能的拭子洗脫液。
背景技術(shù):
為準(zhǔn)確診斷疾病,采用拭子采集標(biāo)本(微生物、脫落的細(xì)胞或分泌物等),并對(duì)標(biāo)本進(jìn)行保存、培養(yǎng)、分離等進(jìn)一步處理,是臨床醫(yī)學(xué)檢查常用的方法。
核酸樣本dna/rna降解是pcr檢測(cè)中常見問(wèn)題。目前常見的樣品處理液一般為生理鹽水或pbs洗脫液,經(jīng)過(guò)這些洗脫液處理后的核酸樣本保存過(guò)程中,病原體會(huì)破裂,釋放出核酸,但生理鹽水和pbs洗脫液無(wú)法抑制dnase/rnase活性,核酸很容易被降解,從而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。實(shí)際臨床核酸檢測(cè)中,部分標(biāo)本還需要寄送到第三方檢驗(yàn)中心進(jìn)行檢測(cè),運(yùn)輸過(guò)程中需要維持低溫保存冷鏈運(yùn)輸,代價(jià)比較高。因此標(biāo)本的常溫運(yùn)輸保存也是需要解決的問(wèn)題。
檢測(cè)過(guò)程中還會(huì)遇到一些有生物危害性的樣本,比如呼吸道傳播疾病或接觸傳播疾病,這些樣品采集后,醫(yī)護(hù)人員在檢驗(yàn)操作過(guò)程中容易帶來(lái)實(shí)驗(yàn)室暴露感染。所以如何實(shí)現(xiàn)這些有生物危害性的樣本采集后就被滅活,以減少實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)人員感染的風(fēng)險(xiǎn),也是需要解決的問(wèn)題。
中國(guó)發(fā)明專利《一種宮頸脫落細(xì)胞保存液》(cn200810200008.7)公開了一種保存液,包括以下組分及含量(重量):醇類20%-50%;抗聚集試劑15%-50%;緩沖液5%-10%;離子強(qiáng)度維持試劑1%-20%;抗微生物試劑0.01%-0.5%;粘液溶解試劑0.1-5%;清潔劑0-0.5%。該專利的主要功能可使細(xì)胞在體外液體懸浮液環(huán)境中保持細(xì)胞形態(tài)。但是,該保存液對(duì)樣本中的rna樣本無(wú)保存效果;同時(shí),由于細(xì)胞未被滅活,細(xì)胞中的病毒有可能在操作中傳染給檢驗(yàn)操作人員。
在該技術(shù)領(lǐng)域,還有采用trizol保存液的,該保存液可以較好的保存rna樣本,也可通過(guò)加熱滅活病毒,但由于存在有毒揮發(fā)氣體,對(duì)操作者有危害。
除此之外,還有采用rnaseinhibitor酶類來(lái)保存rna樣本,但是成本較貴,其應(yīng)用受限。
綜上所述,開發(fā)一種能夠有效實(shí)現(xiàn)拭子樣本的常溫保存運(yùn)輸,阻止dnase/rnase降解核酸,滅活病原體,并且不影響后續(xù)檢測(cè)的拭子洗脫液,對(duì)拭子樣本的分子生物學(xué)研究和臨床上的應(yīng)用非常重要,也是目前迫切需要解決的重要技術(shù)難題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種具有樣本保存和滅活功能的拭子洗脫液。
為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案:
本發(fā)明所述的具有樣本保存和滅活功能的拭子洗脫液,是由異硫氰酸胍、乙二胺四乙酸、緩沖液、二硫蘇糖醇、表面活性劑、玻璃珠或聚丙烯塑料珠以及去離子水組成,其各組分的含量為:
20%~55%[w/v]異硫氰酸胍,1mm-25mm乙二胺四乙酸,20-100mm緩沖液,二硫蘇糖醇1%-5%[w/v],1%-5%表面活性劑,玻璃珠或聚丙烯塑料珠3-10粒。
所述緩沖液可以為tris緩沖液,也可以為磷酸鹽緩沖系統(tǒng)。
所述表面活性劑為tritonx-100、sds、tween20、tritonx-100、np_40、十二烷基肌氨酸鈉、ctab中任意一種或其中2-3種的組合,濃度為1-5%。優(yōu)選的表面活性劑為tritonx-100。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于該洗脫液具有成本低,性能穩(wěn)定,洗脫后樣本可室溫保存運(yùn)輸,并且具有樣本的滅活作用,可大大降低實(shí)驗(yàn)室暴露感染的風(fēng)險(xiǎn)。
