本發(fā)明涉及基因工程技術領域，具體地說，涉及一種利用crispr-cas9技術敲除nrk細胞slc22a2基因的方法。

背景技術：

nrk-52e細胞是大鼠腎小管上皮細胞，很多藥物、毒素的分泌、吸收都在腎小管上皮細胞完成。在腎臟中有很多轉運蛋白在藥物、毒素的分泌、吸收中發(fā)揮著重要作用。有機陽離子轉運蛋白家族(octs)是跨膜蛋白，包括三個亞型1-3，由slc22a1-3編碼，轉運有機陽離子、弱堿和一些中性化合物。人oct1主要在肝臟表達，將血液中的有機陽離子轉運進肝臟，然后再進行生物轉化。oct2主要分布于腎臟和腦部，參與藥物、毒素腎清除和腦轉運。oct3在多種組織中都有表達，例如腎、肝、小腸、腦、骨骼肌、胎盤等，負責中樞神經(jīng)系統(tǒng)中內源物質的轉運。

在該家族成員中，oct2(基因slc22a2)在人腎近端小管細胞基底膜表達豐富，所以有可能他們在近端小管從血液吸收化合物的過程中起重要作用。人oct2和大鼠oct2均位于腎近端小管基底膜，參與許多化合物腎排泄和腎重吸收。人oct2轉運四乙胺、1-甲基-4-苯基吡啶、4-[4-(二甲氨基)苯乙烯基]-n-甲基吡啶、n-甲基煙酰胺、氨基胍。oct2還轉運神經(jīng)遞質，例如乙酰膽堿、多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素、5-羥色胺、組胺、膽堿。人oct2也轉運黃曲霉毒素b1、百草枯、溴化乙錠。一些蛋白參與了oct2的轉錄后調控，如蛋白激酶c(pkc)、蛋白激酶a(pka)、磷脂酰肌醇-3激酶(pi3k)、鈣調蛋白。oct2介導許多藥物腎外排的第一步，以及膽堿或其他有機陽離子底物在近端小管重吸收的第二步。人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的oct2能將藥物轉運通過血腦屏障，例如抗帕金森的藥物。在急性和慢性腎損傷中，腎oct2蛋白表達下降，會導致oct2底物的藥代動力學和腎毒性的改變。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種利用crispr-cas9技術敲除nrk細胞slc22a2基因的方法。

本發(fā)明的另一目的是提供利用上述方法制備的slc22a2基因敲除的nrk細胞系及以其作為細胞模型在研究oct2蛋白的轉運功能中的應用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種slc22a2基因打靶載體，所述打靶載體是基于crispr/cas9系統(tǒng)的grna表達載體，grna作用位點位于大鼠slc22a2基因的2號外顯子上，grna作用位點的dna序列為5′-tttcagtcagtagtgaacgt-3′(seqidno:1)。

用于構建所述表達載體的出發(fā)載體為px458。

所述表達載體其是將grna作用位點的dna序列5′端加上bbsi酶切位點序列，并人工合成其互補序列，將兩條互補序列形成的雙鏈dna，與經(jīng)過bbsi酶切的px458載體連接，構建得到的。

本發(fā)明還提供所述打靶載體在制備slc22a2基因敲除的nrk細胞系中的應用。

本發(fā)明還提供一種利用crispr-cas9技術敲除nrk細胞slc22a2基因的方法，其是根據(jù)大鼠slc22a2基因序列，構建基于crisper-cas9系統(tǒng)的grna表達載體，以此作為slc22a2基因打靶載體，轉入nrk細胞中，獲得slc22a2基因敲除的nrk細胞。

其中，grna作用位點位于大鼠slc22a2基因的2號外顯子上，grna作用位點的dna序列為5′-tttcagtcagtagtgaacgt-3′。

本發(fā)明還提供利用上述方法制備的slc22a2基因敲除的nrk細胞系。利用打靶載體轉染nrk細胞，獲得的中靶陽性細胞克隆，即為slc22a2基因敲除的nrk細胞系。

用于鑒定中靶陽性細胞克隆的特異性pcr引物(seqidno:2-3)包括：

slc22a2-f：5’-aaatgccagactcacaccgt-3’

slc22a2-r：5’-tgtgcgttcagggtgaagaa-3’

本發(fā)明所述nrk細胞為nrk-52e。

本發(fā)明進一步提供所述nrk細胞系在研究oct2蛋白的轉運功能(尤其對藥物、毒素以及其他小分子物質的轉運)中的應用。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

(一)利用crispr/cas9系統(tǒng)首次從nrk-52e細胞中敲除slc22a2基因，簡便、快速，可作為理想的細胞模型，模擬人體腎臟環(huán)境中oct2蛋白的缺失。

(二)基于crispr/cas9系統(tǒng)敲除基因slc22a2的方法，與沉默、干擾、敲低等手段相比，能夠更有效地敲除oct2蛋白，利于研究oct2蛋白的轉運功能。

(三)從基因、蛋白水平兩方面檢測都發(fā)現(xiàn)oct2蛋白被敲除，說明oct2蛋白序列已被徹底改變，可能造成oct2功能的徹底喪失，是較為理想的oct2敲除的細胞模型。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中px458質粒與目的片段連接后的pcr擴增結果。其中，泳道1-3均為px458質粒與目的片段連接后轉化大腸桿菌，挑取單克隆，培養(yǎng)后進行菌液pcr的擴增結果。

圖2為本發(fā)明實施例1中大提質粒px458-slc22a2電泳圖。

圖3為本發(fā)明實施例1中轉染細胞挑選單克隆鑒定結果。其中，a為不同克隆細胞基因組提取結果，b為不同克隆細胞的基因組pcr擴增結果，c為菌落pcr結果。

圖4為本發(fā)明實施例1中利用westernblot檢測oct2蛋白的結果。

圖5為本發(fā)明實施例2中cck-8法測定slc22a2基因敲除細胞活力的結果。

圖6為本發(fā)明實施例3中野生型細胞與slc22a2基因敲除型細胞在細胞凋亡中的差異比較結果。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如sambrook等分子克隆實驗手冊(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

實施例1利用crispr-cas9技術敲除nrk細胞slc22a2基因的方法

1、實驗材料

真核表達載體pspcas9(bb)-2a-gfp(px458)。

大鼠nrk-52e細胞，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

2、crispr/cas9打靶載體的構建

(1)靶序列確定

根據(jù)網(wǎng)站http://genome.ucsc.edu獲取大鼠slc22a2基因的外顯子信息，選擇第2外顯子作為靶標設計的區(qū)域。然后根據(jù)網(wǎng)站http://crispr.mit.edu設計guidesequence：5’-tttcagtcagtagtgaacgt-3’，在其5’端加上bbsi酶切位點序列，并合成與其互補的序列(seqidno:4-5)：

guidesequence:5’-caccgtttcagtcagtagtgaacgt-3’

complementarysequence:3’-caaagtcagtcatcacttgcacaaa-5’

(2)靶序列與px458質粒連接

①px458空載體酶切，20μl反應體系見表1，37℃酶切過夜。

表1px458空質粒酶切體系

②px458酶切產(chǎn)物的回收純化

根據(jù)天根生化普通瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒說明書進行。

③合成的guidesequence和complementarysequence形成雙鏈dna，10μl反應體系見表2，反應程序：37℃，30min；95℃5min，自然降至室溫。

表2合成片段形成雙鏈體系

④將形成雙鏈的目的片段稀釋250倍后與載體px458連接，得到重組載體px458-slc22a2。10μl反應體系見表3，反應程序：室溫連接3h。

表3連接體系

(3)轉化大腸桿菌dh5α，挑取單克隆pcr鑒定

將連接產(chǎn)物加入100μle.coli感受態(tài)細胞dh5α，混勻后冰浴30min，然后進行轉化，42℃熱激90s，冰浴2min，加入900μl37℃預溫好的無菌lb培養(yǎng)基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％氯化鈉)，37℃、200g下振蕩培養(yǎng)1h，取100μl菌液涂布lb培養(yǎng)基瓊脂平板(每100mllb瓊脂培養(yǎng)基中含100μl濃度為100mg/ml的氨芐青霉素、200μl濃度為20mg/ml的x-gal溶液)，37℃倒置培養(yǎng)16h左右。挑取白色克隆菌落，在1mllb培養(yǎng)基(含0.1mg/ml氨芐青霉素)中培養(yǎng)，進行菌液pcr，測序。pcr引物：f：5’-tggactatcatatgcttaccgtaac-3’，r：5’-aaacacgttcactactgactgaaa-3’。

pcr擴增片段大小為105bp，見圖1，說明目的片段與px458載體連接成功。篩選出正確序列質粒進行下一步實驗。

3、質粒的制備與鑒定

上一步經(jīng)過pcr鑒定選擇符合預期的克隆，用天根生化大提試劑盒大量制備無內毒素的質粒px458-slc22a2，測定其濃度和純度。提取步驟依照說明書進行。在1％瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察跑膠結果(圖2)。

4、slc22a2基因敲除細胞系的構建

(1)細胞轉染

待nrk-52e細胞長至60％～80％匯合度時，轉染前l(fā)h，給細胞換液。

轉染步驟如下：

①配制細胞轉染液：取一個1.5ml無菌ep管，先加入320μldmem，然后按8μg/6cm皿量加入大提好的質粒px458-slc22a2，輕柔混勻，但要盡量保證充分。