本發(fā)明配制的洗脫液可以保存dna/rna,實(shí)現(xiàn)拭子樣本洗脫和常溫保存運(yùn)輸:采用異硫氰酸胍作為離液劑和強(qiáng)變性劑,用于變性裂解細(xì)胞,具有抑制dnase/rnase活性功能,可用于保存dna和rna不被酶降解;玻璃珠或聚丙烯塑料珠可以通過(guò)物理渦旋撞擊作用,促進(jìn)細(xì)胞從拭子上脫落;乙二胺四乙酸和緩沖液維持了dna/rna的緩沖環(huán)境,維持核酸的穩(wěn)定性。
本發(fā)明配制的洗脫液可以滅活病原體:高濃度20%~55%[w/v]異硫氰酸胍作為離液劑和蛋白強(qiáng)變性劑,用于變性裂解細(xì)胞;二硫蘇糖醇被用于蛋白質(zhì)中二硫鍵的還原,促進(jìn)細(xì)胞破裂;表面活性劑(如tritonx-100)是一種非離子型表面活性劑(或稱去污劑),它能溶解脂質(zhì),以增加抗體對(duì)細(xì)胞膜的通透性,促進(jìn)細(xì)胞破裂,從而滅活病原微生物。
本發(fā)明配制的洗脫液不影響后續(xù)核酸的提?。河捎谙疵撘褐杏玫降漠惲蚯杷犭沂浅R姷暮怂崽崛∮没瘜W(xué)組分,所以不影響后續(xù)核酸提取。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做更加詳細(xì)的說(shuō)明。
實(shí)施例1
1、拭子洗脫液的配制:
取合適體積的燒杯,按照下表1配方稱量試劑并依次加入燒杯,添加去離子水400ml,加熱攪拌溶解,恢復(fù)室溫后,用鹽酸調(diào)節(jié)ph至6.0,補(bǔ)足去離子水至1l,攪拌后,制備得到1l拭子洗脫液。
表1
2、標(biāo)本采集處理:取臨床pcr鑒定甲流陽(yáng)性的患者拭子標(biāo)本,病毒滴度有代表性,高中低(realtimepcr檢測(cè)ct值分別為26、29、32左右)各1例,分別浸入含8ml拭子洗脫液的10ml離心管中;
在渦旋儀上渦旋震蕩5s,丟棄拭子,洗脫物分裝2ml/支;
將洗脫物分別放置于37℃,常溫,4℃,-20℃四個(gè)溫度下進(jìn)行熱穩(wěn)定性考核。
洗脫物37℃條件放置1天,2天,3天,6天,7天,進(jìn)行核酸提取和realtimepcr擴(kuò)增檢測(cè)。對(duì)多天的檢測(cè)ct值進(jìn)行匯總比較,確定樣本是否穩(wěn)定。
洗脫物常溫條件放置1天,2天,3天,6天,7天,進(jìn)行核酸提取和realtimepcr擴(kuò)增檢測(cè)。對(duì)多天的檢測(cè)ct值進(jìn)行匯總比較,確定樣本是否穩(wěn)定。
洗脫物4℃條件放置1周,2周,3周,4周,5周,進(jìn)行核酸提取和realtimepcr擴(kuò)增檢測(cè)。對(duì)多天的檢測(cè)ct值進(jìn)行匯總比較,確定樣本4℃條件放置是否穩(wěn)定。
洗脫物-20℃條件放置1月,2月,3月,6月,7月,進(jìn)行核酸提取和realtimepcr擴(kuò)增檢測(cè)。對(duì)多天的檢測(cè)ct值進(jìn)行匯總比較,確定樣本-20℃條件放置是否穩(wěn)定。
3、樣本提取和realtimepcr檢測(cè):
采用qiagenallprepdna/rnaminikit貨號(hào):80204
甲流realtimepcr檢測(cè)試劑采用自配試劑,熒光定量pcr體系:1*pcrbuffer、2.5mm鎂離子、0.5utaqdna聚合酶、200μmdntp,上、下游引物(seqidno1-2)量均為200nm,檢測(cè)探針fambhq1標(biāo)記(seqidno3)量為100nm。其引物序列見下表2。
表2
實(shí)時(shí)熒光pcr設(shè)備采用安捷倫mx3005p。
結(jié)果分析閾值線:300。
基線:3-15。
4、結(jié)果:
37℃保存7天以內(nèi),樣本無(wú)明顯降解,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見下表3。
表3
注:第一天有異常數(shù)據(jù),剔除。
常溫保存7天以上樣本無(wú)明顯降解,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見下表4。
表4
4℃保存5周以上,樣本無(wú)明顯降解,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見下表5。
表5
-20℃保存半年以上,樣本無(wú)明顯降解,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見下表6。
表6
通過(guò)上述考核,證明本發(fā)明配制的拭子洗脫液可以保存dna/rna,實(shí)現(xiàn)拭子樣本洗脫和常溫的保存。
5、本發(fā)明洗脫液的病毒滅活效果實(shí)驗(yàn):