②一般按照質?！胔tf為1∶3(w/v)的比例加入相應體積的htf(細胞轉染試劑)，輕柔混勻并保證充分，室溫靜置20min。

③轉染4～6h后，給細胞換液。

④培養(yǎng)48h后，使用分選型流式細胞儀篩選出有egfp標記的細胞，分單個細胞在96孔板中培養(yǎng)。

⑤待單克隆細胞數(shù)量足夠多時分別提取dna鑒定。

(2)細胞基因組提取

配制細胞裂解液ph8.0，見表4。

表4細胞裂解液

①細胞消化后，離心棄上清，加600μl裂解液(3.5cm皿)，加入4μl蛋白酶k，65℃孵育20min。

②12000g離心5min取上清，加入2倍體積的異丙醇，倒轉混勻后，可以看見絲狀物。

③12000g離心10min，棄上清，加1ml70％乙醇洗沉淀。

④12000g離心10min，棄上清，徹底晾干后，加ddh2o溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將構建成功的質粒轉染nrk-52e細胞，轉染48h后利用分選型流式細胞儀篩選出轉染成功的細胞，在96孔板里單細胞培養(yǎng)。待單克隆細胞數(shù)量足夠多時分別提取dna，圖3a展示了其中8個細胞克隆a1、a10、b5、b13、c2、c5、c10和c16的dna提取結果。

(3)pcr鑒定

在slc22a2基因上，以包含靶序列的517bp片段為目的片段，設計引物slc22a2-f和slc22a2-r，序列如下：

slc22a2-f：5’-aaatgccagactcacaccgt-3’

slc22a2-r：5’-tgtgcgttcagggtgaagaa-3’

pcr反應條件：95℃預變性5min；30個循環(huán)：95℃變性30s，58℃退火60s，72℃延伸60s；最后72℃終延伸7min。pcr反應體系見表5。pcr產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖3b)。

表5pcr擴增體系

其中6個細胞克隆的pcr擴增片段大小符合預期517bp，將a1、b13、c2、c5、c10、c16的pcr產(chǎn)物回收純化。

(4)pcr產(chǎn)物回收純化

根據(jù)天根生化普通瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒說明書進行。

(5)回收片段與t-vectorpmdtm19的連接與轉化

將pcr產(chǎn)物回收純化后的片段與t載體連接，連接體系見表6。載體連接條件為16℃過夜。

表6t載體連接反應體系

(6)轉化大腸桿菌dh5α，挑取單克隆pcr鑒定

連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌dh5α，參見前述轉化操作步驟。每個平板挑取20個白色克隆菌落，進行菌落pcr。引物使用t載體通用引物：

m13f(-47)5’-cgccagggttttcccagtcacgac-3’

m13r(-48)5’-agcggataacaatttcacacagga-3’

pcr反應條件：95℃預變性5min；30個循環(huán)：95℃變性30s，58℃退火60s，72℃延伸60s；最后72℃終延伸7min。pcr反應體系見表7。pcr擴增產(chǎn)物大小為673bp，用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表7pcr擴增體系

pcr膠回收產(chǎn)物連接t載體后，轉化大腸桿菌dh5α，挑取白色克隆菌落，進行菌落pcr，選取c16號部分結果展示見圖3c。

(7)測序比對

將pcr產(chǎn)物測序，測序結果與原始pcr序列比對，確定具體突變位置以及突變序列。經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)只有c16號細胞克隆的pcr產(chǎn)物測序結果顯示全部突變，類型為增加一個堿基c，下劃線處堿基為新增加的堿基，該堿基的增加導致slc22a2基因表達移碼突變。加粗字體是slc22a2基因部分序列，斜體為t載體上的部分序列。

cgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattagaactcggtacgcgcggatcttccagagattaaatgccagactcacaccgtcagatggaatgctaaatgctaatggatttccaggggaaatctggcaatgtatagaaatttagcatgggttacggtgcagctggactattggcactccgttcaagaaatattcgagtaagtaccacacagtaatcacctgaaccgtctgtgctcccaggaactcccagttagaaatactcagagaactatgatatgaatagatctaaggagatgctaataacattttctccctctctgccctcccccactctcttcccctcccccggcttggacggcaccgcatatttggacagtttaacctggtgtgtgctcactcctggatgctggacctgtttcagtcagtagtgaaccgtggggtttttcatcggtgctatgatgattggctacctagcggacaggtaggtgaaacaactgtggggctttaaaaataacccacaggttcagacagtactcgggctcacccaccctgcccgaatccttcttcaccctgaacgcacaatcgtcgaacggcaggcgtgcaaacttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgct

(8)westernblot驗證

在基因水平驗證突變細胞株后，用westernblot進一步驗證c16號細胞株是否敲除oct2蛋白，結果見圖4，未檢測到oct2蛋白。

通過以上dna水平以及蛋白水平的驗證，證明slc22a2基因敲除的nrk-52e細胞系構建成功。然后使用ko代表c16號slc22a2基因敲除的細胞株。

實施例2cck-8法測定敲除細胞活力

使用敲除型細胞株ko，用10μm、20μm、50μmota以及1000μmtea(oct抑制劑)處理細胞24h，檢測細胞活力。

1.用胰酶消化收集對數(shù)生長期的細胞，加入適量完全培養(yǎng)基吹打成單細胞。在96孔培養(yǎng)板中每孔接種約8000個細胞，每孔添加培養(yǎng)液100μl，空白孔不加細胞，為防止液體揮發(fā)影響細胞生長，在96孔板最外側一圈添加200μlpbs。

2.將96孔板放入37℃、5％co2及95％飽和大氣濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24h后待細胞長到約70％棄去培養(yǎng)液，每孔加入含有不同濃度(0～50μm)ota的完全培養(yǎng)基，對照組(有細胞、無ota)和空白組(無細胞、無ota)加入同等體積的完全培養(yǎng)基，每個處理組設置6個復孔，培養(yǎng)箱孵育24h。

3.每孔加10μlcck8工作液，在37℃培養(yǎng)箱中放置1h。用酶標儀在450nm處測定吸光值。

4.待確定ota的處理濃度后，用胰酶消化收集對數(shù)生長期的細胞，加入適量完全培養(yǎng)基吹打成單細胞。每孔接種8000個細胞，每孔添加培養(yǎng)液100μl，空白孔不加細胞，為防止液體揮發(fā)影響細胞生長，在96孔板最外側一圈添加200μlpbs。

5.將96孔板放入37℃、5％co2及95％飽和大氣濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24h后待細胞長到約70％，棄去培養(yǎng)液，用含有oct的抑制劑tea(tetraethylammoniumchloride)(0～100μm)的完全培養(yǎng)基預處理細胞15min，每孔細胞懸液體積100ul，然后棄去tea，再用含有ota和tea的完全培養(yǎng)基共同處理細胞24h。

6.每孔加入10μlcck-8工作液，37℃孵育1h。用酶標儀在450nm處測定吸光值。

ota處理24h對敲除細胞的細胞活力產(chǎn)生影響(圖5)，ota劑量為10μm、20μm、50μm時，細胞活力均顯著降低。在ota處理的同時添加tea，發(fā)現(xiàn)細胞活力與單獨ota處理無顯著變化。該結果表明敲除oct2蛋白后，再使用oct家族的抑制劑，對于細胞存活無顯著緩解作用，說明oct1，oct3并不在ota影響細胞存活中起主要作用。

實施例3ota對敲除細胞凋亡的影響

用50μmota處理野生型細胞與敲除型細胞ko24h，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1)將細胞以10⁵個/孔的密度傳代于6孔板中，生長約24h待細胞覆蓋底面積約70％時用ota處理(0、20μm、50μm)或ota與tea共處理。

2)處理24h后，棄處理液，用pbs沖洗兩遍后用不含edta的胰酶消化收集細胞。

3)用pbs洗滌細胞2次，以2000g離心5min，收集細胞沉淀。

4)加500μl的bindingbuffer懸浮細胞，2000g離心5min，收集細胞沉淀。

5)加500μl的bindingbuffer懸浮細胞，加5μlfitc混合均勻后，加5μlpi混勻，放置10min。

6)流式細胞儀上機檢測，重復三次，收集數(shù)據(jù)和圖像。

為了探究ota誘導的細胞凋亡是否在oct2敲除后發(fā)生了變化，本實驗用50μmota處理細胞24h，比較野生型細胞與敲除型細胞ko在細胞凋亡中的差異。結果見圖6，50μmota處理細胞24h，野生型細胞的凋亡率由9％增加到40％(p<0.05)；敲除型細胞ko的凋亡率由10％增加到14％，無顯著增加；在50μmota處理24h后，敲除型細胞ko的凋亡率顯著低于野生型細胞。說明oct2敲除緩解了ota引發(fā)的nrk-52e細胞凋亡。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之做一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

序列表

<110>中國農業(yè)大學

<120>利用crispr-cas9技術敲除nrk細胞slc22a2基因的方法

<130>khp171113745.0

<160>5

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

tttcagtcagtagtgaacgt20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

aaatgccagactcacaccgt20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tgtgcgttcagggtgaagaa20

<210>4

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

caccgtttcagtcagtagtgaacgt25

<210>5

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

caaagtcagtcatcacttgcacaaa25