對(duì)拭子洗脫液進(jìn)行稀釋(稀釋100倍),以去除對(duì)細(xì)胞的抑制效果,取200ul進(jìn)行接種;
采用友康nc0201mdck無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基配合nc0204流感病毒分離無(wú)血清培養(yǎng)基,進(jìn)行毒株活性驗(yàn)證。24h后,均無(wú)細(xì)胞病變,說(shuō)明病毒已滅活。
6、上表3、4、5、6中拭子洗脫物提取和realtimepcr結(jié)果正常,說(shuō)明本發(fā)明配制的洗脫液對(duì)后續(xù)提取和realtimepcr實(shí)驗(yàn)無(wú)影響。
實(shí)施例2
1、拭子洗脫液制備
取合適體積的燒杯,按照下表7配方稱量試劑并依次加入燒杯,添加去離子水400ml,加熱攪拌溶解,恢復(fù)室溫后,用鹽酸調(diào)節(jié)ph至6.0,補(bǔ)足去離子水至1l,攪拌后,即制備得到1l拭子洗脫液。
表7
2、標(biāo)本采集處理:取臨床pcr鑒定支原體陽(yáng)性的患者拭子標(biāo)本,病毒滴度有代表性,高中低(樣本realtime檢測(cè)ct值分別為23、26、30左右)各1例,分別浸入含8ml拭子洗脫液的10ml離心管中;
在渦旋儀上渦旋震蕩5s,丟棄拭子,分裝2ml/支;
將洗脫物分別放置于37℃,常溫,4℃,-20℃進(jìn)行穩(wěn)定性考核。
洗脫物37℃條件放置1天,2天,3天,6天,7天,進(jìn)行核酸提取和realtimepcr擴(kuò)增檢測(cè)。對(duì)多天的檢測(cè)ct值進(jìn)行匯總比較,確定樣本是否穩(wěn)定。
洗脫物常溫條件放置1天,2天,3天,6天,7天,進(jìn)行核酸提取和realtimepcr擴(kuò)增檢測(cè)。對(duì)多天的檢測(cè)ct值進(jìn)行匯總比較,確定樣本是否穩(wěn)定。
洗脫物4℃條件放置1周,2周,3周,4周,5周,進(jìn)行核酸提取和realtimepcr擴(kuò)增檢測(cè)。對(duì)多天的檢測(cè)ct值進(jìn)行匯總比較,確定樣本4℃條件放置是否穩(wěn)定。
洗脫物-20℃條件放置1月,2月,3月,6月,7月,進(jìn)行核酸提取和realtimepcr擴(kuò)增檢測(cè)。對(duì)多天的檢測(cè)ct值進(jìn)行匯總比較,確定樣本-20℃條件放置是否穩(wěn)定。
3、樣本提取和realtimepcr檢測(cè):
采用qiagenallprepdna/rnaminikit貨號(hào):80204
支原體realtimepcr檢測(cè)試劑采用自配試劑,熒光定量pcr體系:1*pcrbuffer、2.5mm鎂離子、0.5utaqdna聚合酶、200μmdntp,上、下游引物(seqidno4-5)量均為200nm,檢測(cè)探針fambhq1標(biāo)記(seqidno6)量為100nm,其引物序列見下表8。
表8
實(shí)時(shí)熒光pcr設(shè)備采用:安捷倫mx3005p
結(jié)果分析閾值線:300。
基線:3-15。
4、結(jié)果
37℃保存7天以上,樣本無(wú)明顯降解,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見下表9。
表9
常溫保存7天以上,樣本無(wú)明顯降解,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見下表10。
表10
4℃保存5周以上,樣本無(wú)明顯降解,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見下表11。
表11
-20℃保存半年以上,樣本無(wú)明顯降解,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見下表12。
表12
5、本發(fā)明洗脫液的病毒滅活效果實(shí)驗(yàn):
對(duì)拭子洗脫液進(jìn)行稀釋(稀釋100倍),以去除對(duì)細(xì)胞的抑制效果,取200ul進(jìn)行接種。
采用鄭州安圖生物工程股份有限公司生產(chǎn)的m0502肺炎支原體培養(yǎng)試劑,進(jìn)行毒株活性驗(yàn)證。48h后,均無(wú)病毒生長(zhǎng),說(shuō)明支原體已滅活。
6、上表9、10、11、12中拭子洗脫物提取和realtimepcr結(jié)果正常,說(shuō)明本發(fā)明配制的洗脫液對(duì)后續(xù)提取和realtimepcr實(shí)驗(yàn)無(wú)影響。